基于UHPLC-QTOFMS的黄芩汤化学成分和大鼠入血成分分析.pdf

第42 卷 第 8 期2023 年8 月Vol.42 No.8960967分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）基于UHPLCQTOF MS的黄芩汤化学成分和大鼠入血成分分析孙卓然，贾丹，陈啸飞*，柴逸峰*（海军军医大学 药学院，上海 200433）摘要：建立了一种超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UHPLCQTOF MS）联用鉴定黄芩汤化学成分及大鼠灌胃给药后入血成分的方法。采用ACQUITY UPLC XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm 100 mm，2.5 m），以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱；使用电喷雾离子源正负离子模式采集碎片信息。依据质谱裂解规律，结合对照品、文库比对分析，初步鉴定了黄芩汤中68种化学成分和35种入血成分，并讨论了黄芩素、黄芩苷、芍药苷、甘草苷等的治疗潜力。该方法高效、稳定、灵敏，可为黄芩汤的药效物质基础研究提供参考，也可用于其他复方的成分分析，有助于提升传统中药中小分子药物发现的效率。关键词：黄芩汤；超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UHPLCQTOF MS）；化学成分；体内暴露组分中图分类号：O657.63；R914.1 文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）08-0960-08Identification on Components of Huangqin Tang and Rats Blood Components after Administration Based on UHPLCQTOF MS AnalysisSUN Zhuo-ran，JIA Dan，CHEN Xiao-fei*，CHAI Yi-feng*（School of Pharmacy，Naval Medical University，Shanghai 200433，China）Abstract：An ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry（UHPLCQTOF MS）was established to identify the chemical components of Huangqin Tang and the blood components after intragastric administration in rats in this paperThe gradient elution was performed on an ACQUITY UPLC XBridge BEH C18 column（2.1 mm 100 mm，2.5 m）using 0.1%formic acid solution and 0.1%formic acid acetonitrile as mobile phasesPositive and negative ion ESI modes were used simultaneously to collect fragment informationsA total of 68 chemical constituents and 35 blood components in Huangqin Tang were tentatively identified by deducing the mass spectrometric cleavage pattern，and comparing with standards and libraryThe therapeutic potential of baicalein，baicalin，paeoniflorin，liquiritin，etc.was also discussedThe method is efficient，stable and sensitive，and it provides a reference for investigation on the pharmacodynamic material basis of Huangqin Tang，and it can also be used in the component analysis for other compounds to improve the efficiency of small molecule drug discovery in traditional Chinese medicine.Key words：Huangqin Tang；ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry（UHPLCQTOF MS）；chemical constituents；exposed components in vivo黄芩汤出自张仲景的伤寒论，由黄芩、芍药、甘草、大枣组成，是一个防治痢疾的经典复方药物1。