基于ERK_TGF-β1_Smad4信号通路探讨章氏接骨丹含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控的影响.pdf

福建中医药 2023 年 7 月 第 54 卷 第 7 期Fujian Journal of TCM July 2023，54（7）基于ERK/TGF-1/Smad4信号通路探讨章氏接骨丹含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控的影响沈毅弘1，王庆敏1*，林哲辉1，李毅嵩1，雷黄伟2（1.福建中医药大学附属漳州中医院，福建 漳州 363000；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122）摘要：目的 基于ERK/TGF-1/Smad4信号通路探讨章氏接骨丹含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控的影响。方法 取3月龄SPF级雌雄各半SD大鼠40只，随机分为药物组与蒸馏水组各20只，药物组按2.7 mL/（kg d）灌服生药量浓度为1.554 g/mL接骨丹药液，蒸馏水组以等剂量蒸馏水灌胃，2组每日早晚各灌胃1次，灌胃7 d后取大鼠腹主动脉血制备接骨丹含药血清和空白血清。取2月龄SD大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓液培养传代至第4代制备骨髓间充质干细胞模型，随机分为空白组、模型组、接骨丹组、抑制剂组，选用细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂对ERK通路进行抑制。空白组采用10%空白血清-MEM培养液进行培养；模型组采用10%空白血清-MEM培养液ERK抑制剂进行培养；接骨丹组采用10%接骨丹含药血清-MEM培养液进行培养；抑制剂组采用10%接骨丹含药血清-MEM培养液ERK抑制剂进行培养。4组均培养9 d后分别检测4组碱性磷酸酶（ALP）浓度，采用免疫荧光法测定型胶原（COLI）表达水平，采用qPCR法检测COLI、转化生长因子-1（TGF-1）、Smad4蛋白（Smad4）、Runx-2基因（Runx2）mRNA相对表达水平，采用Western blot检测 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、磷酸化 ERK（p-ERK）蛋白表达量。结果 与空白组比较，模型组 ALP浓度和 COLI 表达水平均降低（P 均0.05），COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA 相对表达水平及 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK蛋白表达量均降低（P均0.05）；与模型组比较，接骨丹组ALP浓度和COLI表达水平均增加（P 均0.05），COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA 相对表达水平及 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK蛋白表达量均增加（P 均0.05）。与接骨丹组比较，抑制剂组 ALP 浓度和 COLI 表达水平均降低（P 均0.05），COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA相对表达水平及 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK 蛋白表达量均降低（P均0.05）。结论 章氏接骨丹能促进骨髓间充质干细胞成骨分化，其调控机制可能与上调ERK/TGF-1/Smad4信号通路相关。关键词：接骨丹含药血清；骨髓间充质干细胞；ERK/TGF-1/Smad4信号级联通路；成骨分化骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有向成骨细胞、软骨细胞等多向分化潜能的干细胞。当骨折损伤时，BMSCs可诱导其周围骨膜、骨髓、软组织间充质前体细胞增生，分化为成骨细胞、软骨细胞，继而介导骨生成、促进骨折愈合1。因此，若能调控BMSCs成骨分化对促进骨折愈合具有重要意义。近年来，有研究已证实活血及补肾类中药能促进 BMSCs 增殖、定向迁移及成骨分化2-3。我院已故的著名南少林派骨伤科名老中医章宝春根据60余年的临床实践证实了章氏接骨丹对骨折愈合的疗效确切，是目前临床广泛应用于骨伤疾病的药物，但其作用机制尚未明确。