基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建.pdf

第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3基于 T7 转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白 高效表达系统的创建任晓昕1，韩琳琳1，武子淇1，谷 敏2，徐大庆1（1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000；2.河北省蠡县农业农村局，河北 保定 071400）摘要：本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体 pAU2 为基础，通过添加 T7 RNA 聚合酶编码基因及人工合成的克隆表达区，构建了 1 个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体 pAU29KS。pAU29KS 载体克隆/表达盒使用 T7 启动子作为目的基因的启动子，通过载体序列中 T7 gene 1 基因编码的 T7 RNA 聚合酶与 T7 启动子互作来进行目的基因的高效转录；启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点 RBS 保守序列（gaaagga）来高效起始目的蛋白合成；克隆/表达盒 RBS 与多克隆位点 MCS 之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽 cgl_2070 编码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的-淀粉酶 AmyF 作为报告蛋白，进行谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum/pAU29KS 表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示，工程菌株 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈；培养物上清液的 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带，与AmyF预测分子量相一致；淀粉酶活性检测结果显示，培养物上清液呈现高淀粉酶活力，而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力，说明高效表达的-淀粉酶在强信号肽 cgl_2070 的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于 T7 转录系统的 C.glutamicum/pAU29KS 能够对目标蛋白进行高效分泌生产，是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。关 键 词：谷氨酸棒状杆菌；T7 转录系统；重组蛋白表达和分泌中图分类号：Q71 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ACreation of the efficient recombinant protein expression system based on the T7 transcription system in Corynebacterium glutamicumRENXiaoxin1,HANLinlin1,WUZiqi1,GUMin2,XUDaqing1(1.College of Life Sciences,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.Li County Agricultural and Rural Bureau of Hebei Province,Baoding 071400,China)Abstract:In this study,a new efficient secretion-type gene expression vector pAU29KS was constructed by sequentially adding the T7 RNA polymerase-encoding gene and synthetic cloning/expression cassette to the E.coli-C.glutamicum shuttle vector pAU2 constructed in our previous work in C.glutamicum.The pAU29KS vector employs the T7 promoter that the target gene can be efficiently transcribed by interaction between the T7 RNA polymerase and the T7 promoter.The conserved RBS sequence(gaaagga)of C.glutamicum was located downstream of the promoter region to efficiently initiate target protein synthesis.The strong signal peptide cgl_2070-encoding sequence of C.