现代药理研究报道其具有抑菌、抗炎、退热、镇痛、镇静等作用24。目前，黄芩汤在临床上不仅用于治疗肠炎、痢疾和小儿腹泻56，还被用于治疗以腹痛和腹泻为症状的感冒1。研究发现，黄芩汤及其组分在消化系统的肿瘤治疗中具有延缓肿瘤进展、减轻化疗药物胃肠道毒性等功效710。据此，黄芩汤的提取衍生物PHY906作为一种有潜力的草药制剂被纳入美国的补充和替代医学的评估中11。耶鲁大学的郑永齐团队从本世纪初至今深度探索了PHY906作为癌症化疗和靶向doi：10.19969/j.fxcsxb.23052301收稿日期：20230523；修回日期：20230612基金项目：国家自然科学基金项目（82073814，82122066，81973291）通讯作者：陈啸飞，副教授，博士生导师，研究方向：药物靶标相互作用分析，E-mail：柴逸峰，教授，博士生导师，研究方向：药物活性分析，E-mail：第 8 期孙卓然等：基于UHPLCQTOF MS的黄芩汤化学成分和大鼠入血成分分析治疗辅助药物的潜力12。当前黄芩汤的研究主要集中在临床应用方面，其化学成分和药理作用研究相对较少2。PHY906的相关研究较多，但其研发、制备、表征和质量控制方法较为独特，与传统的黄芩汤中药复方存在区别12，参考性不强。因此有必要全面鉴定黄芩汤的有效化学成分，为其药效物质基础规律和相关药理机制研究提供参考。本研究建立了一种高效、稳定、灵敏分析黄芩汤化学成分及大鼠灌胃给药后入血成分的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UHPLCQTOF MS）联用法，可为其药效物质基础研究提供依据。1 实验部分 1.1仪器、试剂与实验动物1.1.1仪器BP121S 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；200克摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；X1R230 V台式离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；EYELA MGS2200氮气吹扫浓缩装置（日本东京理化公司）；Eppendorf移液器（德国艾本德公司）；Agilent 1290 超高效液相色谱仪、Agilent 6538 四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）；ACQUITY UPLC XBridge BEH C18色谱柱（2.1 mm 100 mm，2.5 m，美国沃特世公司）。1.1.2试剂95%乙醇（化学纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸（质谱纯）、乙腈（质谱纯）、二甲基砜（GC纯度 99.5%）、0.22 m水相滤膜（德国Merck集团）；中药饮片：黄芩、蜜炙甘草、蜜麸炒白芍（上海国大中达大药房）；中药饮片：大枣（上海雷允上安波药房）；黄芩素（HPLC纯度 98%）、芹菜素（HPLC纯度 98%）购自上海赤芍生物科技有限公司；千层纸素A（HPLC纯度 98%）购自成都普菲德生物技术有限公司；水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水由MilliQ A10超纯水处理系统（美国密理博公司）制备。1.1.3实验动物雄性SD大鼠，体质量（193 7）g，购自杭州医学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK（浙）20190002。所有动物实验均在海军军医大学实验动物中心（上海）按照国家有关法规、地方指导原则以及海军军医大学伦理委员会要求进行。1.2黄芩汤提取液制备1.2.1煎煮将黄芩单独打粉，白芍、甘草、大枣按质量等比例混合打粉。称取黄芩粉末约32 g，白芍、甘草、大枣混合粉末64 g。将白芍、甘草、大枣混合粉末以1 L超纯水于锅内浸泡30 min，加入黄芩粉末武火煮沸后改为文火保持微沸 1 h，用纱布过滤并收集药液。