本实验拟通过观察章氏接骨丹含药血清对 BMSCs的细胞外调节蛋白激酶（ERK）/转化生长因子-1（TGF-1）/Smad4 蛋白（Smad4）通路相关因子表达的影响，阐明章氏接骨丹含药血清对BMSCs成骨分化的作用机制，以此探讨基于中医学“瘀去、新生、骨合”的骨折愈合理论，章氏接骨丹含药血清是否可以通过ERK/TGF-1/Smad4 信号通路促进 BMSCs 的成骨分化，以期为该药物的临床推广提供基础研究数据。1实验材料与仪器1.1实验动物3 月龄 SPF 级 SD 大鼠 40 只，体质量为（20010）g，雌雄各半，2 月龄 SPF 级 SD 大鼠40只，体质量为（12010）g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。以上动物全程饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，在室温 2025，湿度 20%30%的条件下，自由摄食饮水，实验前适应性饲养 7 d。该实验通过福建中医药大学动物伦理委员会审核批准（批件号：2020090）。1.2实验药材章氏接骨丹组成：牡丹皮 10 g，茯苓15 g，桔梗10 g，当归10 g，三七6 g，虫12 g，酒大黄6 g，煅自然铜15 g，红花10 g，莲子6 g，骨碎补10 g，续断10 g，木香12 g，丁香6 g，白芍10 g。中药饮片购于福建中医药大学附属漳州中医院，由本院药剂室制备成水煎剂。1.3实验试剂-MEM培养基（货号：SH30021.01B）、胎牛血清（货号：SH30088.03）均购自美国 Hyclone 公司；碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒（南京建成生物有限公司，货号：A059-1-1）；Western专用一抗二抗稀释液（货号：AR1017）、Western blot增收稿日期：2023-03-12基金项目：福建省漳州市科技计划项目（ZZ2019J35）；福建省中医药科研项目（2021zyjc25）；福建省中医学术流派传承工作室建设项目（闽卫中医函 2019 129号）通信作者：王庆敏，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0701035福建中医药第 54 卷强型蛋白印迹再生液（货号：AR0196）、Runx-2基因（Runx2，货号：PB0171）、磷酸化 ERK（p-ERK，货号：P00030）抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；I型胶原（COLI，货号：14695-1-AP）、TGF-1（货号：21898-1-AP）、Smad4（货号：51069-2-AP）抗体均购自美国Proteintech公司。1.4实验器材细胞培养箱、高速离心机均购自美国 Thermo Scientific 公司；超高灵敏化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；倒置显微镜（德国LEICA公司）；实时荧光定量PCR仪（北京鲲鹏基因科技有限责任公司）；电泳仪（北京原平皓生物技术有限公司）；流式细胞仪（德国Partec公司）；微量紫外可见分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）。2实验方法2.1章氏接骨丹药液制备每次取章氏接骨丹配伍组成的中药饮片1剂在5倍体积的纯净水中浸泡30 min，中火煮 0.5 h后过滤分离药渣与药液；将药液置于圆底烧瓶，使用旋转蒸发仪再次进行浓缩，制备生药量浓度为1.554 g/mL的章氏接骨丹药液，放入离心管中分装保存，存放于4 冰箱备用。2.2动物给药及血清制备将 3 月龄 SPF 级雌雄各半SD大鼠40只，采用随机数字表法分为药物组和蒸馏水组，每组 20 只。按每千克体质量大鼠的给药量为人的6.3倍计算，药物组按2.7 mL/（kg d）灌胃章氏接骨丹药液2，每日早晚各灌胃 1 次，蒸馏水组以等剂量灌胃蒸馏水，2组均连续灌胃 7 d。于最后一次灌胃后2 h后无菌采集腹主动脉血5 mL，全血室温下静置2 h后离心取上清。蒸馏水组制备所得为10%空白血清，药物组制备所得为章氏接骨丹含药血清。56 水浴灭活补体30 min，过滤器过滤除菌，标记分装后，-80 保存备用。2.3BMSCs 体外分离培养与传代鉴定将 2 月龄大鼠处死，在无菌条件下取下双侧股骨和胫骨，暴露骨髓腔后，用5 mL含青链霉素的-MEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓液至平皿中；将平皿中骨髓液置于离心管中，离心后倒掉上清液；用含10%胎牛血清的-MEM 培养液重悬细胞后，转入培养箱内孵育，传代至第4代细胞。