生物矿化法合成乳铁蛋白硫化...粒子及其光热抗肿瘤性能研究_范博.pdf

第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry239249DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221293生物矿化法合成乳铁蛋白硫化铜纳米粒子及其光热抗肿瘤性能研究范博1,2刘岚1吴倩1郑子良2邢洋1,2张娟2张瑞平*1,21（山西医科大学药学院，太原 030001）2（山西医科大学第三医院，山西白求恩医院，山西医学科学院，太原 030032）摘要基于近红外光二区（NIR-）的肿瘤光热治疗具有生物组织穿透更深、组织散射或吸收更少、皮肤最大允许暴露光照功率更高等优点。本研究采用生物矿化法一步合成了结构简单、生物相容性高、稳定性好且具有肿瘤靶向作用的乳铁蛋白硫化铜纳米粒子（Lactoferrin-mediated copper sulfide nanoparticles，CuSLf NPs）。此纳米粒子在 NIR-II 窗口具有光吸收，可在 1064 nm 激光照射下实现肿瘤光热治疗。乳铁蛋白不仅改善了硫化铜纳米粒子的溶解性，提高了其生物相容性和肿瘤靶向性，而且利用 Lf 的抗氧化作用可清除光热治疗后的氧化损伤。采用紫外-可见-近红外吸收光谱考察了 CuSLf NPs 的光吸收性质，结果表明，其在 NIR-区 10001300 nm 范围内具有较强吸收，在 1064 nm 激光照射下实现了有效的光热转换，光热转化效率为 25.84%，光热稳定性好。以 LRP-1 高表达的 U87 神经胶质瘤为模型，研究了 CuSLf NPs 的体内外抗肿瘤作用，结果表明，CuSLf NPs 具有优良的体内光热性能，在 NIR-区 1064 nm 激光照射下可有效实现肿瘤的热消融，安全性好，为实现 NIR-光热抗肿瘤治疗在临床中的应用奠定了基础。关键词 硫化铜；乳铁蛋白；近红外二区；光热治疗肿瘤的光热治疗（Photothermal therapy，PTT）是利用光热材料在肿瘤部位接受特定波长光照后可发热致肿瘤细胞死亡而实现的一种新型治疗方法。基于近红外光（Near-infrared，NIR）响应的 PTT 具有组织穿透能力强、肿瘤根除效率高、对正常组织副作用小等优势。与传统的近红外光一区（NIR-）（700950 nm）相比，近红外光二区（NIR-）的吸收波长在 9001700 nm 范围内，基于 NIR-的 PTT 具有生物组织穿透更深、组织散射或吸收更少、皮肤最大允许暴露光照功率更高等优点1-2。硫化铜（Copper sulfide，CuS）纳米粒子在近红外区（7001400 nm）具有强吸收和光热转化效率高等优点，利用其光吸收特点在 NIR-窗口的激光照射下可快速产生局域性升温，实现对肿瘤细胞杀伤3-4。虽然 PTT 在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景，但为了彻底消融肿瘤，通常需要控制光热温度高于 50，以诱导肿瘤细胞完全坏死，但过高热量在非特异性热扩散过程中会产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），对周围正常的细胞和组织造成不可逆损伤，降低患者顺应性5-6。此外，静脉给药后光热剂在肿瘤组织的靶向效率低。因此，提高光热剂的靶向性，有效清除 ROS 以降低组织产生的氧化产物，成为提高肿瘤疗效、降低潜在毒性的有效手段7。乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）是一种多功能铁结合型糖蛋白，参与铁的储存和转运，还具有抗微生物、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫系统等功能8-10。作为一种重要的内源性抗氧剂，Lf 通过激活单核细胞途径抑制嗜中性粒细胞释放氧自由基或螯合铁离子后抑制铁离子诱导的脂质过氧化物产生等多种方式清除ROS，从而减少对正常组织的氧化损伤作用11。此外，Lf 是一种重要的靶向配体，可特异性地与肿瘤组织内的血管内皮细胞和肿瘤细胞上过表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（Low density lipoproteinreceptor associated protein，LRP-1）结合，提高其修饰的分子或纳米粒子在肿瘤中的有效蓄积12。