药渣按前述方法煎煮，共煎煮3次。1.2.2除糖在搅拌的同时向药液中缓慢加入2倍体积的95%乙醇，于防爆冰箱中4 静置过夜。用三层滤纸将药液减压抽滤为澄清液体后，使用旋转蒸发器将其浓缩，得到45 mL黄芩汤提取液（约2 g/mL）备用。1.3动物给药与血清样品处理大鼠饲养于海军军医大学动物房，12 h明暗交替，环境温度为（18 2），全程自由饮水进食。适应性饲养24 h后，随机分为空白组和给药组，给药组灌胃黄芩汤提取液20 g/kg，对照组给予相同体积的生理盐水，每天早晚各给药1次，连续给药3 d。最后1次给药后2 h内，腹腔注射10%水合氯醛将大鼠麻醉（0.3 mL/100 g），腹腔主动脉取血，静置2 h以上。全血以4 000 r/min离心10 min取上清液，56 水浴中灭活30 min，-80 保存备用。1.4前处理1.4.1体外样品前处理取适量黄芩汤提取储备液用去离子水稀释1倍，取400 L过0.22 m水相滤膜后进样分析。1.4.2生物样品前处理将4倍体积的乙腈加入自然融化的血清中剧烈涡旋3 min，冰上孵育10 min，10 465 r/min 4 离心10 min以沉淀蛋白质。取上清液氮气吹干，用原血清体积1/5的去离子水复溶后进样分析。1.5色谱与质谱条件1.5.1色谱条件采用Agilent 1290超高效液相色谱仪，色谱柱为ACQUITY UPLC XBridge BEH C18柱961第 42 卷分析测试学报（2.1 mm 100 mm，2.5 m），柱温为40，进样量为4 L，流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。梯度洗脱：0 21 min，10%40%B；21 28 min，40%70%B；28 30 min，70%B。分析时间为30 min，流速为0.4 mL/min。1.5.2质谱条件采用Agilent 6538四极杆飞行时间质谱仪，电喷雾离子源；质谱扫描范围：m/z 501 500；干燥气温度为 350；干燥气流速为 11 L/min；雾化气压力为 310.275 kPa；毛细管电压为4 000 V；碎片电压为120 V；锥形取样孔和锥形分离器之间的电压为60 V；正离子模式参比离子m/z分别为121.050 9和922.009 8；负离子模式参比离子m/z分别为119.036 3和1 033.988 1。1.6黄芩汤中化学成分数据库的建立黄芩汤复方由黄芩、芍药、甘草、大枣四味中药材组成。通过搜索中国知网、万方数据、PubMed等网站的相关文献，检索上海有机化学研究所的化学专业数据库、计算系统生物学实验室（TCMSP）、本草组鉴（HERB）建立黄芩汤化学成分数据库，相关信息包括化合物的中英文名称、分子式、CAS号和部分结构式。1.7数据采集与处理通过QTOF MS采集黄芩汤体外、体内化学成分的精确分子信息，数据导入质谱分析软件Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00进行计算处理，利用精确分子量匹配和碎片离子归属策略，比对化学成分数据库中770个潜在物质组分，对每个计算得到的分子组成进行匹配。同时参考峰物质特征的同位素分布，辅以ACD/ChemSketch软件对油水分配系数logP值的预测计算，并对比前期文献，以提高化学成分鉴定的准确性。对于体内样品的鉴定，前期文献报道中各中药组成的代谢物也被纳入考察范围。2 结果与讨论 2.1黄芩汤体外成分分析在前述色谱、质谱条件下，分别在正、负离子模式下对黄芩汤提取液扫描并获取UPLCQTOF MS总离子流图（图1），其中正离子模式下鉴定出50种化合物，负离子模式下鉴定出33种化合物，两者相互对照最终鉴定出68种化合物（表1）。使用黄芩素、芹菜素、千层纸素A的标准品，确定了对应物质在黄芩汤总离子流图中的出峰位置，区分了同分异构体。其他化合物参考前期文献，依照化合物准分子离子峰的相对出峰位置进行鉴定。经文献调研，发现不同研究对于部分化合物的鉴定存在矛盾，例如文献1314中色谱条件均使用C18反相色谱柱，均采用有机相比例逐渐增大的线性洗脱梯度，但千层纸素A-7-葡萄糖醛酸和汉黄芩苷同分异构体在两个研究中的出峰顺序相反。本研究对于此种情况使用ACD/ChemSketch软件辅助鉴定。经软件计算，千层纸素A-7-葡萄糖醛酸和汉黄芩苷的油水分配系数logP值分别为（3.37+/-0.97）和（-0.65+/-0.60），故判定汉黄芩苷比千层纸素A-7-葡萄糖醛酸先出峰。2.2黄芩汤体内成分分析相较于血清中其他成分，一般临床剂量下黄芩汤中大多数活性化合物及其代谢物的浓度太低，难以发现和鉴别15。