基于CRISPR_Cas9技术的HCT-8细胞基因编辑系统构建.pdf

第 57 卷第 4 期河 南 农 业 大 学 学 报Vol.57No.42023 年8 月Journal of Henan Agricultural UniversityAug.2023收稿日期:2022-10-08基金项目:NSFC-河南联合基金重点项目(U1904203);河南省高等学校重点科研项目(22A230003)作者简介:李娜(1998),女,河南信阳人,硕士研究生,主要从事人兽共患寄生性原虫分子生物学。通信作者:李晓迎(1985),女,河南洛阳人,讲师,博士。引用:李娜,王悦欣,李孝法,等.基于 CRISPR/Cas9 技术的 HCT-8 细胞基因编辑系统构建J.河南农业大学学报,2023,57(4):632-638.DOI:10.16445/ki.1000-2340.20230418.001基于 CRISPR/Cas9 技术的 HCT-8 细胞基因编辑系统构建李娜1,王悦欣1,李孝法2,王璐阳1,梁冠达1,李俊强1,张龙现1,李晓迎1(1.河南农业大学动物医学院农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室,河南 郑州 450046;2.河南三高农牧股份有限公司,河南 固始 465200)摘要:【目的】构建人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统,实现对目的基因的高效编辑。【方法】采用慢病毒感染的方式,将慢病毒载体质粒 LentiCas9-Blast 与包装质粒 pS-PAX2 和 pMD2.G 共转染至人胚胎肾(human embryonic kidney 293T,HEK293T)细胞系获得高滴度的重组慢病毒液,并感染 HCT-8 细胞系,以未感染组为阴性对照,用杀稻瘟菌素进行抗性筛选,直至阴性对照组全部死亡;采用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆筛选,对筛选得到的单克隆细胞系进行扩大培养,并采用 PCR 及 Western Blot试验验证 Cas9 基因及其蛋白表达情况,而后对阳性单克隆细胞系进行基因 编辑 效率 及 细胞 系活 性 验证。【结果】得到能成功表达 Cas9 蛋白的 6 株 HCT-8-Cas9 单克隆细胞系。其中 HCT-8-Cas9_2 和 HCT-8-Cas9_4 细胞系蛋白量表达较高;对所筛选单克隆细胞系进行基因编辑效率检测,pXPR_011 慢病毒表达报告基因载体系统检测结果表明,HCT-8-Cas9_4 单克隆细胞系 Cas9 基因编辑效率为 48.82%,显著高于其他 HCT-8-Cas9 单克隆细胞系;单克隆细胞系活性检测结果表明,HCT-8-Cas9_2 和 HCT-8-Cas9_4 单克隆细胞系细胞活性与 HCT-8 细胞系相比均无显著差异。【结论】HCT-8-Cas9_4 细胞系能够稳定表达 Cas9 蛋白,具有良好的编辑效率,可用于后续靶标基因的高效编辑。关键词:基因编辑;慢病毒;人回盲肠癌(HCT-8)细胞;CRISPR/Cas9;基因编辑效率中图分类号:S855.9文献标志码:A文章编号:1000-2340(2023)04-0632-07Construction of HCT-8 cell gene editing system based on CRISPR/Cas9 techniqueLI Na1,WANG Yuexin1,LI Xiaofa2,WANG Luyang1,LIANG Guanda1,LI Junqiang1,ZHANG Longxian1,LI Xiaoying1(1.College of Veterinary Medicine,Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory for Quality and Safety Control of Poultry Products,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China;2.Henan Sangao Agriculture and Animal Husbandry Co.,Ltd.,Gushi 465200,China)Abstract:【Objective】This study was conducted to construct a CRISPR/Cas9 gene editing system for hu-man ileocecal adenocarcinoma(HCT-8)cell line to achieve efficient editing of target genes.