流式细胞仪检测鉴定为BMSCs后进行后续实验。2.4细胞实验分组与干预取第 4 代生长良好的BMSCs随机分为空白组、模型组、接骨丹组、抑制剂组，使用 ERK 抑制剂作为通路抑制剂。空白组用10%空白血清-MEM培养液培养；模型组用10%空白血清-MEM 培养液PD98059 培养；接骨丹组用 10%接骨丹含药血清-MEM 培养液培养；抑制剂用10%接骨丹含药血清-MEM 培养液ERK 抑制剂培养。4组均连续培养 9 d，每 2 d更换培养基。2.5观察指标2.5.1免疫荧光法测定 COLI 表达水平4 组培养后弃原培养液，滴加COLI一抗室温避光孵育5 min，滴加荧光素标记的二抗再次室温避光孵育1 h，DAPI 染色 5 min，用防荧光淬灭的封片剂进行封片。在Leica DMI8荧光显微镜下放置载玻片观察，并在放大 400 倍后采集图像。用 ImageJ 软件打开图片并进行荧光强度的读取，荧光强度值即为 COLI 表达水平。2.5.2ALP 浓度检测4 组细胞培养后弃原培养液。将ALP酶联免疫分析试剂盒中的标准品按1 1比例加入标准品稀释液进行稀释，BMSCs及培养液上清按1 4比例加入样品稀释液进行稀释；在酶标包被板上设置空白孔、标准孔及待测样品孔。在标准孔孔加入稀释后标准品 50 L，待测样品孔加入稀释后BMSCs及培养上清50 L，封版膜封闭后弃去孔中液体加入洗涤液，静置 30 s 后甩干，重复5 次；每孔加入酶标试剂 50 L，空白孔除外，37 反应 30 min；弃去孔中液体加入洗涤液，静置 30 s后甩干，重复 5 次；每孔加入显色剂 A 50 L，再加显色剂 B 50 L，37 避光显色10 min；每孔加终止液50 L，终止反应。最后用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度（A 值），通过标准曲线计算样品中ALP浓度。2.5.3qPCR 法检测 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA相对表达水平将生长良好的第4代BMSCs及培养上清液中加入 1 mL TRIzol，用移液枪吹打混匀使细胞充分被裂解，室温静置 10 min，4 12 000 r/min 离心 10 min，取上清，提取总 RNA 并检测纯度。根据Rat（COLI、TGF-1、SMAD4、Runx2）的 mRNA 序列，用 Primer Premier 5.0 设计目标基因和内参基因的特异性引物，引物由上海博尚生物工程技术有限公司合成。用 R123-01 试剂盒逆转录合成 cDNA 第一链，反应条件为 50 15 min，85 5 s，得到的 cDNA 放置-20 冰箱中备用。选择ABI7500PCR 仪按以下程序进行定时定量 PCR 反应，反应程序设置为 95 30 s，95 10 s，60 30 s，循环 40 次。反应结束后进行结果分析，以GAPDH为内参，使用2CT法计算各目的基因相对表达水平。引物序列见表1。表1引物序列基因COLITGF-1Smad4Runx2GADPH引物序列F：5 CGAGTATGGAAGCGAAGGTT 3R：5 CTTGAGGTTGCCAGTCTGTT 3F：5 CAACAATTCCTGGCGTTACCT 3R：5 TGTATTCCGTCTCCTTGGTTCA 3F：5 GTCAACTCTCCAATGTCCACAG 3R：5 GCTTCACGGTCCAGGTAGTA 3F：5 AGCTGGACTGCGGTATTGAG 3R：5 CTGGATGAACCATGACCCGT 3F：5 ACGGCAAGTTCAACGGCACAG 3R：5 GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC 336沈毅弘 等：基于ERK/TGF-1/Smad4信号通路探讨章氏接骨丹含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控的影响第 7 期2.5.4 Western blot 检 测 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK 蛋白表达量按每孔加 0.05 mL 含PMSF的RIPA裂解液，使用预冷的细胞刮刀刮取细胞。