本文采用UPLCQTOF MS技术对黄芩汤在大鼠血清中的组分进行了分析，共鉴定出33个物质组分以原型暴露于大鼠体内，以及2个提取液中未出现的代谢产物。这些化合物单体具有作为小分子单独成药的潜力，在后续研究中将重点对其进行活性筛选和药效验证。黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素-6-O-D-葡萄糖醛酸苷和千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷等是黄芩汤中的主要化合物，具有抗氧化作用。葡萄糖醛酸化是生物体内重要的代谢过程，由于黄芩素有3个羟基，故血清中存在3种葡萄糖醛酸化产物，分别为7位取代的黄芩苷、黄芩素-5-O-D-葡萄糖醛酸苷和黄芩素-6-O-D-葡萄糖醛酸苷15。本研究还在血清中检测到归属于黄芩的化合物 5-（2-Hydroxyethyl）-2-methoxyphenol（C9H12O3），其代谢过程需进一步研究。芍药苷是芍药的标志性成分之一，具有抗炎和免疫调节活性16。本研究在血清中检测到芍药苷在肠道菌群作用下的代谢产物Paeonimetablin （C10H16O4）17。甘草苷和甘草次酸等甘草中的标志化合物也在体内样品中被检测到。962第 8 期孙卓然等：基于UHPLCQTOF MS的黄芩汤化学成分和大鼠入血成分分析表1黄芩汤提取液化学成分的鉴定结果Table 1Results of the chemical components of Huangqin Tang extract12345678910111213141516170.5930.6190.7170.8830.9911.1231.6531.6941.8261.9262.2482.5713.1673.2003.3993.8534.4255.054Glucuronic acid（葡萄糖醛酸）/galacturonan（聚半乳糖醛酸）Glucose（葡萄糖）（）-Malic acid（DL-苹果酸）Gallic acid（没食子酸）Fructose（果糖）Pyrogallol（邻苯三酚）Glyinflanin D（胀果甘草宁D）Paeoniflorin sulfonate（芍药苷亚硫酸酯）Paeonol（牡丹酚）/phloretic acid（根皮酸）Catechin（儿茶素）/ent-epicatechin（表儿茶素）Glucoliquiritin（葡萄糖基甘草苷）/naringin（柚皮苷）Coclaurine（衡州乌药碱）Albiflorin（白芍苷）3，5，7，2，6-Pentahydroxyflavanone（3，5，7，2，6-五羟基黄烷酮）Schaftoside（夏弗塔雪轮苷）Violanthin（三色堇黄酮苷）/isoviolanthin（异三色堇黄酮苷）Liquiritin（甘草苷）C6H10O7C6H12O6C4H6O5C7H6O5C6H12O6C6H6O3C25H24O5C23H28O13SC9H10O3C15H14O6C27H32O14C17H19NO3C23H28O11C15H12O7C26H28O14C27H30O14C21H22O9MH-M+K+MH-MH-M+K+M+H+MH-M+Na+MH-M+H+M+NH4+M+H+MH-M+H+MH-M+H+MH-MH-193.036 7219.024 9133.015 6169.014 8219.026 0127.039 0403.165 2567.114 3165.055 6291.086 1598.213 1286.142 3479.149 3481.169 9303.045 7565.154 6577.141 2417.108 5194.042 7180.063 4134.021 5170.021 5180.063 4126.031 7404.162 4544.125 1166.063 0290.079 0580.179 2285.136 5480.163 2304.058 3564.147 9578.163 6418.126 46.55-4.48-10.082.607.28-0.56-25.006.88-0.771.401.23-4.4913.700.21-17.93-0.2426.0725.43G/ZZZPZPGPP/GP，Z/SGZPSGGG+-+-+-+No.tR/minCompoundFormulaAdductm/zMWError/ppmHerbal sourceIn vivo图1黄芩汤提取液在正（A）、负（B）离子模式下的基峰色谱图Fig.1Base peak chromatograms of Huangqin Tang extract in the positive（A）and negative（B）ion modesthe