因此，本2022-06-04 收稿;2022-10-14 接受国家自然科学基金项目(Nos.82211001138,82071987,81771907)、山西省青年科学研究项目(No.20210302124703)和山西医科大学博士启动基金项目(No.03201620)资助。*E-mail:zrp_研究以乳铁蛋白为模板，CuS 为光热治疗核心纳米粒子，采用生物矿化法合成了一种结构简单、生物相容性高、稳定性好、肿瘤靶向性高的乳铁蛋白硫化铜纳米粒子（Lactoferrin-mediated copper sulfidenanoparticles，CuSLf NPs），以 LRP-1 高表达的 U87 神经胶质瘤为模型，研究了 CuSLf NPs 体内外抗肿瘤作用。此纳米粒子在提高硫化铜纳米粒子生物兼容性和靶向性的同时可利用 Lf 的抗氧化作用清除PTT 后的氧化损伤，减少肿瘤复发，为加快 PTT 在肿瘤治疗中的应用奠定基础。1实验部分1.1仪器与试剂Zetasizer Nano-ZS90 型纳米激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；VevoLAZR-X 超声光声成像系统（日本富士胶片株式会社）；Fluke Ti400 红外热成像仪（美国 Fluke Electronic Instrument 公司）；TU-1901 双光束紫外-可见分光光度计（美国 Perkin Elmer 公司）；NIR2000 近红外光谱仪（杭州通尚光电科技有限公司）；AXIS ULTRA DLD 型 X-射线光电子能谱仪（英国 Kratos 公司）；JEM-2100F 场发射透射电子显微镜（日本电子株式会社）；Leica DMIL LED 倒置显微镜（德国徕卡显微系统）；CMAX PLUS 酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）。人乳铁蛋白（上海强耀生物科技有限公司）；Na2S9H2O（上海麦克林生物有限公司）；Cu（NO3）23H2O（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Cell Counting Kit-8 试剂（北京赛文创新生物科技有限公司）；台盼蓝染液（北京索莱宝科技有限公司）；羟基自由基（OH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。1.2CuSLf NPs合成采用生物矿化法合成 CuSLf NPs13。将 Cu（NO3）23H2O 溶液（0.0035 mmol/L）和 Lf溶液（30 mg/mL）等体积快速混合，搅拌反应 5 min 后，用 2 mol/L NaOH 溶液将体系 pH 值调至 12。加入 Na2S9H2O（240 mg/mL）溶液，90 恒温下继续反应 30 min。反应结束后，将产物转入超滤离心管（截留分子量10000）中，3500 r/min离心15 min，用去离子水重复洗涤35次后，取上清液，冷冻干燥，密封保存，备用。将 CuCl22H2O（0.001 mmol）和柠檬酸钠（0.068 mmol）溶于 90 mL 去离子水中，逐滴加入 10 mL Na2S溶液（10 mmol/L）。室温反应 5 min 后，将溶液升温至 90 继续反应 15 min，得无 Lf 修饰的 CuS 纳米晶（CuS NPs）溶液。1.3CuSLf NPs的理化性质表征取适量冻干品，采用透射电镜观察 CuSLf NPs 形态。使用 Zetasizer Nano-ZS90 激光粒度仪测定CuSLf NPs 溶液的粒径及 Zeta 电位，并考察其与含（或不含）10%FBS 的 PBS 缓冲液（pH 7.4）于 37 共孵育后的粒径及电位变化情况。另取适量 Lf 及 CuSLf NPs 溶液，分别测定其紫外-可见吸收光谱以及近红外二区吸收光谱。1.4CuSLf NPs的光热性能研究1.4.1光热效应测定首先，将不同浓度的 CuSLf NPs 溶液（0、0.2、0.4、0.6 和 1.0 mg/mL）分别加入 EP 管中，使用1064 nm 激光器（1 W/cm2）持续照射 5 min，每隔 10 s 使用红外热成像仪（Fluke Ti400）记录溶液的实时温度，绘制不同浓度 CuSLf NPs 升温曲线。然后，将 0.2 mg/mL CuSLf NPs 溶液在不同功率（0.4、0.6、0.8 和 1.0 W/cm2）下进行上述操作，绘制不同功率的升温曲线。