柿子酵素发酵过程中活性成分及其抗氧化性能的研究_田文静.pdf

59 北京农业职业学院学报Journal of Beijing Vocational College of Agriculture第37卷 第4期2023年7月Vol.37 No.4July 2023柿子原产于中国，是中国重要的特色水果之一，成熟的柿子色泽鲜艳、香甜多汁、风味独特，深受国人喜爱。同时，柿子富含多种功能成分，如多酚类、黄酮类、丹宁类、氨基酸、维生素、矿物质等1，极具保健功能，对维持机体稳态具有重要促进作用。研究表明，柿果中富含的多酚类物质具有抗氧化活性，可有效预防动脉粥样硬化、心脑血管等疾病2；柿果的特征成分单宁具有抗氧化、降血脂、预防动脉粥样硬化等多种保健功能3。这为柿子及其相关功能食品的开发应用提供了参考。【基金项目】国家自然科学基金资助项目(32001826)；北京农业职业学院科研项目(XY-YF-21-04)；北京农业职业学院首席专家团队项目(XY-TD-22-04)；特色高水平院校建设项目打造技术创新平台食品营养与安全应用技术协同创新中心（11000022T000000444768）【收稿日期】2023-02-20【作者简介】田文静（1992 ），女，内蒙古乌兰察布人，北京农业职业学院食品与生物工程系讲师，硕士。研究方向：功能性食品研究与开发。*通信作者：马长路。柿子酵素发酵过程中活性成分及其抗氧化性能的研究田文静1，武亚帅2，程雪华1，马长路1*(1.北京农业职业学院，北京 102442；2.北京工商大学，北京 100048)【摘 要】为研究柿子酵素发酵过程中的代谢产物及其抗氧化性能的变化规律，对发酵过程中活性成分进行分析。结果表明，发酵液的pH值随发酵时间的延长逐渐降低，而总酸含量不断升高；可溶性固形物含量随发酵时间的延长持续下降，并在发酵4 d后趋于稳定；总酚和黄酮含量呈总体呈上升趋势，发酵结束时分别达到2.360.05 mg/mL和0.580.01 mg/mL；SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力在发酵6 d后达到最大值，分别为241.586.80、65.434.90、4.180.07、6.330.12 U/mL；抗氧化能力呈现迅速升高后趋于平缓的趋势，经过 6 d 发酵，柿子酵素中 DPPH、OH、ABTS+、O2-清除率分别为 90.12%1.85%、45.44%1.42%、94.73%1.00%、88.63%2.11%，说明乳酸菌发酵大幅度提升了柿子酵素的抗氧化能力，相关性分析结果显示，柿子酵素的抗氧化性能与总酚、黄酮和 SOD 的含量显著相关（P0.05）。【关键词】柿子酵素；代谢产物；活性成分；抗氧化性【中图分类号】TS252.42 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7252（2023）04-0059-08DOI:10.19444/ki.1671-7252.2023.04.001 60 北京农业职业学院学报 2023 年 第 4 期如今，人们对食品的需求发生了深刻转变，在关注食品风味品质的同时，愈发关注食品的功能品质。因而，具有保健功效的食品日益受到人们的关注与青睐。其中，酵素因其富含益生成分和独特的口感，逐渐成为人们关注的焦点。酵素是由一种或者多种动物、植物、菌类等日常生活中的食用原料经过多种益生菌发酵产生的含生物活性成分的产品4，其含有丰富的维生素、矿物质、酶、抗氧化物质等营养成分，具有抗氧化、保护心血管、调节肠道菌群、控制肥胖、解毒等多种保健功能5。姜峰等对青梅酵素的抗氧化性能进行分析，结果表明，发酵过程中青梅酵素对OH、O2-、DPPH、ABTS+的清除能力均显著提升，且清除率与总酚和黄酮含量显著相关(P0.01)6。但目前柿子酵素产品开发度较低，对其发酵过程的监控研究尚未系统展开。因此，本文以柿子酵素为研究对象，探究发酵时间对代谢产物及其抗氧化性能的影响，为构建柿子酵素的综合评价体系及柿子的高值化利用和精深加工提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂房山磨盘柿，购于北京市房山区张坊镇农户；乳酸菌复合发酵剂，购于安琪酵母股份有限公司；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒、-淀粉酶(AMS)测试盒（淀粉-碘比色法）、ABTS 自由基清除能力测定试剂盒、DPPH 自由基清除能力测定试剂盒、羟基自由基清除能力测定试剂盒、超氧阴离子清除能力检测试剂盒，购于索莱宝科技有限公司；0.22m 醋酸纤维酯微孔滤膜，购于北京百奥莱博科技有限公司。