numbers denoted were the same as those in Table 1963第 42 卷分析测试学报1819202122232425262728293031323334353637383940414243444546474849505.2595.3585.2785.7726.0706.4426.6166.9087.0467.9188.0478.1798.4408.5849.0199.1309.4009.56810.24710.68510.87510.99111.42111.48511.70212.09112.21412.28112.51313.42314.05914.07614.28314.51514.53915.60715.60716.87217.26917.29617.54417.559Chrysin-6-C-L-arabinoside-8-C-D-glucoside（白杨素-6-C-L-阿拉伯糖苷-8-C-D-葡萄糖苷）Liquiritin apioside（芹糖甘草苷）Viscidulin-2-O-D-glucopyranoside（粘毛黄芩素-2-O-D-吡喃葡萄糖苷）Chrysin-6-C-glucoside-8-C-L-arabinoside（白杨素-6-C-葡萄糖苷-8-C-L-阿拉伯糖苷）Isomer of 18（白杨素-6-C-L-阿拉伯糖苷-8-C-D-葡萄糖苷的同分异构体）Isomer of 18（白杨素-6-C-L-阿拉伯糖苷-8-C-D-葡萄糖苷的同分异构体）Sophoraflavone B（广豆根黄酮苷B）Paeoniflorin（芍药苷）Hydroxyl oroxylin A 7-O-glucuronide（羟基千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷）/hydroxyl wogonoside（羟基汉黄芩苷）PCG（环磷鸟苷）Viscidulin （粘毛黄芩素）Isoliquiritin（异甘草苷）Ononin（芒柄花苷）Baicalin（黄芩苷）5，6，7-Trihydroxyl flavanone-7-O-glucuronide（5，6，7-三羟基黄烷酮-7-O-葡萄糖醛酸苷）7-Hydroxy-2-methoxyflavanone-7-O-glucuronide（7-羟基-2-甲氧基黄烷酮-7-O-葡萄糖醛酸苷）Isomer of 31（黄芩苷的同分异构体）Isomer of 26（羟基汉黄芩苷的同分异构体）Wogonoside（汉黄芩苷）Isomer of 26（羟基汉黄芩苷的同分异构体）Isomer of 31（黄芩苷的同分异构体）Oroxylin A-7-O-glucuronide（千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷）Isomer of 36（汉黄芩苷的同分异构体）Apigenin（芹菜素）CMP（环磷腺苷）4-Hydroxywogonin（4-羟基汉黄芩素）Baicalein（黄芩素）Licorice-saponin A3（甘草皂苷A3）Licorice-saponin G2（甘草皂苷G2）Glabrolide（光果甘草内酯）/isoglabrolide（异光果甘草内酯）/glyyunnansapogenin C（云南甘草皂苷元C）22-Acetoxyl licorice saponin J2（乌拉尔甘草皂苷F）Licorice-saponin E2（甘草皂苷E2）Isomer of 46（甘草皂苷G2的同分异构体）C26H28O13C26H30O13C23H24O13C26H28O13C26H28O13C26H28O13C21H20O9C23H28O11C22H20O12C10H12N5O7PC17H14O8C21H22O9C22H22O9C21H18O11C21H20O11C21H20O11C21H18O11C22H20O12C22H20O11C22H20O12C21H18O11C22H20O11C22H20O11C15H10O5C10H12N5O6PC16H12O6C15H10O5C48H72O21C42H62O17C30H44O4C44H66O18C42H60O16C42H62O17M+H+M+K+MH-M+H+M+H+M+H+M+H+MH-M+H+MH-M+H+M+H+M-M+H+MH-M+H+MH-M+H+M+Na+M+M+H+M+H+M+H+MH-M+H+M+H+MH-M+H+M+H+M+H+MH-M+H+MH-M+H+MH-MH-M+H+M+H+M+H+MH-MH-M+H+549.159 6589.134 0507.101 3509.129 