最后，通过 5 次连续升温-降温考察纳米粒子溶液（0.2 mg/mL）的光热稳定。1.4.2CuSLf NPs的光热转换效率的测定将 CuSLf NPs 溶液在 1064 nm 激光下照射（1 W/cm2，5 min），然后关闭激光器，待样品自然冷却，记录温度变化与时间的关系。依据公式（1）计算光热转换效率（）14：hs TTQI=()(110)100%(1)Amaxsurdis1064其中，h 为热传递系数，s 为传热表面积，Tmax为 CuSLf NPs 溶液最高温度，Tsur为环境温度，Qdis为溶剂240分 析 化 学第 51 卷吸收热量，I 为激光功率，A1064为 CuSLf NPs 在 1064 nm 处的吸光度。hs 可由公式（2）计算：hsm c=(2)D Ds其中，mD表示溶剂的质量，cD表示溶剂的比热容（水：4.2 J/（g）。为求得s，需引入驱动温度常数，按照公式（3）计算：TTTT=(3)sursurmax其中，T 为溶液温度。根据：t=sln可求出s。此外，Qm cTT=()(4)disD Dmax(water)surs(water)其中，Tmax（water）为激光照射后水的最高温度，将降温段温度代入公式（1）即可求 CuSLf NPs 的光热转化效率值。1.5CuSLf NPs抑制OH能力配制不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 mg/mL）的 CuSLf NPs 供试品溶液。根据试剂盒说明书配制所需浓度的 0.03%H2O2标准品、底物、试剂三和试剂四（显色剂），现用现配。将供试品与配好的 0.03%H2O2标准品、底物和试剂三迅速混匀，37 反应 1 min，立即加入试剂四终止反应。室温放置 20 min 后，测定 550 nm 处吸光度值，并按照说明书要求配制对照管、标准管及空白管，采用相同方法测定吸光度值后，计算供试品抑制OH 的能力。1.6细胞毒性测试将 U87 细胞接种于 96 孔板中，每孔 1.2 104个细胞，培养至细胞贴壁后弃去旧培养液，每孔加入不同浓度 CuSLf NPs（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和 1.0 mg/mL），设定空白孔，继续培养 24 h 后，弃去培养上清液，加入 CCK-8 试液后，37 孵育 1 h，检测各孔 450 nm 处 OD 值，计算细胞存活率。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以每孔1.0 104个细胞接种于96孔板中，其余操作同上，并计算存活率。1.7细胞增殖抑制及双染实验U87 细胞以每孔 1.2 104个细胞接种于 96孔板中，待培养至细胞贴壁后，将其分为 PBS 组、PBS+光照组、CuSLf 组、CuSLf+光照组，其中，CuSLf 浓度为 0.2 mg/mL。光照组在与 U87 细胞孵育 4 h 后给予 1064 nm 激光照射（1 W/cm2，5 min），20 h 后采用 CCK8 法，按照 1.6 节中的方法检测并计算细胞存活率，考察不同样品对 U87 细胞增殖抑制情况。采用台盼蓝染色法考察细胞存活情况，即将 CuSLf 光热作用后的细胞用无血清培养基稀释的台盼蓝染液（培养基与台盼蓝染液配比为 91）染色 3 min，显微镜下观察并拍照记录。1.8SOD酶活力测定将 U87 细胞接种于 6 孔板中，每孔 3.0 104个细胞，培养至细胞贴壁后将其分组并给予 PBS、CuS NPs、CuS NPs+Lf（物理混合）和 CuSLf NPs 处理。4 h 后，各组用 1064 nm 激光照射（1 W/cm2，5 min）。光照 48 h 后，根据试剂盒说明书收集各组细胞样本（每组 104个细胞），并配制对照管和测定管，同时设空白管，采用分光光度计测定各管 560 nm 处吸光度值，计算抑制百分率和 SOD 酶活性。1.9体内光声成像及光热研究1.9.1荷瘤小鼠模型构建实验方案和操作均遵守山西医科大学动物实验伦理委员会的标准进行。将对数生长期的 U87 细胞以每只 3.0 106个细胞的数量接种于雄性 Balb/c 裸鼠右大腿根部背侧，建立皮下肿瘤模型。待肿瘤肉眼可见后，每2 d用游标卡尺测定，并计算肿瘤体积（V=0.5ab2，其中a和b分别为实体瘤长径和短径）。