收稿日期：2023-04-14基金项目：河北省自然科学基金（C2020204085）；河北省重点研发计划项目（22326610D）.第一作者：任晓昕（1990），男，河北张家口人，硕士研究生，从事微生物学方向研究.E-mail:通信作者：徐大庆(1972)，男，河北平泉人，博士，教授，从事分子微生物学和发酵工程研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)04-0091-07DOI：10.13320/ki.jauh.2023.006392第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报glutamicum between RBS and the multiple cloning sites(MCS)was used to mediate efficient extracellular secretion of the target protein.Using the alpha-amylase of Geobacillus stearothermophilus as a reporter protein,the ability to protein secretory production of the C.glutamicum/pAU29KS expression system was tested.The results of transparent circle method showed that there were appeared clear transparent circles around the strain C.glutamicum/PAU29KS-amyF cultures on the starch plate.The SDS-PAGE staining and Western Blotting results of the supernatants of the strain C.glutamicum/PAU29KS-amyF culture showed clear specific AmyF bands.The tests of AmyF activities demonstrated that the amylase activity was high in the supernatant of the strain C.glutamicum/PAU29KS-amyF culture,while no amylase activity was detected in the supernatant of the strain C.glutamicum/PAU29KS-amyF cell lysis,suggesting that the efficiently expressed alpha-amylase was completely secreted into the medium.These results demonstrated that the C.glutamicum/pAU29KS system can efficiently express and secrete the target protein,and is an excellent secretion-type C.glutamicum recombinant proteins production system.Keywords:Corynebacterium glutamicum;T7 transcription system;expression and secretion of recombinant proteins重组蛋白高效表达系统是进行具有成本竞争力的目标蛋白工业化生产的基础。优秀的微生物重组蛋白表达系统需要 1 个合适的宿主菌株及 1 个高效的基因表达载体。另外，重组蛋白的胞外分泌，因其能够简化分离纯化步骤，降低生产成本1，是优秀的微生物重组蛋白表达系统的又一关键特征。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是 1 种革兰氏阳性、不产芽孢和菌丝体的符合食品安全生产标准的食品级微生物2，已广泛应用各种小分子物质，包括氨基酸、维生素、乙醇和某些有机酸等的发酵生产3。谷氨酸棒杆菌因其具有培养条件要求简单，细胞生长速度快，能够向培养基中分泌胞外蛋白4，胞外蛋白酶活性极低以及能够进行高密度发酵等特点5，是一种适用于重组蛋白生产的优秀宿主菌。然而，谷氨酸棒杆菌表达载体拷贝数低并且缺乏强启动子，致使重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达水平普遍偏低6。因此，构建高效分泌型谷氨酸棒杆菌表达系统，对于进行重组蛋白的经济、高效生产具有十分重要的意义。源自大肠杆菌 T7 噬菌体的 T7 转录系统具有特异性（指 T7 RNA 聚合酶只特异性识别 T7 启动子，而不与细菌中的其他启动子互作）、简单性（指从T7 RNA 聚合酶识别 T7 启动子开始，到转录终止的整个转录过程中，不需任何其他的蛋白因子参与）和转录高效性的特点，已经在异源细菌中成功用于重组蛋白的高效表达7。信号肽是转运蛋白前体 N-末端的一小段氨基酸，其最终被细胞膜上的信号肽酶切割并不出现在成熟的分泌蛋白中。信号肽的强弱决定着蛋白跨膜分泌效率8。目前为止，一系列强信号肽，诸如 cgl_2070、cgl_0904 等，已经在谷氨酸棒杆菌中被鉴定9-10。