活血荣络丸Ⅱ指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析.pdf

年 月第 卷 第 期 湖南师范大学自然科学学报 ，引用格式：谢舒婷，闵可，刘粲迪，等 活血荣络丸指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析 湖南师范大学自然科学学报，（）：，（）：活血荣络丸指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析谢舒婷，闵可，刘粲迪，李海，陈诗丽，马铭，涂海军，周德生，陈波（湖南师范大学化学化工学院，植化单体开发与利用湖南省重点实验室，中国 长沙 ；湖南中医药大学第一附属医院，中国 长沙 ；湖南大学生物学院，中国 长沙 ）摘要目的：建立复方制剂活血荣络丸中与脑神经活性相关的 种指标性成分的定性定量分析方法。方法：使用 色谱柱（，）和 甲酸水（）甲酸乙腈（）为流动相，进行梯度洗脱。首先利用三重四极杆 串联质谱（）对活血荣络丸中马钱苷、巴利森苷 、绿原酸、芍药内酯苷、肉桂酸、细辛醚、芍药苷和异欧前胡素等 种指标成分进行质谱定性确证。再采用蒸发光散射检测器（）测定巴利森苷 的含量，用二极管阵列检测器（）对剩余 种成分进行含量评估。结果：种成分的质谱信息与对照品相吻合，线性关系良好，且精密度、重复性和稳定性 均小于 ，加标回收率在 。结论：建立的定量方法简单快速、准确，可以为复方制剂活血荣络丸的质量控制提供参考。关键词活血荣络丸；复方制剂；液相色谱法；质量控制中图分类号 ；文献标识码 文章编号 （），（，；，；，）：（，）（）（），（）收稿日期：基金项目：湖南省重点研发计划项目（）；国家自然科学基金项目（，）通信作者：涂海军，博士，教授，博士生导师，研究方向：神经生物学与遗传学，；周德生，博士，教授，博士生导师，研究方向：中医内科学，；陈波，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药分离分析方法，：。（），（）：，（）（）（），（），：，；荣气虚滞、阴阳失衡是脑卒中的主要发病机制，发病可虚可滞，甚则两者相兼为病 ，发病初期治疗以活血荣络丸尤为适宜。活血荣络丸为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，是基于已有活血荣络方配方基础上 ，依据中医荣气虚滞病机制进行配伍调整后形成的治疗缺血性中风的中成药，由忍冬藤（）、玄参（）、天麻（）、木瓜（）、石菖蒲（）、桃仁（）、白芷（）和赤芍（）味中药按质量比 配伍而成（未掺杂辅料）。诸药合用，使气血通调，阴阳持衡，祛除痰瘀夹杂之邪，达到养阴活血、祛风化痰、化瘀通络的功效 。因而活血荣络法可贯穿缺血性中风治疗的全过程。活血荣络丸活性成分复杂，尚无成分定量方法及成分含量结果，然而，检测其成分含量，进而对其进行质量控制是保证其用药有效性的关键。本研究参照活血荣络丸中各药材活性成分的质量控制方案 ，提出了以马钱苷、绿原酸、芍药内酯苷、肉桂酸、异欧前胡素、巴利森苷 、细辛醚和芍药苷作为其质量控制指标的策略，建立了高效液相色谱二极管阵列检测器 蒸发光散射检测器（）同时测定活血荣络丸中 种指标性成分的方法，并研究各成分的分离行为、抗干扰及定量能力，对复方制剂活血荣络丸中的典型 种活性物质进行含量评估，加以紫外光谱纯度鉴定，以及串联质谱 多反应监测模式质谱确证，以便为医院制剂的质量控制提供研究思路和依据。实验部分 仪器 高效液相色谱 质谱仪（日本岛津公司）、高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）、万分之一天平（日本岛津公司）、大功率（，）超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）和 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。