5549.160 0549.159 9549.159 9415.106 6417.118 4479.139 3481.170 4477.102 2345.050 0347.075 2417.115 4431.133 1445.062 6447.091 6471.089 6448.103 0447.091 5477.102 3461.106 7459.079 6477.102 0447.092 2459.077 4461.107 9461.106 7271.059 2329.052 6301.069 5269.046 0271.058 6983.449 5837.397 1469.331 7883.431 6821.394 2819.343 8837.394 2839.406 6548.153 0550.168 6508.121 7548.153 0548.153 0548.153 0416.110 7480.163 2476.095 5345.047 4346.068 9418.126 4430.126 4446.084 9448.100 6448.100 6446.084 9476.095 5460.100 6476.095 5446.084 9460.100 6460.100 6270.052 8329.052 5300.063 4270.052 8984.456 6838.398 7468.324 0882.424 9820.388 1838.398 70.23-7.6925.941.190.380.200.166.301.1934.530.240.216.01-2.48-9.81-1.80-31.03-0.35-1.036.49-0.66-0.55-1.47-25.17-1.380.46-30.340.84-1.40-2.85-1.81-3.091.87-4.021.846.400.55-0.915.3045.242.951.29SGSSSSGPSZSGGSSSSSSSSSSSZSSGGGGGG+-+-+-+-+-+-+-（续表1）No.tR/minCompoundFormulaAdductm/zMWError/ppmHerbal sourceIn vivo964第 8 期孙卓然等：基于UHPLCQTOF MS的黄芩汤化学成分和大鼠入血成分分析51525354555657585960616263646566676818.15618.25318.70319.32020.40820.47020.69320.97122.06322.13323.13123.39824.92724.95325.28426.14426.35926.56626.61527.20328.957Oroxylin A（千层纸素A）Chrysin（白杨素）Neobaicalein（黄芩新素）Licorice-saponin J2（甘草皂苷J2）Glycyrrhetic acid（甘草次酸）Rivularin（半枝莲种素）/5，2-dihydroxy-6，7，8-trimethoxyflavone（5，2-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮）Glycyrrhizin（甘草甜素）Glyasperin C（粗毛甘草素C）Neochlorogenic acid（新绿原酸）Glycyrin（格里西轮）Licoisoflavone B（甘草异黄酮B）/semilicoisoflavone B（半甘草异黄酮B）Isomer of 60（格里西轮的同分异构体）Glyasperin D（粗毛甘草素D）Betulonic acid（白桦脂酮酸）/oleanonic acid（齐墩果酮酸）/ursonic acid（熊果酮酸）/deoxyglabrolide（去氧光果甘草内酯）Gancaonin E（甘草宁 E）/3-（，-dimethylallyl）-kievitone（3-（，-二甲基烯丙基）-奇维酮）Glyasperin K（粗毛甘草素K）Glyasperin A（粗毛甘草素A）Licoriisoflavan A（甘草异黄烷A）/5-O-methyllicoricidin（5-O-甲基甘草西定）C16H12O5C15H10O4C19H18O8C42H64O16C30H46O4C18H16O7C42H62O16C21H24O5C16H18O9C22H22O6C20H16O6C22H22O6C22H26O5C30H46O3C25H28O6C22H24O5C25H26O6C27H34O5MH-M+H+MH-M+H+MH-M+H+M+H+MH-MH-M+H+MH-M+H+MH-M+K+M+H+M+H+M+H+MH-MH-M+K+M+K+283.068 