本研究拟以谷氨酸棒杆菌为宿主菌，构建以 T7 转录系统控制基因转录，cgl_2070 强信号肽介导重组蛋白分泌的分泌型基因高效表达载体，创建一套谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统，以期为重组蛋白的经济、高效生产提供新途径。1 材料与方法1.1 引物和细菌培养条件本试验所需引物序列见表 1。表 1 本试验所用引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in this work引物名称Names引物序列（5 3）SequencesamyF-FATATGAATTCGCTGCACCATTCAACGGCamyF-RATATAAGCTTTGGCCATGCGACAAGGCGT7-F1ATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAAAGGAGGCACTAAATGAACACGATTAACT7-R1ATAATACTCCAGAGGCTAGTCCCTCTGGAGCTATCTAGTCGTATTGATTTGGCGTTT7-F2ATTACTGCAGTGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAT7-R2ATTAGTCGACAGGCCTATCAACCTTGGGATCCTATAATACTCCAGAGGCTAGTCCCTC29K-YZ-FGGAGAACACTTGGTGGGCTG29K-YZ-RTCGGGCTTCCCATACAATCG93第 4 期大肠杆菌220 r/min、37 条件下培养于 LB 液体培养基中（tryptone 1%、Yeast extract 0.5%、NaCl 1%）或 37 条件下培养于 LB 固体培养皿中；谷氨酸棒杆菌 200 r/min、30 条件下培养于 LBHI 液体培养基中（tryptone 0.5%、Yeast extract 0.25%、NaCl 0.5%、Brain Heart Infusion 1.85%）或 30 条件下培养于 LBHI 固体培养皿中;谷氨酸棒杆菌转化子筛选 200 r/min、30 条件下培养于 LBHIS 液体培养基中（tryptone 0.5%、Yeast extract 0.25%、NaCl 0.5%、Brain Heart Infusion 1.85%、D-Sorbitol 9.1%）或 30 条件下培养于 LBHIS 固体培养皿中。1.2 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体 pAU29KS的构建首先，以E.coli BL21（DE3）基因组DNA为模板，T7-F1/T7-R1 和 T7-F2/T7-R2 为 引 物 进 行 T7 RNA聚合酶编码基因 T7 gene 1 的 PCR 扩增；使用限制性内切酶 Pst I 和 Sal I 对 T7 gene 1 基因片段和本实验室前期构建的载体 pAU2（E.coli-C.glutamicum基础穿梭载体，Kmr）进行双酶切并纯化，纯化产物通过 DNA Ligation Kit Ver.2.1 试剂盒进行连接，连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的 LB 固体培养基中，置于 37 条件下过夜培养；挑选转化子，提取质粒进行 Pst I 单酶切和 Pst I、Sal I 双酶切验证，验证正确的质粒命名为谷氨酸棒杆菌质粒 pAU29K。然后，使用 Bam HI 和Stu I 分别双酶切质粒 pUC57-S-Box1 和 pAU29K，经连接、转化、卡那霉素抗性平板筛选，对转化子进行以 29K-YZ-F/29K-YZ-R 为引物的菌落 PCR 验证，验证正确的转化子提取质粒进一步的测序验证，测序验证正确的质粒即为谷氨酸棒杆菌质粒分泌型表达载体 pAU29KS。1.3 重组表达载体 pAU29KS-amyF的构建及其谷氨酸棒杆菌转化使用人工合成的经过谷氨酸密码子偏爱性优化嗜热脂肪土芽孢杆菌-淀粉酶编码基因 amyF作为报告基因。首先，应用在线信号肽预测软件 SignalP5.0（SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech）对 amyF 基因进行信号肽编码序列分析，以质 粒 pUC57-amyF 为 模 板，amyF-F/amyF-R 为 引物进行去除自身信号肽编码序列的 amyF 报告基因的 PCR 扩增；然后，使用限制性内切酶 Eco RI 和Hin dIII 对表达载体 pAU29KS 和 amyF 基因分别进行双酶切;第三步，分别将双切并纯化后的质粒pAU29KS 与 amyF 基因进行片段连接，通过热激法将上述连接产物转化至 E.coli DH5 感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的 LB 固体培养基中，置于 37 恒温培养箱中过夜培养；最后，长出清晰可见的转化子后，挑选转化子进行双酶切以及进一步的测序验证，验证正确的重组表达载体，命名为pAU29KS-amyF。参 照 Liebl 等 的 电 转 化 法11，将 重 组 表 达载 体 pAU29KS-amyF 电 转 化 至 谷 氨 酸 棒 杆 菌 C.glutamicum ATCC13032 感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的 LBHIS 固体培养基上，于 30 培养箱中过夜培养；对转化子进行质粒提取验证，验证正确的谷氨酸棒杆菌转化子即为 pAU29KS-amyF 转化成功的谷氨酸棒杆菌工程菌，命名为 C.glutamicum/pAU29KS-amyF。