采用 BCA 法测定蛋白浓度：按 1 4 比例加入5SDS-PAGE loading buffer，水煮变性蛋白，冷却后-20 保存备用；制备分离胶和 5%浓缩胶后快速上样，电泳开始时电压为80 V，30 min凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到 120 V，60 min 凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。一抗孵育：PVDF 膜漂洗 3 次，5 min/次后用含 5%脱脂奶粉中室温摇床孵育 30 min，分别加入一抗 4 过夜；COLI 稀释比例 14 000，TGF-1 稀释比例15 000，Smad4稀释比例 1 2 000，Runx2稀释比例1 2 000，p-ERK 稀释比例 1 2 000；次日使用 1TBST洗膜3次，10 min/次。二抗孵育：分别配置与一抗种属来源相同的二抗（稀释比例均为1 10 000），37 摇床孵育12 h后，去掉二抗溶液，用1TBST洗膜 3次，10 min/次，显影。采用蛋白图像分析软件以检测条带灰度值（A），最后计算目的蛋白/GAPDH的相对表达量。2.6统计学方法采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料属正态分布以（x s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较选LSD-t 法，方差不齐选 Tambanes T2 法进行比较。P0.05表示差异有统计学意义。3结果3.14组COLI表达水平比较见图1、表2。3.24组ALP浓度比较见表3。3.34组 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA 相对表达水平比较见图2。3.44组COLI、TGF-1、Smad4、Runx2蛋白表达量比较见图3、图4。4讨论BMSCs成骨分化能力的提高是骨再生的关键，目前研究发现 BMSCs的成骨分化由多条信号通路参与调控，主要包括MAPK/ERK信号通路、Wnt/-catenin 信号通路、Smad4 信号通路4。研究表明：ERK 在成骨分化过程中不断被磷酸化，磷酸化的ERK 激活 Runx2，从而促进成骨分化。因此，ERK信号通路在成骨细胞的分化中起着至关重要的作用。ALP在细胞外基质的表达反映骨的转化水平，能促进成骨细胞形成，参与骨的代谢，启动钙化，是细胞成骨分化能力强弱的指标性蛋白。注：A 空白组；B 模型组；C 接骨丹组；D 抑制剂组。图 1 免疫荧光检测 4组 COLI表达水平比较（400）表24组大鼠COLI表达水平比较（x s）组别空 白 组模 型 组接骨丹组抑制剂组COLI相对表达水平19.9410.288.9411.281）56.0616.102）26.447.392）注：与空白组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05。表34组ALP浓度比较（x s）ng/L 组别空 白 组模 型 组接骨丹组抑制剂组ALP浓度46.330.2528.221.201）73.310.622）63.471.072）注：与空白组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05。COLI mRNA相对表达水平32101）2）2）空白组模型组接骨丹组 抑制剂组空白组模型组接骨丹组 抑制剂组空白组模型组接骨丹组 抑制剂组空白组模型组接骨丹组 抑制剂组2）2）1）1）1）2）2）2）2）TGF-1相对表达水平2.01.51.00.50.0Smad4 mRNA相对表达水平2.01.51.00.50.0Runx2 mRNA相对表达水平2.01.51.00.50.0注：与空白组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05。图 2 4组 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2 mRNA 相对表达水平比较37福建中医药第 54 卷本实验中章氏接骨丹含药血清干预后 BMSCs的 ALP 浓度增高、COLI mRNA 相对表达水平和蛋白表达量、p-ERK蛋白表达量均明显提高，表明章氏接骨丹含药血清可以促进 BMSCs成骨分化。而加入ERK信号通路特异性抑制剂的模型组和抑制剂组表现出 p-ERK mRNA 相对表达水平和蛋白表达量明显下降。p-ERK作为将细胞表面信号转导到细胞核内部的重要传递者，可导致一系列成骨标志因子包括ALP、COLI的合成受阻，下游因子Runx2表达随之下降，与既往研究结果一致5-6。本研究结果显示使用ERK抑制剂会抑制BMSCs的成骨分化，章氏接骨丹含药血清可以通过调控ERK/TGF-1/Smad4信号通路影响BMSCs成骨分化。