1.2 仪器与设备BSA2202S 电子天平，购于德国赛多利斯公司；Y933 破壁机，购于九阳股份有限公司；恒温水浴锅，购于国华电器有限公司；超净台，购于苏州赛鸿泰净化科技有限公司；恒温培养箱，购于天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C 型 pH 计，购于雷磁上海仪电科学仪器有限公司；PAL-HIKARi 5 手持糖度仪，购于爱宕科学仪器有限公司；UV-2600 紫外分光光度计，购于岛津仪器有限公司。1.3 试验方法1.3.1柿子酵素制备选取成熟饱满的柿子，先将柿子清洗沥干水分，采用温水浸泡法进行脱涩（即将沥干水分后的柿果浸泡在温度为40 45的清洁温水中 24 h，以脱去涩味），再用 75%酒精均匀喷洒，密封放置24 h，进行脱涩；脱涩后，加水打浆（加水量为柿子质量的 2 倍），同时加入 0.4%的Vc，制备成柿子浆；然后添加白砂糖，调整糖度至 10%；采用巴氏杀菌去除杂菌；接种乳酸菌复合发酵剂（接种量为 0.1%）于 30 条件下发酵 6 d，其中，乳酸菌复合发酵剂包括植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球菌，活菌数的 比 值 依 次 为 1:2:1:3，且 菌 粉 的 活菌数为 1 0101 011 CFU/g；发酵结束后，采用 100 目筛对柿子发酵液进行过滤，除去滤渣，分离出柿子酵素发酵原液；最后使用 0.22m 醋酸纤维酯微孔滤膜对柿子酵素发酵原液进行过滤除菌，即得柿子酵素成品。具体过程见图 1。1.3.2理化指标检测pH 值：使用精密 pH 计进行测定。61 田文静，等：柿子酵素发酵过程中活性成分及其抗氧化性能的研究总酸：参照 GB 12456-2021 食品中总酸的测定进行柿子酵素总酸含量测定。可溶性固形物含量：使用手持糖度仪测定不同发酵时间柿子酵素样品的可溶性固形物含量。1.3.3生物活性成分测定黄酮含量的测定：参照 NY/T 3903-2021的方法，采用分光光度法测定柿子酵素发酵过程中黄酮含量的变化，为准确测定黄酮含量，本研究在 200550 nm 对柿子酵素液进行吸光度测定，最终确定柿子酵素液中黄酮的最佳吸收波长为 510 nm。分别吸取芦丁标准储 备 液（1.00 mg/mL）0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 于 10 mL 比色管中，加入 4.00 mL 无水乙醇摇匀，加入 0.5 mL NaNO2溶液（50 mg/mL）摇匀静置5 min，加入Al(NO3)3溶液（100 mg/mL）0.5 mL 摇匀，静置5 min后，加入NaOH溶液（40 mg/mL）2.0 mL摇匀，最后用乙醇溶液定容，得到浓度为0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/L的系列标准溶液，在波长 510 nm 处测定吸光度，以芦丁浓度（mg/L）作为横坐标，吸光度值(A)作为纵坐标，绘制标准曲线。准确吸取酵素液 1.0 mL 于 10 mL 试管中，加入 4.00 mL 无水乙醇，后续操作步骤同上，最后根据标准曲线计算酵素液中的黄酮含量。总酚含量的测定：参照 T/GZCX 020-2022 的方法，采用福林-酚法对柿子酵素发酵体系的总酚含量进行测定，为准确测定总酚含量，本研究在 300900 nm 对柿子酵素液进行吸光度测定，最终确定柿子酵素液中总酚的最佳吸收波长为760 nm。准确配制浓度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/mL的没食子酸系列标准溶液，分别量取 1.0 mL没食子酸标准溶液于 25 mL 刻度试管中，加 1.0 mol/L Folin-Phenol 试剂 1.0 mL，摇匀后静置 5 min，再加入 12%碳酸钠溶液 2.0 mL，加水定容至刻度线，30水浴加热 90 min，在 760 nm 处测定吸光度。以 25 mL 溶液中没食子酸质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。