1.4-淀粉酶 AmyF 在谷氨酸棒杆菌表达系统C.glutamicum/pAU29KS-amyF中的分泌表达及检测1.4.1 透明圈法检测-淀粉酶分泌情况 利用透明圈法，对工程菌 C.glutamicum/pAU29KS-amyF分泌表达 AmyF 情况进行分析，具体步骤如下：首先，将 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 在含卡那霉素的 LBHI 液体培养基中培养过夜；然后，将 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 以及不含载体的野生型菌株 C.glutamicum ATCC13032 划线于含 2%淀粉的 LBHI 平板培养基上，置于 30 条件下培养 36 h；最后，将培养后的平板用配置好的碘液均匀涂抹平皿，观察有无透明圈现象。1.4.2 C.glutamicum/pAY29KS-amyF 培 养 物 上 清液中-淀粉酶的 SDS-PAGE 检测对照菌株 C.glutamicum ATCC13032 和工程菌株 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 分别接种 LBHI 培养基 12 h 过夜培养，按照 110 比例转接到 50 mL LBHI 培养基中培养 36 h，12 000 r/min、4 条件下离心 2 min，收集培养物上清液。按照常规方法制备 SDS-PAGE的变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述谷氨酸棒杆菌培养物上清液按比例加入 5 倍上样缓冲液，煮沸 10 min，按照 15 L/孔上样量上样，然后进行电泳。将 SDS-PAGE 凝胶使用考马斯亮蓝 R250 染色后进行脱色，可清晰看到凝胶上的蛋白条带后终止脱色反应。任晓昕，等：基于 T7 转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建94第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报1.4.3 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 菌 体 胞 内 及培养物上清中-淀粉酶活性检测菌体沉淀重悬液超声波破碎，离心除去细胞碎片，制备细胞裂解上清液，用于胞内-淀粉酶活性检测。应用 QB/T1803-1993 国标法12，对菌体胞内及培养物上清中-淀粉酶进行活性检测。具体方法如下：第一步将诱导表达完成后的样品 12 000 r/min、4 离心 2 min，并将菌体沉淀进行超声破碎后收集破碎液上清；第二步设置 6 个试验组，取 6 支试管，放入 20 mL 可溶性淀粉溶液，然后加入 5 mL pH6.0缓冲液混匀后 60 水浴 5 min；第三步将待测酶溶液进行梯度稀释后，各取 1 mL 加入至相应编号的离心管中混匀，及时反应 5 min，再加入 1 mL 反 应 液 和 5 mL 稀 碘 液 混 匀；以 稀 碘 液 为 对 照组，使用分光光度计测定样品 OD660；按照 QB/T10831993 表 A1 计算待测样品的酶浓度；待测样品酶活力=查表 A1 求得酶浓度 稀释倍数。一单位淀粉酶活性(U/mL)被指定为 1 g 固体酶粉（或 1 mL 液体酶），于 60、pH=6.0 条件，1 h 液化1 g 可溶性淀粉，即为 1 个酶活力单位，以 U/mg(U/mL)表示。试验设 3 个生物学重复。2 结果与分析2.1 分泌型基因表达载体 pAU29KS 的构建以实验室前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒 pAU2（4 713 bp）为骨架，将 T7 RNA聚合酶编码基因 T7 gene 1 片段（2 818 bp）插入到 pAU2 的 Pst I 和 Sal I 两个限制酶位点之间，构建质粒 pAU29K（7 531 bp）。在质粒 pAU29K 的BamHI 和 StuI 位点之间，插入 465 bp 的人工合成的克隆/表达盒 S-Box1，构建谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体 pAU29KS（7 978 bp）。琼脂糖凝胶电泳检测及测序验证与预期结果相一致，表明成功构建谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体 pAU29KS，见图 1。克隆表达盒 S-Box1 多克隆位点 MCS 由EcoRI、Not I、Bgl II、Nhe I 和 Hind III 组成，主要 使用 T7 启动子来控制目的基因的转录，使用谷氨酸棒杆菌强核糖体结合位点 RBS 和强信号肽序列cgl_2070 来控制蛋白质的翻译及介导蛋白质的胞外分泌。BAbpM17 978 bpT7 gene 1S-BoxpAU29KS7 978 bprep(PMBI)rep(pBL1)aphIC12 0008 0006 0005 0004 0003 0002 5002 0001 5001 000500注：A：质粒 pAU29KS 电泳图.M：GsBL2502 DNAMarker；第 1 泳道：pAU29KS 质粒单酶切；B：质粒 pAU29KS 图谱.rep(pMB1)，C.glutamicum 质粒复制子；aphI，卡那霉素抗性基因；rep(pBL1)，E.coli 质粒复制子；T7 gene 1，T7 RNA 聚合酶编码基因；S-Box，克隆/表达盒；C：S-Box 具体序列。