【Method】With lentiviral infection,LentiCas9-Blast was co-transfected with packaging plasmids pSPAX2 and pMD2.G into human embryonic kidney 293T(HEK293T)cell line to obtain high titer recombinant chronic disease venom.The obtained high titer recombinant lentivirus was used to infect HCT-8 cells.The uninfected group was used as the negative control,and then the resistance was screened with blas-第 4 期李娜,等:基于 CRISPR/Cas9 技术的 HCT-8 细胞基因编辑系统构建633 ticidin until all the negative control groups died.The positive cells were screened by limited dilution method,and the selected monoclonal cell lines were expanded and cultured.The expression of Cas9 gene and protein was verified by PCR and Western Blot,and then the gene editing efficiency and cell lines activity of positive monoclonal cell lines were verified.【Result】We obtained six HCT-8-Cas9 monoclonal cell lines which could successfully express Cas9 protein.Among them,the protein expres-sion of HCT-8-Cas9_2 and HCT-8-Cas9_4 cell lines were higher,and then the gene editing efficiency of the selected monoclonal cell lines was detected.The results of pXPR_011 lentivirus expression re-porter gene vector system showed that the gene editing efficiency of HCT-8-Cas9_4 monoclonal cell line was 48.82%,which was significantly higher than that of other HCT-8-Cas9 monoclonal cell lines.The results of monoclonal cell lines activity assay showed that there were no significant differences in cell activity between HCT-8-Cas9_2 and HCT-8-Cas9_4 monoclonal cell lines compared with HCT-8 cells line.【Conclusion】By comparison,HCT-8-Cas9_4 cell line can stably express Cas9 protein and has good editing efficiency,which can be used for efficient editing of subsequent target genes.Key words:gene editing;lentivirus;human colorectal adenocarcinoma(HCT-8)cells;CRISPR/Cas9;gene editing efficiency成簇的有规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是一类重复的 DNA 序列,与 CRISPR 相关蛋白(Cas 蛋白)组成了 CRISPR/Cas 系统,对外来入侵的核苷酸(如噬菌体和质粒 DNA)产生免疫力1。