1.9.2光声成像肿瘤体积约为 100 mm3时将荷瘤小鼠随机分组，尾静脉分别注射 CuS 纳米粒子和 CuSLf 纳米粒子（3.0 mg/mL，0.2 mL），给药前和给药后 2、4、6、8、12 h 采用异氟烷对小鼠进行麻醉，并使用VevoLAZR-X 超声光声成像系统对肿瘤组织的光声成像信号进行捕获及分析，考察纳米粒子的瘤内聚集情况。第 2 期范博等：生物矿化法合成乳铁蛋白硫化铜纳米粒子及其光热抗肿瘤性能研究2411.9.3光热治疗肿瘤体积约 50 mm3时，荷瘤小鼠随机分组（每组 5 只）：（1）生理盐水组（Saline），（2）仅光照组（Laser），（3）纳米粒子光照组（CuSLf+Laser）。其中，CuSLf 给药剂量为 30 mg/kg。尾静脉注射 6 h后，使用 1064 nm（1.0 W/cm2）激光照射（2）和（3）组小鼠肿瘤部位 5 min，采用红外热成像系统监测并记录肿瘤组织的温度变化情况。随后，监测各组小鼠体重及肿瘤生长情况。2结果与讨论2.1CuSLf NPs的表征生物矿化是生物有机物在一定条件下溶液中离子转变为固相矿物的过程。受生物矿化启发，许多纳米粒子采用以天然生物聚合物为模板的仿生合成方法制备，其中蛋白质作为一种经典的生物聚合物，已广泛应用于仿生合成领域15-16。本研究采用生物矿化法合成 CuSLf NPs 后，可明显观察到溶液颜色由淡粉色（Lf）变为黑褐色（CuSLf NPs）且澄清透明，说明此纳米粒子水溶性好，克服了 CuS 溶解度低的缺点（图 1B）。透射电镜结果如图 1C 所示，CuSLf NPs 呈球形，粒径均一，分散性良好。DLS 法测定粒径为 34.4 nm（图 1D），Zeta 电位为18.1 mV。与含或不含 10%FBS 的 PBS 缓冲液（pH 7.4）共孵育 24 h后，CuSLf NPs 的粒径和电位均没有显著变化（图 1E）。为了进一步确定目标产物的成功合成，采用X 射线光电子能谱对 CuSLf NPs 中 Cu 和 S 元素的化学状态进行了分析。结果表明，932.5 eV（Cu 2p3/2）和 952.4 eV（Cu 2p1/2）两个峰为 CuS 中 Cu2+的结合能（图 1F），162.7 和 168.6 eV 的峰分别归属于 CuS 中S2和乳铁蛋白中二硫键（图 1G），与 CuS 纳米粒子相关文献报道中的数据一致13，17。925 930 935940 945950 955 960Binding energy/eVCu 2p3/2Cu 2p1/2F160165170175S 2pIntensity/a.u.Binding energy/eVS 2pGE 504540353025Size/nm04812 16 20 24t/hSize(PBS)Size(10%FBS)Zeta(PBS)Zeta(10%FBS)101520Zeta/mVIntensity/a.u.ABCDBiomineralizationCuSLf NPsi.v.NIR laser LfLfCuSLfNumber/Percent4030201000.1110100100010000Size/nm50 nm图1（A）乳铁蛋白硫化铜纳米粒子（CuSLf NPs）的合成及光热治疗示意图；（B）乳铁蛋白（Lf）溶液和CuSLf NPs 溶液照片；CuSLf NPs 的透射电镜图像（C）和粒径分布图（D）；（E）CuSLf NPs 血清稳定性；CuSLf 中（F）Cu 2p 和（G）S 2p 的 X 射线光电子能谱Fig.1(A)Schematic of synthesis route and photothermal therapy of lactoferrin-mediated copper sulfidenanoparticles(CuSLf NPs);(B)Photograph of Lf and CuSLf NPs solutions;(C)Transmission electron micro-scope(TEM)image and(D)size distribution by dynamic light scattering(DLS)analysis of CuSLf NPs;(E)Serumstability of CuSLf NPs;(F)Cu 2p and(G)S 2p X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)pattern of CuSLf242分 析 化 学第 51 卷2.2CuSLf NPs的光吸收性能及光热性能如图 2A 所示，CuSLf NPs 的吸光度在 6001000 nm 范围内随着波长增加而增大。