图 1 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体 pAU29KS 的构建Fig.1 Construction of the secretion-type gene expression vector pAU29KS in C.glutamicum95第 4 期2.2 谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统C.glutamicum/pAU29S-amyF的构建嗜热脂肪土芽孢杆菌-淀粉酶 AmyF 能够在谷氨酸棒杆菌中以Sec（the general secretion pathway）和 Tat（the twin arginine translocation pathway）2 种不同分泌途径进行活性分泌，本研究选择使用 AmyF 作为报告蛋白来检测谷氨酸棒杆菌 C.glutamicum/pAU29KS 表达系统的蛋白生产能力。将经过谷氨酸密码子偏爱性优化，且去除自身信号肽编码序列的 amyF 连接到表达载体 pAU29KS 上，转化大肠杆菌，获得重组表达载体 pAU29KS-amyF。对照载体 pAU29KS 及重组载体 pAU29KS-amyF 分别转化谷氨酸棒杆菌，提取谷氨酸棒杆菌转化子质粒进行酶切验证。琼脂糖凝胶电泳检测（图 2）及测序验证与预期结果相一致，表明成功获得谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统 C.glutamicum/pAU29KS-amyF。12 0008 0006 0005 0004 0003 0002 5002 0001 5001 000500bpM 1 29 523 bp7 978 bp1 545 bp注：M：GsBL10001 DNAMarker；第 1 泳道：pAU29KS-amyF 质粒EcoRI 单酶切；第 2 泳道 pAU29KS-amyF 质粒 EcoRI 和 HindIII 双酶切。图 2 谷氨酸棒杆菌重组表达载体 pAU29KS-amyF的电泳检测Fig.2 Agarose gel electrophoresis assay of recombinant vector pAU29KS-amyF of C.glutamicum2.3C.glutamicum/pAU29KS-amyF分泌表达报告蛋白-淀粉酶 AmyF 的检测2.3.1-淀粉酶透明圈法活性检测 应用透明圈法可方便快速地对 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 能否分泌表达-淀粉酶 AmyF 进行判定。试验结果显示，C.glutamicum/pAU29KS-amyF 经过在平板培养物上培养，产生了清晰可见的透明圈，而对照菌株 C.glutamicum/pAU29KS 未见透明圈的产生（图3），说明 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 能够表达并向胞外分泌-淀粉酶。注：A：对照菌株 C.glutamicum/pAU29KS；B：C.glutamicum/pAU29KS-amyF。图 3C.glutamicum/pAU29KS-amyF-淀粉酶分泌的透明圈法检测Fig.3 Activity analysis of C.glutamicum/pAU29KS-amyF by-amylase transparent circle method2.3.2 -淀粉酶SDS-PAGE法分析 为确认C.glutamicum/pAU29KS-amyF 的-淀 粉 酶 AmyF 胞 外 分 泌 表达水平，对工程菌培养物上清液中 AmyF 含量进行 了 SDS-PAGE 检 测。SDS-PAGE 考 马 斯 亮 蓝 染色检测结果显示，相比于对照菌株 C.glutamicum/pAU29KS 培养物上清液，C.glutamicum/pAU29KS-amyF 培养物上清液样品清晰地呈现 1 条特异性的蛋白条带，且其分子量大小与预测的 AmyF 蛋白分子量 57 kD 大小相一致（图 4）。这些结果证明了 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 在 T7 转录系统的作用下进行了报告蛋白-淀粉酶的高效表达。1801301007055403525kDM 1 257 kD注：M：蛋白质分子量 Marker；第 1 泳道：对照菌株 C.glutamicum/pAU29KS；第 2 泳道：C.glutamicum/pAU29KS-amyF。图 4C.glutamicum/pAU29KS-amyF 培养物上清液SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of C.glutamicum/pAU29KS-amyF 任晓昕，等：基于 T7 转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建96第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报2.3.3-淀粉酶比酶活测定为检测胞内表达的AmyF 是否完全分泌到胞外培养基中，进行了 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 菌体胞内及培养物上清中-淀粉酶活性检测试验。