根据所含 Cas 蛋白种类与降解外源核酸的机制不同,CRISPR/Cas 系统被分为三大类型,即型、型和型。型和型 CRISPR/Cas 系统的免疫机制相当复杂,在基因组工程中没有得到应用,而型 CRISPR/Cas 系统只需要 1 个 Cas 蛋白(Cas9 蛋 白)即 可 实 现 对 靶 标 基 因 的 编 辑2。CRISPR/Cas9 系统的靶向切割需要 3 个组分,包括Cas9 蛋白、CRISPR RNA(crRNA)和转活化 crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)3。在适应阶段,携带 1 个或多个 CRISPR 基因座的细菌和古生菌通过将外来序列(protspacers)的短片段整合到CRISPR 阵列近端的宿主染色体中来应对病毒的攻击4-5。在表达和干扰阶段,重复间隔元件转录成 前 体 CRISPR RNA(precursor crRNA,pre-crRNA)分子,然后酶切产生短的 crRNA,与入侵病毒的互补原始间隔序列配对,Cas9 蛋白与 crRNA形成复合体来指导外源序列的沉默6-11。在 Cas9蛋白结合到靶点并对靶点切割后,断裂的双键通过同源重组修复(homology directed repair,HDR)或非同源末端(non-homologous end joining,NHEJ)来进行修复12。CRISPR/Cas9 系统已经广泛应用于动物模型及体外细胞系的基因敲除或敲入13-16,进行基因编辑的 第 一 步 是 要 将 目 的 基 因 的 小 向 导 RNA(small guide RNA,sgRNA)导入到表达 Cas9 蛋白的细胞系中。但是,Cas9 蛋白是大分子,将其导入细胞是应用该系统的一大难题。研究表明,Cas9蛋白及其相关向导 RNA(guide RNA,gRNA)RNA的质粒可以被整合到病毒载体中,研究人员利用这一特点开发设计了慢病毒载体系统;慢病毒载体可以将目的基因高效地整合到宿主基因组中,也是将Cas9 蛋白导入到目的细胞系中最常用的方式17。人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系是单层贴壁细胞,广泛应用于类器官培养、癌症研究和药物毒性研究18-21,目前常用于隐孢子虫体外培养等22-23。本研究利用慢病毒感染的方式,构建稳定表达 Cas9 蛋白的 HCT-8 细胞系,为后续靶标基因的编辑奠定基础。1材料与方法1.1试验材料HEK293T 细胞系、HCT-8 细胞系均由河南农业大学农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室保存并提供。LentiCas9-Blast 质粒、pXPR_011质粒购自 Addgene 公司;慢病毒 pMD2.G、pSPAX2质粒由河南农业大学兽医生物技术学实验室馈赠;大肠杆菌 DH5 感受态细胞购自北京庄盟生物有限公司;鼠源 Cas9 单克隆抗体购自 Cell Signaling Technology 公司;HRP 标记山羊抗鼠二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、多聚赖氨酸、聚凝胺均购自北京索莱宝科技有限公司;转染试剂 Lipofectamine 2000 购自 Thermo Fish-er Scientific 公司。1.2试验方法1.2.1LentiCas9-Blast 慢病毒的包装HEK293T细胞接种至 10 cm 细胞培养皿中,接种前用 0.025 gL-1的多聚赖氨酸包被,37 放置 1 h,待细胞634 河南农业大学学报第 57 卷密度达 70%80%时进行转染。从培养箱中取出细胞培养皿至超净台内,将旧的培养基弃去,用PBS 溶液洗涤 3 次,再更换为 Opti-MEM 培养基,采 用 Lipofectamine 2000 进 行 转 染。LentiCas9-Blast、pSPAX2 和 pMD2.G 这 3 种质粒按照质粒质量比为 431 进行转染,总质粒与感染试剂质量比为 1 3,混匀后,室温(25 )静置 5 min。将已静置完的混合液逐滴缓慢加入 Opti-MEM 培养基中,继续培养 6 h 后吸去 Opti-MEM 培养基,加入 8 mL RPMI 1640 培养基(含体积分数 10%胎牛血清)继续培养。培养到 48 h 后收集上清液,保存于 4 ,同时加入 8 mL 正常培养基;培养到 72 h 再次收集上清液,并与 48 h 收集的上清液混在一起,2 000 rmin-1离心 10 min,将上清液用 0.45 m 的滤膜过滤,分装到 1.5 mL 无菌 EP 管中于-80 保存,用于后续慢病毒转导试验。