TGF-1 被细胞外的信号激活后将信号转入细胞内，激活胞浆中 Smad4。Smad4 再将细胞外信号转入细胞核内，调控成骨基因 Runx2，直接促进成骨分化。Runx2 作为目前公认的 BMSCs 成骨分化早期表达的关键转录因子，是成骨细胞表型的主要调节基因，可与成骨基因启动子区域中的成骨细胞特异性顺式作用元件（OSE）结合。Runx2可以通过上调成骨细胞分化标志因子（如ALP、COLI、OSE）促进骨结节的矿化，是 ERK 信号通路下游重要的靶向蛋白7，其能够激活骨髓间充质干细胞分化，促进成骨细胞向成熟成骨细胞转变 8-9。有学者在成骨分化的多条启动子序列中均发现了Runx2的结合位，认为Runx2是整合各种信号通路的交汇点10。本实验研究结果显示章氏接骨丹含药血清可以显著增加 TGF-1、Smad4 mRNA 相对表达水平和蛋白表达量，印证了TGF-1/Smad4信号通路参与了章氏接骨丹含药血清对 BMSCs 的成骨过程调控，而 PD98059 阻滞剂对 TGF-1/Smad4 信号通路有所抑制。综上，章氏接骨丹含药血清促进 MAPK/ERK 信号通路与 TGF-1/Smad4 信号通路之间发生反应，进而影响成骨分化过程11；随后激活ERK蛋白的磷酸化，将TGF-1所携带之信号转入细胞核中，刺激与成骨相关因子的表达后促进成骨。在中药促进 BMSCs增殖、定向迁移、成骨分化及抗骨质疏松的影响与机制方面，目前研究的方药主要集中在补肾类、活血类中药及补肾活血复方12-16。章氏接骨丹从整体观念出发，治病求本，以活血化瘀、行气止痛为主，兼以补益肝肾、强筋健COLITGF-1Smad4Runx2p-ERKGAPDH50 kDa44 kDa60 kDa55 kDa41 kDa50 kDaA B C D注：A 空白组；B 模型组；C 接骨丹组；D 抑制剂组。图 3 4组 COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK、GAPDH 蛋白条带图 空白组模型组接骨丹组抑制剂组2）2）1）TGF-1蛋白表达量0.80.60.40.20.0空白组模型组接骨丹组抑制剂组空白组模型组接骨丹组抑制剂组空白组模型组接骨丹组抑制剂组空白组模型组接骨丹组抑制剂组2）2）1）2）2）1）2）2）1）2）2）1）Smad4蛋白表达量0.80.60.40.20.0Runx2蛋白表达量0.80.60.40.20.0p-ERK蛋白表达量0.60.40.20.0COLI蛋白表达量0.40.30.20.10.0注：与空白组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05。图44组COLI、TGF-1、Smad4、Runx2、p-ERK蛋白表达量比较38沈毅弘 等：基于ERK/TGF-1/Smad4信号通路探讨章氏接骨丹含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控的影响第 7 期骨，从而达到“瘀去、新生、肾补、骨合”的目的。综上，章氏接骨丹含药血清通过调控 ERK/TGF-1/Smad4信号通路参与大鼠BMSCs成骨分化，促进骨形成，也可能进一步起到防治骨质疏松的作用。参考文献1刘金豹，冯萍，李刚.补肾活血胶囊含药血清基于 Wnt/-catenin 信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究 J.中华中医药杂志，2021，36（6）：3166-3170.2陆吴超，钱伟宏，姚志宏，等.补肾、活血中药及补肾活血复方对骨髓间充质干细胞增殖、定向迁移及成骨分化的影响及作用机制的研究进展 J.中医正骨，2018，30（7）：36-38.3张颖，张蕾蕾，孙瑞波，等.补肾活血法对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响及 miR-93-5p 对其的抑制作用 J.中华中医药杂志，2018，33（2）：667-671.4HEO S Y，KO S C，NAM S Y，et al.Fish bone peptide promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts through upregulation of MAPKs and Smad pathways activated BMP-2 receptor J.Cell Biochem Funct，2018，36（3）：137-146.5HU H M，YANG 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