为了进一步表征 CuSLf NPs 在 NIR-区的光吸收特性，本研究采用近红外光谱仪对其在 10001300 nm 区间的光吸收情况进行考察。结果表明，CuSLf NPs 在 NIR-区 10001300 nm 处具有明显的吸收宽峰，而 Lf 在此区域内没有吸收，表明 CuSLf NPs 被成功合成，具有基于 NIR-区吸收的光热治疗潜能。鉴于CuSLf NPs 的光吸收特性，选择 1064 nm 激光器考察了 CuSLf NPs 在不同样品浓度或不同光照功率下的光热性质（图 2C 和 2D）。结果表明，当固定激光功率为 1 W/cm2，照射时间 t=5 min 时，不同浓度的CuSLf NPs 溶液在 NIR 照射下可迅速升温，并且温度变化幅度随着浓度增加而增大（图 2C）。即使是在较低浓度（0.2 mg/mL）时，CuSLf NPs 光照 5 min 后仍然可升温至 50 以上，但同等光照时间下纯水的温度几乎没有变化。不同样品浓度的光热成像图（图 2B）中也直观地显示出 CuSLf NPs 在不同浓度下的升温差异。当固定样品浓度为 0.2 mg/mL，照射时间 t=5 min 时，样品的最大升温温度随着光照功率的增加而增大（图 2D），说明 CuSLf NPs 具有良好的光热性能。与目前研究较多的 NIR-区相比，NIR-区的 PTT 具有更大的穿透深度和更高的激光最大允许暴露量（Maximum permissible exposure，MPE）。根据美国国家标准协会设定的皮肤耐受阈值，常见 808 nm（NIR-区）激发波长下安全的皮肤暴露 MPE 为0.33 W/cm2，而 1064 nm（NIR-区）激发波长下安全的皮肤暴露 MPE 为 1.0 W/cm2，此波长下最大允许照射量更高，这说明 1064 nm（NIR-区）激发波长下的光热治疗安全性更好18-19。40060080010000.00.10.20.30.40.5Absorbance/a.u./nm CuSLf LfabAB30405060708090T/t/st/st/s 1.0 mg/mL 0.6 mg/mL 0.4 mg/mL 0.2 mg/mL 0 mg/mLC25303540455055T/1.0 W/cm2 0.8 W/cm2 0.6 W/cm2 0.4 W/cm2D30354045505560T/ECuSLfLf1000 1050 1100 1150 1200 1250water0.2 mg/mL0.4 mg/mL0.6 mg/mL1.0 mg/mL012345 min90.08172635445362717.6050 100 150 200 250 300 350050 100 150 200 250 300 350010002000 3000 4000 5000图2（A）CuSLf NPs 在波长 4001000 nm（a）和 10001300 nm（b）范围内的吸收光谱图；不同浓度的CuSLf NPs 溶液（0、0.2、0.4、0.6 和 1.0 mg/mL）经 1064 nm（1.0 W/cm2）激光照射 5 min 的热成像图（B）和升温曲线图（C）；（D）不同光照功率下 CuSLf NPs 溶液的升温曲线（0.4、0.6、0.8 和1.0 W/cm2）（0.2 mg/mL，1064 nm，5 min）；（E）CuSLf NPs 的光热稳定性Fig.2(A)Absorption spectra of CuSLf NPs in wavelength ranges of 4001000 nm(a)and 10001300 nm(b);(B)Photothermal images and(C)heating curve of various concentrations(0,0.2,0.4,0.6 and 1.0 mg/mL)ofCuSLf NPs under laser irradiation for 5 min at 1064 nm and 1.0 W/cm2;(D)Heating curve of CuSLf NPs(0.2 mg/mL)with different near infrared(NIR)power(0.4,0.6,0.8 and 1.0 W/cm2)(0.2 mg/mL,1064 nm,5 min);(E)Photothermal stability of CuSLf NPs第 2 期范博等：生物矿化法合成乳铁蛋白硫化铜纳米粒子及其光热抗肿瘤性能研究243作为 PTT 的关键组成部分，光热剂的光热转化效率和光热稳定性对其临床应用至关重要。