1.2.2目的细胞系的获取待 HCT-8 细胞传至第 56 代,将培养瓶中的细胞均匀铺至 6 孔板中继续培养。待细胞密度达到 60%70%时,弃去旧培养基,用 PBS 漂洗 3 次,加入 1.5 mL 慢病毒液和 1 mL 含 10 mgL-1聚凝胺的 RPMI 1640 培养基(含体积分数 10%胎牛血清)培养细胞,留 1 孔作空白对照。于 37 、体积分数 5%CO2培养箱培养 24 h 后更换培养基,继续培养 48 h 后更换含15 mgL-1 杀稻瘟菌素的 RPMI 1640 培养基(含体积分数 10%胎牛血清)继续培养细胞,直至阴性对照组细胞全部死亡,采用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆筛选并扩大培养。1.2.3HCT-8-Cas9 单克隆细胞系的鉴定将挑选出的 HCT-8-Cas9 单克隆细胞提取全基因组,根据目的基因序列(Gene ID:61270322)设计引物对目标基因进行扩增,引物序列见表 1。扩增体系如下:2TSINGKE Master Mix 12.5 L,Cas9-F/R(10 m)各 1 L,基因组 DNA 2 L,补水至 25 L;扩增条件:94 预变性 2 min,94 变性 30 s,58 退火 30 s,72 延伸 l min,反应 35 个循环,72 继续延伸 7 min。在质量分数 1%琼脂糖凝胶上电泳分离。另取部分细胞进行 Western Blot 试验,用 RIPA 裂解液将细胞裂解,取裂解液进行质量分数 10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,而后转印至 0.45 m 的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜 上,恒 流 400 mA,常温转膜 30 min;将 PVDF 膜置于 5%脱脂牛奶封闭 2 h,以鼠源 Cas9 MAb(1 1 000)为一抗,4 过夜孵育后用 PBST 洗涤 3 遍,以羊抗鼠 IgG-HRP(110 000)为二抗,室温孵育 2 h,PBST 洗涤3 遍后在 PVDF 膜上滴加显色液,置于化学发光成像系统(GE AI 680)中拍照观察和图像采集,检测HCT-8 细胞系中 Cas9 蛋白的表达情况。表 1PCR 扩增所用引物序列 Table 1Primer sequences used for PCR amplification引物名称Primer name引物序列(53)Primer sequence(53)Cas9-FGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCas9-RCTTCTTTCCATGATGGTGATCCCCA1.2.4pXPR_011 慢病毒的制备及慢病毒液滴度测定慢病毒载体 pXPR_011 可用于检测 Cas9 蛋白的活性,该质粒同时含有绿色荧光蛋白(green flu-orescent protein,GFP)序列及针对 GFP 基因的 gRNA序列。细胞内 Cas9 蛋白会在 gRNA 的引导下对GFP 基因进行切割,因此细胞表达的 GFP 越少,说明 Cas9 蛋白的基因编辑效率越高,并可用流式细胞仪准确地对 GFP 阳性和阴性细胞的比例进行定量。按照 1.2.1 的步骤获得慢病毒质粒 pXPR_011 高滴度的重组慢病毒液。将 HCT-8 细胞系按 1104个孔-1接种于 96 孔板,并将获得的慢病毒液按比例稀释进行感染(1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 L),48 h 后,以未感染慢病毒液的 HCT-8 细胞为阴性对照,用 CytoFLEX 流 式细胞仪 分 析 HCT-8 细 胞 中表达 GFP 的细胞比例。病毒滴度/(TUmL-1)=(初始感染细胞数GFP 阳性细胞比例)/(病毒体积)1 00024-25。1.2.5HCT-8-Cas9 单克隆细胞系基因编辑效率检测将 HCT-8 和 HCT-8-Cas9 单克隆细胞系按1105个孔-1接种于 6 孔板,并用 pXPR_011 慢病毒液以 MOI=0.8 分别进行感染,以确保每个细胞都被 1 个 pXPR_011 慢病毒颗粒感染,48 h 后更换含 2 mgL-1 嘌呤霉素的 RPMI 1640 培养基,之后 2 d 更换 1 次含 2 mgL-1嘌呤霉素 RPMI 1640培养基,同时观 察 GFP 的表 达 情 况。未 处 理 的HCT-8 细胞 系 作 为 阴 性 对 照,感 染 慢 病 毒 液 的HCT-8 细胞系作为阳性对照,筛选 7 d 后,用 Cyt-oFLEX 流 式 细 胞 仪 对 上 述 试 验 组 进 行 分 析,用SPSS 24.0 对基因编辑效率进行计算及统计学分析,以平均数标准差表示。