材料对照品异欧前胡素（批号：，纯度 ）、绿原酸（批号：，纯度 ）、巴利森苷（批号：，纯度 ）、肉桂酸（批号：，纯度 ）、芍药苷（批号：，纯度 ）、芍药内酯苷（批号：，纯度 ）、马钱苷（批号：，纯度 ）和 细辛醚（批号：，纯度 ）均购自成都克洛玛生物科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯，均购自北京伊诺凯科技有限公司（中国，北京）；实验用水使用 自动双重纯水蒸馏器制得。活血荣络丸（批号：和 ）、忍冬藤、玄参、天麻、木瓜、石菖蒲、遳桃仁、白芷和赤芍饮片及此八味药材对应配方颗粒均从湖南中医药大学第一附属医院获得，经湖南中医药大学第一附属医院周德生教授鉴定，均为 年版中国药典收载正品。方法 液相色谱和质谱测定条件色谱条件如下：色谱分离在色谱柱 （，）上进行。进样量为 ，柱温 ，流动相由 甲酸水（）甲酸乙腈（）组成，体积流量为 。梯度洗脱程序为 湖南师范大学自然科学学报第 卷谢舒婷等：活血荣络丸指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析 ，；，；，；，；，。各成分在 内分离良好。质谱条件如下：电喷雾离子源（），毛细管电压 ，去溶剂气温度 ，去溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，雾化气流量为 ，加热气流量为 ，接口温度 ，干燥气流量 ，扫描方式为多反应监测（）。溶液的制备 对照品溶液的制备称定绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚、异欧前胡素对照品适量于烧杯中，加甲醇溶解，分别定容于 个 容量瓶中，配置成质量浓度分别为 ，及 的单一对照品溶液。供试品溶液制备将复方制剂活血荣络丸用万能粉碎机粉碎成粉末，过 筛后称定 于 离心管 中，加入 甲醇，超声 。样品溶液以 离心 ，取上清液过 有机滤膜，即得活血荣络丸提取液。依据活血荣络丸配伍之比，分别称取忍冬藤、玄参、天麻、木瓜、石菖蒲、桃仁、白芷和赤芍 味中药饮片 ，于同一离心管 中，再分别称取 味中药对应的配方颗粒 ，于同一离心管 中，在离心管 和 中分别加入 甲醇，超声 ，以 离心 ，取上清液过 有机滤膜，即得到 味中药饮片加和后的提取液和 味中药对应的配方颗粒加和后的提取液。结果与讨论 测定指标的选定通过对各原料中神经药理活性相关成分的文献分析，证实 细辛醚可减轻缺血再灌注诱导的脑细胞自噬 ；芍药苷可通过抑制 与 活化，减少小胶质细胞激活，抑制神经元焦亡，改善 介导的神经功能损伤 ；巴利森苷类化合物可通过减轻氧化应激和炎症反应改善脑缺血大鼠脑组织损伤 ，经由静脉滴注进入人体后，即刻分解为天麻素，并快速穿透血脑屏障，增强外周血管顺应性 。总之，选择与活血荣络丸养阴活血、祛风化痰、化瘀通络的功效联系紧密的 种化合物 ，即绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚和异欧前胡素作为活血荣络丸的质量控制指标。波长的选择通过紫外二极管阵列检测器（）测定，种化合物的最大吸收波长集中在 ，见图 。由于活血荣络丸中成分种类复杂，色谱峰分离较为困难，在低波段区基线波动较大，而 种待测成分在 处紫外吸收较弱，响应不高，不利于准确定量分析。为此，测定了 种不同波长下活血荣络丸的色谱对比图（图 ）。为保证基线平稳、待测成分响应值高、色谱峰干扰少，本实验采用 的波长通道。由于巴利森苷 在 处吸收较弱，为保证测定结果的准确性，本实验最终以 作为检测器单独对巴利森苷 进行定量检测，而活血荣络丸中其余 种化合物仍采用二极管阵列检测器在 波长下进行含量测定。总之，在该方法下 个目标物峰形良好，分离度、对称因子和拖尾因子等均符合定量要求。供试品制备考察为制备供试品，分别对不同提取时间、不同提取方式、不同提取溶剂和不同料液比进行比较，见图 。