酶活检测结果显示培养物上清液具有高淀粉酶活力，而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力（图 5），说明高效表达的-淀粉酶在由强信号肽 cgl_2070 的介导下完全分泌到胞外培养基中。以上检测结果，共同证明了本研究构建的基于 T7 转录系统的 C.glutamicum/pAU29KS能够对目标蛋白进行高效分泌生产，是一套优秀的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白高效表达系统。比酶活/(Umg-1蛋白质)Specific enzyme activity12010080604020012上清液Supernatant注：1：细胞裂解液上清液；2：菌体培养物上清液。图 5 C.glutamicum/pAU29KS-amyF 的-淀粉酶活性测定Fig.5 The specific activities of AmyF production in C.glutamicum/pAU29KS-amyF3 结论与讨论基因转录是通过 RNA 聚合酶与启动子相互作用来实现的，启动子的强弱决定了结构基因的表达效率。目前发现的谷氨酸棒杆菌天然质粒都是低拷贝质粒，表达载体在谷氨酸棒杆菌中的低拷贝数，使得强启动子应用于重组蛋白表达载体的构建具有更关键的意义。可能是由于在谷氨酸棒杆菌自身转录系统中，其自身 RNA 聚合酶需要负责 3 000 多个基因的转录，目前在谷氨酸棒杆菌中还没有发现天然强启动子。在源自大肠杆菌 T7 噬菌体的 T7 转录系统中，T7 RNA 聚合酶只单一负责 T7 启动子，能够高效转录 T7 启动子下游基因7。有研究表明，将 T7 RNA 聚合酶编码基因整合到谷氨酸棒杆菌染色体 DNA 上构建工程宿主菌，并通过构建表达载体形成表达系统，证明了 T7 转录系统在谷氨酸棒杆菌中的可用性13-14。与上述表达系统相比，本研究构建的 C.glutamicum/pAU29KS 表达系统，将 T7转录系统的 2 个组分，即 T7 RNA 聚合酶编码基因和 T7 启动子共同构建在同一表达载体上来高效表达目的基因，据目前所知尚属首次报道。其优势在于，表达载体 pAU29KS 可以使用具有不同天然特性或经遗传改造的谷氨酸棒杆菌作为宿主菌株，拓宽了C.glutamicum/pAU29KS表达系统的宿主使用范围，更加方便其应用于特定条件下的蛋白生产。使用双启动子来控制基因转录，已经被证明是增加异源蛋白产量的 1 种有效方式15。在真核生物中，可将同一目的基因插入表达载体上相互分离的 2 个强启动子下形成双启动子系统来进行高效转录，而由于细菌同源重组系统活性强，其双启动子转录系统都是将目的基因插入到 2 个串联启动子 下16。在前期研究中，通过对在大肠杆菌中使用的 tac 启动子进行理性设计而获得的 1 个谷氨酸棒杆菌强启动子 tac-M，并且应用于谷氨酸棒杆菌表达载体的构建17-18。本研究中，除了使用 T7 启动子外，表达载体 pAU29KS 还使用了 tac-M 启动子来共同转录目的基因。与已知的双启动子使用报道中的每一个启动子都是通过与宿主菌自身 RNA 聚合酶互作来控制基因的转录不同17，本研究使用的双启动子分别属于 2 个不同的转录系统，即 T7 转录系统和谷氨酸棒杆菌自身转录系统，tac-M 启动子的使用是进一步增加目的基因转录产物的有效方式。一般而言，大多数蛋白都只能通过 Sec 或 Tat 1 种途径进行活性分泌19，因此，在构建 Sec 分泌型表达载体 pAU29KS 的同时，也构建了使用 Tat 型强信号肽 cgl_0904 的表达载体 pAU30KT，二者不同之处仅在于使用了不同的信号肽序列。试验证明 C.glutamicum/pAU30KT 也是 1 个高效谷氨酸棒杆菌重组蛋白分泌型表达系统，其可用于依赖 Tat 途径进行活性分泌的重组蛋白的高效分泌生产。97第 4 期参考文献：1 Klaus G,Andreas P.Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systemsJ.Biotechnology Journal,2006,1(2):164-186.2 Cheng F,Luo Z,Guo Z,et al.Enhanced biosynthesis of hyaluronic acid using engineered Corynebacterium glutamicum via metabolic pathway regulationJ.Biotechnol J,2017,12:1700191.3 Tauch A,Phler A,Kalinowski J,et al.Plasmids in Corynebacterium glutamicum and their molecular classification by comparativegenomicsJ.Biotechnol J,2003,104:27-40.4 Suzuki,N,Watanabe K,Okibe N,et al.Identifification of new secreted proteins and secretion of heterologous amylase by 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