1.2.6HCT-8-Cas9 单克隆细胞系细胞活性验证将 Cas9 蛋白表达量较高的 HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_4 单克隆细胞系以及 HCT-8 细胞系分别以 1104个孔-1接种于 96 孔板,每组设置 6 个重复,培养 24 h 后更换为 10 L CCK-8 试剂和 90 L 含体积分数 10%胎牛血清 RPMI 1640 培养基的混合液,继第 4 期李娜,等:基于 CRISPR/Cas9 技术的 HCT-8 细胞基因编辑系统构建635 续培养 2 h 后用酶标仪检测吸光度在 450 nm 时的数值,并用 Graph Pad Prism 9 进行统计分析。2结果与分析2.1HCT-8-Cas9 单克隆细胞系的筛选将 HCT-8-Cas9 细胞接种到 96 孔板中,采用有限稀释法使每孔接种 1 个细胞,培养 7 d,在显微镜下观察每孔中细胞生长情况,共筛选出 8 株单克隆细胞系,从中选取能成功表达 Cas9 蛋白的 6 株进行扩大培养,分别命名为 HCT-8-Cas9_1、HCT-8-Cas9 _ 2、HCT-8-Cas9 _ 3、HCT-8-Cas9 _ 4、HCT-8-Cas9_5、HCT-8-Cas9_6。2.2PCR 试验检测 Cas9 基因的整合情况收集筛选的 6 株单克隆细胞系,分别取少量细胞提取基因组,用 Cas9-F、Cas9-R 引物进行 PCR扩增以检测目的基因的整合情况。如图 1 所示,扩增基因大小为 738 bp,6 株单克隆细胞系均可以扩增出与预期大小相符的基因片段,表明 Cas9 基因已成功整合到 HCT-8 细胞基因组上。2.3Western Blot 试验检测 Cas9 蛋白表达情况用 RIPA 裂解缓冲液提取 HCT-8-Cas9 单克隆细胞 总 蛋 白,并 以 HCT-8 细 胞 裂 解 液 为 对 照。Western Blot 结果显示,HCT-8-Cas9_2 和 HCT-8-Cas9_4 细胞系的 Cas9 蛋白表达水平较高(图 2),表明这 2 个细胞系比较适合后续 HCT-8 细胞系Cas9 蛋白基因编辑效率的检测。2.4pXPR_011 慢病毒滴度的测定结果将稀释的 pXPR_011 慢病毒液分别感染 1 104个 HCT-8 细胞系,48 h 后,以未感染慢病毒液的 HCT-8 细胞为对照,分析 HCT-8 细胞中表达绿色荧光蛋白细胞比例。如图 3 所示,用 25 L 慢病毒液进行感染时,表达绿色荧光蛋白的细胞比例20.1%。在 此 基 础 上 计 算 该 慢 病 毒 液 滴 度 为4.02105 TUmL-1,用于后续感染复数(multiplic-ity of infection,MOI)的计算。M:Marker;1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6;7:对照;8:HCT-8 细胞;9:H2O。M:Marker;1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6;7:Control;8:HCT-8 cell;9:H2O.图 1PCR 试验检测 Cas9 基因的整合Fig.1PCR to detect the integration of Cas9 gene1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6.图 2Western Blot 试验检测 Cas9 蛋白的表达Fig.2Western Blot to detect the expression of Cas9 protein图 3pXPR_011 慢病毒液滴度测定流式细胞仪分析结果Fig.3Using flow cytometry to analyse the titer determination of pXPR_011 lentivirus liquid636 河南农业大学学报第 57 卷2.5HCT-8-Cas9 单克隆细胞系基因编辑效率检测结果将获得的 pXPR_011 重组慢病毒液以 MOI=0.8 的剂量分别感染 HCT-8 和 HCT-8-Cas9 细胞系,7 d 后,利用流式细胞仪 CytoFLEX 对样本进行分析。如表 2 所示,HCT-8-Cas9_4 细胞系表达的GFP 较少,加入 25 L 慢病毒液时,表达绿色荧光蛋白 的 细 胞 占 20.1%,Cas9 基 因 编 辑 效 率 为48.82%,显著高于其他 5 株 HCT-8-Cas9 细胞系(p0.05),这表明 HCT-8-Cas9_4 单克隆细胞系在后续的敲除中可以发挥更为高效作用。