图 表明，由于极性各不相同，用乙腈、乙酸乙酯和丙酮等非极性溶剂无法充分提取芍药苷、绿原酸等极性成分，而以甲醇作为溶剂超声提取供试品 时，能最大程度提取出活血荣络丸中的 种待测成分。随着取样量的增加，峰面积均呈相应比例的增加，峰面积与取样量之比差异较小，因此 个取样量均可作为供试品的制备量。考虑到检测方法的耐用性，取样量应具有一定波动范围，故固定活血荣络丸提取料液比为 。活血荣络丸中 个指标成分的紫外光谱及质谱信息确证活血荣络丸成分复杂，难以对其中的指标性成分进行准确定量分析。为考察定量方法的准确性，本研究采用 多反应监测模式，对比对照品与实际样品中 种成分的定性离子对、保留时间及紫外光谱图对活血荣络丸中的待测成分进行纯度确证。结果表明，活血荣络丸中 种成分与对应对照品的紫外光谱信息（见图 ）基本吻合，证明待测定的 种指标成分中无其他杂峰干扰含量测定结果。第 期此外，选择 种对照品的准分子离子作为母离子，质谱响应最强的碎片离子作为子离子，即为一对定性离子对，成功对活血荣络丸中 种待测物进行质谱确证。在图 中，种待测物均在相对应的对照品同样保留时间出峰。因此，基于紫外光谱与质谱信息双重结果均证实了活血荣络丸中 种待测目标成分，且出峰位置处无其他化合物干扰测定，保证了定量方法的准确性。图 种指标化合物紫外光谱信息 图 不同波长下样品色谱图 方法学考察 方法专属性实验考察精密取甲醇、供试品溶液（批号 ）、各单一对照品混合溶液、八味原料饮片加和溶液、八味原料配方颗粒加和溶液各 ，分别用液相色谱测定。活血荣络丸、各单味中药饮片及其配方颗粒中与对照品对应的保留时间处皆有出峰，溶剂空白处则未出现相应峰，这再次表明活血荣络丸中其他杂质成分对以上 种指标成分的测定无干扰，结果见图 。线性关系、检测限和定量限考察取“”项下对照品溶液，其中绿原酸、马钱苷各 ，逐级稀释至 ，及 ；芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 各 ，逐级稀释至 ，及 ；肉桂酸、异欧前胡素各 ，逐级稀释至 ，及 ；细辛醚由 逐级稀释至 ，和 ；以上溶液各平行配制 组，分别吸取 进液相色谱分析。分别以信噪比（）为 和 的情况下考察方法的检测限和定量限，由表 可知，种化合物的定量限均低于各自的线性最低点，证明了该方法测定的可行性。此外，以对照品溶液的浓度（）与其对应峰面积（）进行线性回归，种对照品在线性范围内线性关系均良好（回归系数 均大于 ）。湖南师范大学自然科学学报第 卷谢舒婷等：活血荣络丸指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析 绿原酸（）；马钱苷（）；芍药内酯苷（）；芍药苷（）；巴利森苷 （）；肉桂酸（）；细辛醚（）；异欧前胡素（）图 供试品制备条件考察：超声时间（）、提取方式（）、提取溶剂（）和料液比（）：（），（），（），（）绿原酸（）；马钱苷（）；芍药内酯苷（）；芍药苷（）；巴利森苷 （）；肉桂酸（）；细辛醚（）；异欧前胡素（）图 活血荣络丸中 种目标成分与对照品质谱信息、紫外液相色谱保留时间的对比 精密度考察精密吸取供试品溶液 ，在前述已优化的最佳色谱条件下连续进样 次。绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚和异欧前胡素峰面积 值分别为 ，及 。值均在 以内，表明该方法的精密度良好。稳定性考察取同一供试品溶液于室温下分别放置 ，及 ，在前述已优化的最佳色谱条第 期件下分别进样 ，记录色谱峰面积。绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚和异欧前胡素峰面积 值分别为 ，及 。值均在 以内，表明活血荣络丸提取液在 内稳定性良好。