根据公式（1）（3），计算得到 CuSLf NPs 的光热转化效率为 25.84%。将 CuSLf NPs 溶液连续进行 5 次光热升温-自然冷却循环实验（图 2E），结果表明，在 5 次循环升温过程中，CuSLf NPs 的最高温度差异为2，说明 CuSLf NPs 具有良好的光稳定性，可实现反复多次 NIR 照射升温。以上结果表明，本研究中合成的 CuSLf NPs 是一种优良的光热剂。2.3CuSLf NPs的细胞增殖抑制性能采用 CCK8 法考察了 CuSLf NPs 对肿瘤细胞 U87 和正常细胞 HUVEC 的毒性（图 3A），结果表明，在 00.3 mg/mL 浓度范围内，两种细胞的存活率均80%，说明此浓度范围内 CuSLf NPs 对两种细胞几乎无毒性。当浓度大于 0.4 mg/mL 时，细胞存活率均低于 80%，因此后续实验采用的样品浓度均0.3 mg/mL。分别采用 CCK8 法和台盼蓝染色法考察了 CuSLf NPs 在 1064 nm 激光照射（1.0 W/cm2，t=5 min）下对 U87 细胞的增殖抑制作用（图 3B）。结果表明，PBS 组和 CuSLf NPs 无光照组的细胞存活率均80%，说明无 NIR 照射时，纳米粒子不影响 U87 细胞的正常生长；但是，当给予激光照射（1064 nm，1.0 W/cm2，5 min）后，U87 细胞存活率仅为 18.39%7.33%，说明 CuSLf NPs 产生的光热作用可有效抑制肿瘤细胞的生长。台盼蓝染色法是一种检测细胞活力最简便、快速的经典方法，台盼蓝是一种细胞活性染料，正常活细胞的细胞膜结构完整，不会被台盼蓝染色；丧失活性的细胞的细胞膜通透性增加，可被台盼蓝染成淡蓝色。因此，通过显微镜观察可直接对细胞存活率进行定性研究。如图 3C 显示，在有无NIR 照射时，PBS 组的 U87 细胞均呈无色透明状，都不能被台盼蓝染色；CuSLf NPs 组在无 NIR 照射时细胞呈无色透明状，说明细胞活性正常，但是 NIR 照射后可观察到明显的蓝色，说明 CuSLf NPs 光热效应有效诱导了肿瘤细胞的死亡。ACB120100806040200Cell Viability/%Cell Viability/%HUVECU87120100806040200Laser offLaser on00.10.20.30.40.61.0PBSCuSLfConcentration/(mg/mL)PBSPBS+LaserCuSLfCuSLf+Laser图3（A）HUVEC 细胞和 U87 细胞分别与不同浓度的 CuSLf NPs 孵育 24 h 后的存活率；（B）0.2 mg/mLCuSLf NPs 在有无激光照射（1064 nm，1 W/cm2，5 min）条件下对 U87 细胞的增殖抑制情况，*p0.001；（C）台盼蓝染色法研究不同样品在 1064 nm（1 W/cm2，5 min）激光照射下对 U87 细胞活性分析Fig.3(A)Cytotoxicity of CuSLf NPs on HUVECs and U87 cells;(B)Proliferation inhibition of U87 cellsunder NIR laser(1064 nm,1.0 W/cm2,5 min),*p 0.001;(C)Activity analysis of U87 cells after incubationwith different formulations under 1064 nm NIR laser(1.0 W/cm2,5 min)by trypan blue staining method244分 析 化 学第 51 卷2.4CuSLf NPs的抗氧化性能研究发现，伴随 PTT 治疗过程产生的大量 ROS 会对肿瘤周围的健康组织造成不可逆的损伤，甚至会刺激炎症响应而促进肿瘤的复发和转移7，因此，有效清除 ROS、降低组织产生的氧化产物是降低 PTT副作用，进而提高 PTT 疗效的关键。基于 Lf 具有天然抗氧化的功效，本研究首先通过考察 CuS-Lf NPs对OH 的清除能力，初步评价纳米粒子的抗氧化性能。OH 是目前已知的最活跃的氧自由基，也是对生物体毒性最强、危害最大的自由基。OH 可引起组织脂质过氧化，导致蛋白质、核酸等氧化损伤，并使细胞凋亡、坏死或突变，与细胞衰老、炎症、肿瘤等病变密切相关20。