3285.074 6253.050 0375.106 6823.417 0471.346 9345.097 2821.392 8355.154 8357.169 9353.089 8383.149 2351.086 7391.058 2383.148 8371.185 5455.351 1423.183 1367.151 8461.138 8477.202 3284.068 5254.057 9374.100 2824.419 4470.339 6344.089 6822.403 8356.162 4354.095 1382.141 6352.094 7382.141 6370.178 0454.344 7424.188 6368.162 4422.172 9438.240 624.24-3.24-1.93-1.654.110.340.42-5.17-1.80-0.066.010.06-1.034.46-0.60-0.07-1.284.06-9.369.243.34SSSGGSGGSGGGGZ/GGGGG+-+-+-+-（续表1）No.tR/minCompoundFormulaAdductm/zMWError/ppmHerbal sourceIn vivoS：Scutellaria baicalensis（黄芩）；P：Paeonia lactiflora（芍药）；G：Glycyrrhiza uralensis（甘草）；Z：Ziziphus jujuba（大枣）2.3讨论黄芩汤由黄芩、芍药、甘草、大枣组成，疗效确切、药味简练，但其中芍药的品种存疑。有研究通过本草考证和配伍分析，结合历史源流、植物基原、产地加工、炮制方法等，得出方中芍药应为赤芍的结论18。但考虑到当前中医临床的使用习惯18、人文因素19以及研究基础2，2024等因素，仍以白芍而非赤芍作为本研究中黄芩汤的组成药材品种。为提高中药复方的提取效率，本研究将各药材打粉后进行实验。机器在工作时会产生较大热量，而大枣中含有大量糖分，受热后黏性急剧增大，导致无法打成粉末且会损伤粉碎机刀片，因此粉碎机一次工作不宜超过5 s。本研究采用水煎这一传统的中药制备方法提取黄芩汤中的有效成分。由于有报道称黄芩生药材中含有黄芩酶类，会促使主要有效成分黄芩苷水解，故提取过程中未将黄芩浸泡以最大限度保留黄芩苷20。在提取黄芩汤有效成分时额外使用乙醇沉淀药液中的多糖和鞣质。其原因如下：一是由于这些物质的存在，提取液过于黏稠，无法浓缩到能满足大鼠单次给药量的浓度；二是大鼠在多次灌胃后出现不饮食、腹胀、便秘的症状，影响了其生理状态；三是黄芩汤中的多糖成分主要来自甘草和大枣，此两味并非方中的主药，只发挥佐使作用；四是除糖后色谱分离效果更好，峰形更尖锐，有利于多成分鉴定。因此，建议在开展黄芩汤体内成分分析前去除多糖和鞣质。体内样品中具有较高暴露量的黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素-6-O-D-葡萄糖醛酸苷和千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷等对NADPH诱导的脂质过氧化具有保护作用，对抗坏血酸-Fe2+体系诱发的线粒体肿胀和膜的流动性降低也有一定的保护作用2527。黄芩素还能够直接抑制与生长相关的信号因子和蛋白酪氨酸激酶，减少生长因子的mRNA表达，对癌细胞的增殖也有一定抑制作用28。黄芩苷在消化道内难以被直接吸收，经肠道微生物群水解为黄芩素后较易吸收入血29。芍药苷的动物实验表明，965第 42 卷分析测试学报其通过降低整体免疫反应来有效治疗免疫过度反应疾病30，但低下的口服生物利用度限制了其在临床上的应用3134。甘草苷通过干涉NFB通路发挥抗炎作用35，甘草次酸在动物实验中表现出抗氧化作用36。这些潜在药效基础物质的药理作用特点可作为后续筛选实验的线索加以参考。3 结 论 本研究采用UPLCQTOF MS技术对黄芩汤的化学成分和大鼠入血成分进行了分析，共鉴定出68种体外化学成分和35种入血成分。该方法在稳定性、灵敏度、分析效率方面均具优势，且能在一定程度上排除血清本身的干扰。黄芩汤在大鼠体内暴露的组分具有抗癌或减毒的潜在活性，可能为其药效基础。后续研究中，可通过小分子靶点的研究方式予以验证。本研究为黄芩汤抗癌活性成分的筛选提供了参考，该方法也可用于其他中药复方的成分分析，以提升传统复杂成分药方中小分子药物发现的效率。参考文献：1Zuo F，Zhou Z M，Liu M LBiol.Pharm.Bull.，2001，24（6）：693697.2Tang X M，Cui Y，Zhu H Y，An R 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