绿原酸（）；马钱苷（）；芍药内酯苷（）；芍药苷（）；巴利森苷 （）；肉桂酸（）；细辛醚（）；异欧前胡素（）图 空白溶剂、混标溶液、样品溶液、八味原料饮片加和溶液及八味配方颗粒加和溶液的 图，包括 （）和 （）两种检测器 ，（）（）表 种指标化合物标准曲线、线性范围及检测限、定量限 ，化合物线性范围（）回归方程回归系数（）值（）值（）绿原酸 马钱苷 芍药内酯苷 芍药苷 巴利森苷 肉桂酸 细辛醚 异欧前胡素 重复性考察平行制备同一批供试品溶液 份，分别进样 。绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚和异欧前胡素含量的平均值为 ，及 ，峰面积 值分别为 ，。值均在 以内，表明该方法重复性良好。准确度考察精密称取 样品 份，根据“”项下各成分含量结果，加入相应量的对照品，加入 甲醇，超声 ，样品溶液以 离心 ，取上清液过 有机滤膜，然后进行液相色谱分析，记录各成分峰面积并计算其加样回收率。绿原酸、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、巴利森苷 、肉桂酸、细辛醚和异欧前胡素含量的平均回收率分别为 ，和 。平均回收率范围在 ，表明该方法准确度良好。样品测定平行制备两批样品供试品溶液各 份，并将批号为 的供试品溶液浓缩 倍至各待测物的线性范围内，按上述条件用高效液相色谱进行测定，计算其平均含量，结果见表 。结果表明活血荣络丸中各批次之间 种指标成分的含量存在较大差异，这可能是在其制备的过程中，选用了不同产地的中药原料，或者是生产流程中由于工艺造成了部分活性成分损失，这为后期大批量生产活血荣络丸带来了挑战。总之，该方法成功实现了对中药复方制剂活血荣荣络丸主要指标成分的含量评估，可为制剂的质量控制提供参考。湖南师范大学自然科学学报第 卷谢舒婷等：活血荣络丸指纹图谱的成分鉴定和多成分定量分析表 两个批次样品含量测定结果单位：指标化合物批号 绿原酸 马钱苷 芍药内酯苷 芍药苷 巴利森苷 肉桂酸 细辛醚 异欧前胡素 结论活血荣络丸可贯穿缺血性中风治疗的全过程，对治疗脑卒中及预防并发症有一定意义。本实验初步建立了活血荣洛丸的多成分定量分析质量控制方法，从现代药理角度对其进行质量评估提供了参考数据。未来还需要进一步验证活血荣络丸的有效成分，是否真正能对脑神经的药理活性起到调节作用。总之，本文建立的色谱质谱联用技术检测中药有效成分的方法，抗干扰能力强，结果准确可靠，可为复方制剂的质量控制提供研究思路和依据。参考文献：周德生，陈湘鹏，胡华，等 脑梗死荣气虚滞病机特征之探讨 中西医结合心脑血管病杂志，（）：，杨仁义，颜思阳，周德生，等 基于 调控 传导轴探讨活血荣络方促脑梗死后血管新生的机制 中草药，（）：杨仁义，刘利娟，康蕾，等 基于网络药理学的活血荣络方对脑梗死血管新生作用机制研究 中国中医药信息杂志，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典：一部 北京：中国医药科技出版社，文诗泳，谭伟民，龚力民，等 中药忍冬藤资源与质量控制的研究进展 中南药学，（）：柳梦婷，方婧，吴宏伟，等 高效液相色谱法同时检测石菖蒲中 细辛醚、细辛醚的含量 中国实验方剂学杂志，（）：肖冰梅，裴刚，曾夷 法测定不同产地玄参的肉桂酸含量 中华中医药学刊，（）：李俊婕，刁飞燕，胡德福，等 高效液相色谱法测定天麻中 种成分含量 药学研究，（）：付士朋，沈宏伟，王谦博，等 不同采收期赤芍中 种有效成分的含量测定及其变化规律研究 中国药房，（）：马开，秦文杰 测定痛可停胶囊中欧前胡素和异欧前胡素含量 中成药，（）：杨玉军，孙爱萍，刘琪，等 天麻钩藤合剂质量标准的研究 中南药学，（）：，（）：祖力菲亚艾克木，麦合莆热提乌莆尔，邢辉辉，等 芍药苷对急性脑梗死大鼠小胶质细胞激活调节的神经元焦亡的作用 脑与神经疾病杂志，（）：，：田紫平，肖慧，冯舒涵，等 天麻有效成分巴利森苷的降解规律分析 中国实验方剂学杂志，（）：张秀云 天麻素注射液治疗脑梗塞的临床探讨 系统医学，（）：，（）：周德生，刘利娟，寇志刚，等 活血荣络片对大脑中动脉缺血模型大鼠脑组织微囊蛋白 表达的影响 河北中医，（）：，（编辑）第 期