如图 4A 所示，在实验浓度范围内 CuSLf NPs 对OH 的清除能力随着材料浓度升高而增大，说明在 Lf 作用下，CuSLf NPs 具有清除自由基的作用。当 CuSLf NPs 在较低浓度（0.2 mg/mL）时，其对OH 的清除率约为 50%。为了进一步说明 CuSLf NPs 的抗氧化作用，测定了不同给药组光照后细胞内的 SOD 活性。SOD 是一种广泛存在于生物体内的重要抗氧化酶，SOD 活力可反映出机体清除氧自由基的能力。如图 4B 所示，经过光热治疗后，CuSLf NPs 组细胞内的 SOD 活性显著高于 CuS NPs 组（p0.001），说明 CuSLf NPs具有抗氧化作用。但需要注意的是，与 CuS+Lf 物理混合组相比，CuSLf NPs 组的抗氧化作用明显下降（p0.05），说明在 CuSLf NPs 的制备过程中可能引起了 Lf 的部分失活，因此，后续工作中需要进一步优化 CuSLf NPs 的反应条件，以提升其抗氧化作用。2.5CuSLf NPs用于体内光声成像及光热疗效建立了 U87 皮下肿瘤模型，研究 CuSLf NPs 的体内抗肿瘤效果。为了确定最佳的光热治疗时间点，首先采用光声成像技术对纳米粒子在肿瘤内聚集情况进行考察。光声（Photoacoustic，PA）成像是利用具有 NIR 吸收的材料在 NIR 照射时可将光能转变为超声波而获得的一种高分辨率和高对比度组织图像的新型成像技术。PA 成像将超声成像与光学成像特点相结合，组织穿透性较深，常用的 PA 成像造影剂若兼具有良好的光热性能，通常可通过 PA 成像引导下的光热治疗实现肿瘤的精准治疗13。由于 CuS具有较强的近红外吸收和光声转换性能，因此本研究通过分析尾静脉注射 CuS NPs 或 CuSLf NPs 后不同时间点的肿瘤组织内 PA 成像信号，评价 CuSLf NPs 的靶向性，并确定最佳 PTT 时间。如图 5A 所示，与给药前（0 h）相比，注射 CuS NPs 和 CuSLf NPs 后各组小鼠肿瘤组织内的光声信号均随着时间的推移而增强，并且在注射后 6 h 达到高峰（图 5B 和 5C），此后随着纳米粒子的代谢清除，PA 信号强度逐渐下降，提示纳米粒子在给药 6 h 后达到最佳的肿瘤聚集效果，因此选择此时间点进行光热治疗。值得注意的是，与 CuS NPs 相比，CuSLf NPs 在各时间点的信号强度均较高（图 5B 和 5C），说明 CuSLf NPs 比CuS NPs 具有更好的肿瘤靶向性。AB60504030201000.05 0.10.20.40.81.00.200.150.100.050.00CuSCuS+LfCuSLfOH clearance rate/%Concentration/(mg/mL)SOD activity/(U/104 cells)*图4（A）CuSLf NPs 对OH 清除作用；（B）U87 细胞与不同样品孵育并在 1064 nm（1 W/cm2，5 min）激光照射下超氧化物歧化酶（SOD）的活性.*p 0.05，*p 0.001Fig.4(A)Scavenging effect of CuSLf NPs against hydroxyl free radicals;(B)Superoxide dismutase(SOD)activity after incubation of U87 cells with different formulations under 1064 nm NIR laser(1.0 W/cm2,5 min).*p 0.05,*p 0.001第 2 期范博等：生物矿化法合成乳铁蛋白硫化铜纳米粒子及其光热抗肿瘤性能研究245为了考察 CuSLf NPs 的体内光热效果，待肿瘤长至 50 mm3时，将荷瘤小鼠随机分组，尾静脉分别注射生理盐水和 CuSLf NPs，并给予 1064 nm NIR 照射 5 min，采用热成像仪实时监测肿瘤部位温度。由图 5D 和 5E 可知，静脉给药后 CuSLf 组在 5 min 内肿瘤温度由 35.8 升至 54.0，而生理盐水组温度仅从 35.6 升至 36.8，这表明通过 Lf 对 CuS 的修饰作用，不仅可增强 CuS NPs 的肿瘤靶向蓄积能力，而且在近红外光照射下 CuSLf NPs 具有优良的光热性能，可用于肿瘤的光热治疗。光热治疗后动态监测 14 d 内荷瘤小鼠的肿瘤生长情况，结果表明 CuSLf NPs 组肿瘤体积增长情况与生理盐水组相比具有显著性差异，并且肿瘤完全消失，14 d 内无复发（图 6A 和 6B），说明基于CuSLf NPs 的光热治疗具有良好的抗肿瘤作用。