表 2HCT-8-Cas9 单克隆细胞系基因编辑效率结果Table 2Results of gene editing efficiency of HCT-8-Cas9 monoclonal cell lines%细胞系名称 Cell line nameHCT-8-Cas9_1HCT-8-Cas9_2HCT-8-Cas9_3HCT-8-Cas9_4HCT-8-Cas9_5HCT-8-Cas9_6基因编辑效率 Gene editing efficiency 30.281.44 e45.070.75 b36.562.72 c48.820.87 a37.081.37 c32.470.91 d注:不同小写字母表示差异显著(p0.05)。Note:Different lowercase letters mean significant difference(p0.05),表明稳定表达 Cas9 蛋白对 HCT-8 细胞的活性无显著影响,且能在 HCT-8细胞中稳定表达。ns 表示无显著差异(p0.05)。ns means no significant difference(p0.05).图 4稳定表达 Cas9 蛋白的 HCT-8 细胞系的细胞活性检测结果Fig.4Determination of cell viability of HCT-8 cell line stably expressing Cas9 protein3结论与讨论 基因编辑技术能够对基因组 DNA 进行精准修饰,近年来得到迅猛发展。目前,只有 3 种技术可用于靶向基因编辑,即锌指核酸酶(zinc-finger nu-cleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(tran-scription activator-like effector nucleases,TALEN)及CRISPR/Cas9 技术26-27。相较于其他 2 种基因编辑技术,CRISPR/Cas9 技术只需要设计和目标核酸对应的 RNA 序列,便可对哺乳动物等细胞基因组进行精准修饰,具有高效、简便且便宜等特点,因此被 广 泛 应 用 于 筛 选 和 鉴 定 功 能 基 因28。在CRISPR/Cas9 技术出现之前,RNA 干扰(RNAi)技术被应用于功能基因的筛查29-31。但该技术不能完全抑制基因表达而导致假阳性32-33,影响对基因功能的正确判断。CRISPR/Cas9 技术能够在基因组中进行编辑,既能避免 RNA 干扰技术抑制不彻底的情况,也能在不同物种和不同细胞中进行,具有其他技术手段不可比拟的优势34。SHALEM等35首次在人体细胞内成功用 CRISPR/Cas9 系统完成了基因编辑。该发现给 CRISPR/Cas 系统带来了巨大变革。HCT-8 细胞应用广泛且易于培养,是类器官培养、高通量筛选、药物毒性研究和寄生虫培养等重要载体。本研究建立 HCT-8 细胞系的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统,对于保证后续靶标基因的高效敲除,以及筛选具有高切割效率的 HCT-8-Cas9单克隆细胞系至关重要。为了保证单克隆细胞系来源于同一细胞克隆,采用有限稀释法分选,共筛选出 8 株 HCT-8-Cas9 单克隆细胞系,但有 2 株没有检测到 Cas9 蛋白的表达,因此从中选取 6 株能稳定表达 Cas9 蛋白的细胞系进行扩大培养。为了验证所挑选细胞系的基因编辑效率,以 MOI=0.8的 pXPR_011 慢病毒液感染单克隆细胞系,并通过流式细胞仪进行检测,结果表明 HCT-8-Cas9_4 的基因编辑效率在第 7 d 达到 48.82%,与张纪文第 4 期李娜,等:基于 CRISPR/Cas9 技术的 HCT-8 细胞基因编辑系统构建637 等36和覃鸿妮等37所构建的 CRISPR/Cas9 基因编辑细胞系相比效率偏低,可能与基因插入位点及细胞系类型有关。下一步可通过对单克隆细胞系二次单克隆化进一步提高其编辑效率。对 HCT-8-Cas9 单克隆细胞系活性进行检测,结果显示 HCT-8-Cas9_2 和 HCT-8-Cas9_4 与 HCT-8 细胞活性均无显著差别。这表明,HCT-8-Cas9_4 为本试验获取的最优单克隆细胞系,能稳定表达 Cas9 蛋白,并具有良好的基因编辑效率,为后续靶标基因的编辑奠定基础。参考文献 References:1 WIEDENHEFT 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