此外，观察期内各组小鼠体重没有明显变化（图 6C），说明 CuSLf NPs 没有明显毒性。为了进一步研究纳米粒子的潜在毒性，治疗结束后，检测了各组小鼠的血液生化指标。丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）是反映肝脏功能的关键酶，血尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）是肾脏功能的重要指标，如图 6D 所示，纳米粒子组的 4 个指标 ALT、AST、BUN和 Scr 与生理盐水组相比无明显升高。进一步对小鼠进行全血血样检测，与对照组相比，纳米粒子组的血液学参数无明显差异，均在正常血常规各项指标参考范围内。以上结果说明，CuSLf NPs 具有良好的生物安全性。01234535404550556065t/minSaline+LaserCuSLf+LaserEBADC0.80.60.40.20.00.80.60.40.20.00246812t/ht/h0246812CuSCuSLfPA intensity/a.u.PA intensity/a.u.0 h2 h4 h6 h8 h12 hUSPAMergeUSPAMergeCuSCuSLfHighLowLowHighSalineCuSLf0 min1 min2 min3 min4 min5 min55.0524844403632282419.8T/图5（A）U87 荷瘤裸鼠尾静脉注射 Cu SNPs 和 CuSLf NPs（30 mg/kg）后肿瘤区域的超声成像图、光声（PA）成像图及叠加后的成像图（黄色虚线所圈区域为肿瘤组织）（光声图像激发波长为 945 nm）；（B）CuS NPs 和（C）CuSLf NPs 尾静脉注射后不同时间点肿瘤区域 PA 信号的定量分析（n=3）；U87 荷瘤裸鼠尾静脉注射生理盐水和 CuSLf 后 1064 nm（1 W/cm2，5 min）激光照射的光热成像图（D）和肿瘤温度变化曲线（E）Fig.5(A)Representative ultrasound(US)images,photoacoustic(PA)images and merged US(grey)and PA(red)images of U87 tumor(region circles by yellow dotted line)before and after intravenous injection of 200 Lof CuS NPs and CuSLf NPs(30 mg/kg)in living mice(excitation wavelength=945 nm for PA images).Quantitative analysis of PA intensity in tumor region before and after intravenous injection of CuS NPs(B)andCuSLf NPs(C)in U87 tumor-bearing mice(n=3).Representative infrared thermal images(D)and temperaturecurves(E)of tumor-bearing mice after intravenously injected with Saline and CuSLf NPs with 1064 nm laser(1 W/cm2,5 min)246分 析 化 学第 51 卷543210Saline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+LaserSaline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+Laser Saline Laser CuSLf+Laser10864206004002000504030201000015010050002015105400300200100604020WBC/(109/L)RBC/(1012/L)PLT/(106/L)HCT/%HGB/(g/L)MCH/pgMCHC/(g/L)MCV/fL50403020100150100500151050403020100ALT/(U/L)AST/(U/L)Saline LaserCuSLf+LaserSaline LaserC