量取1.0 mL酵素液于25 mL刻度试管中，后续操作步骤同上，最后根据标准曲线计算酵素液中的总酚含量。1.3.4功效酶活性测定SOD 活性测定参照总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒的操作步骤进行；淀粉酶活性测定参照-淀粉酶(AMS)测试盒（淀粉-碘比色法）的操作说明进行。蛋白酶活性测图 1 柿子酵素制备工艺乳酸菌复合发酵剂柿子酵素成品发 酵接 种灭 菌调 糖（调整糖度至 10）加水打浆（柿果肉 水=1：2，质量比）过滤除菌柿子预处理（挑选、清洗）脱涩：%62 北京农业职业学院学报 2023 年 第 4 期定依照 SB/T 10317-1999 蛋白酶活力测定法；脂肪酶活性的测定依照 GB/T 23535-2009脂肪酶制剂中的第一法（电位滴定法）。1.3.5抗氧化能力测定OH、O2-、DPPH、ABTS+的 清除能力测定均参照相应试剂盒的操作说明。1.3.6数据处理数据采用 IBM SPSS Statistics 软件进行处理分析，结果以 XSD 表示，P0.05 为差异显著。2 结果与分析2.1 柿子酵素发酵过程中 pH 值与总酸的变化柿子酵素发酵过程中，pH 值与总酸含量的变化如图 2 所示。图 2 柿子酵素发酵过程中 pH、总酸含量变化随着发酵的进行，发酵液的 pH 值持续降低，而总酸含量不断增加，且发酵前 4 d变化幅度较大。经过 6 d 发酵，柿子酵素的 pH 值从 4.790.03 降至 3.590.03，总酸含量由最初的 0.010.01 g/100 mL 增至0.860.02 g/100 mL。原因是发酵前期，乳酸菌大量繁殖、代谢活跃，利用柿子浆中的糖作为碳源进行发酵，产生 CO2及乙酸、乳酸等有机酸，致使发酵液总酸含量增加、pH 值降低7。而发酵体系中有机酸种类及含量的增加，可抑制部分有害菌生长，同时形成柿子酵素的独特风味8。发酵 4 d 之后，pH 值和总酸含量变化均趋于平缓，推测是因为发酵后期营养物质基本被消耗殆尽，微生物代谢缓慢，仅将有机酸等替代碳源维持生命活动，故总酸含量有微弱降低。付龙威等发现枇杷酵素自然发酵50 d后，部分有机酸（如乳酸、乙酸等）被微生物分解，导致其可滴定酸度下降9。2.2 柿子酵素发酵过程中可溶性固形物含量的变化可溶性固形物含量直接影响到酵素产品的口感、风味及品质，是酵素发酵过程中需要监测和控制的重要参数。在一定范围内，可溶性固形物作为碳源可促进发酵液中的乳酸菌大量繁殖，有利于柿子酵素发酵，若含量太低，则发酵不完全，酵素产品口感酸涩、风味不佳；但如果含量太高，则导致发酵体系渗透压增大，可能造成乳酸菌失水收缩，进而抑制其生长繁殖，不利于发酵的进行10。随着发酵的进行，柿子酵素中可溶性固形物含量不断降低，并于 4 d 后趋于稳定；整个发酵周期，柿子酵素的可溶性固形物含量从17.83%0.09%降低至6.81%0.28%。发酵初期，发酵体系中营养充足、环境适宜，乳酸菌迅速繁殖，大量利用碳水化合物，使发酵液中可溶性固形物含量急剧下降，直至 4 d 后，主发酵过程结束，可溶性固形物含量变化趋于稳定，而 6.81%的可溶性固形物也可为柿子酵素产品提供良好的风味和感官特性，如图 3 所示。图 3 柿子酵素发酵过程中可溶性固形物含量变化%63 田文静，等：柿子酵素发酵过程中活性成分及其抗氧化性能的研究2.3 柿子酵素发酵过程中生物活性成分的变化柿子中的酚类和黄酮类物质种类多样、含量丰富，是良好的天然抗氧化剂。发酵过程中总酚和黄酮含量的变化如图 4 所示。图 4 柿子酵素发酵过程中总酚、黄酮含量变化由图 4 可知，柿子酵素发酵前 5 d，总酚含量迅速上升，从 0.480.01 mg/mL升至 2.480.07 mg/mL 的最高值，随后又稍有下降。可能是因为发酵前期，在高浓度糖形成的高渗透压环境中，柿果中的可溶性多酚物质逐渐溶出，同时，乳酸菌代谢产生的酶可将柿子中与糖、有机酸等物质结合的酚类化合物进行水解，从而增加了发酵液中游离酚类物质的含量11。而发酵后期，酚类物质被多酚氧化酶氧化或与体系中有机酸结合，亦或是与发酵液中的蛋白质吸附、结合形成沉淀，离心除去后导致酵素液中总酚含量有所减少12。而Cagno R D 等认为总酚含量的降低可能与微生物自身相关，因为一定浓度的酚类物质可抑制微生物生长，发酵过程中随着总酚含量的增加，部分优势菌种为维持自身正常生长代谢会产生某些成分对酚类物质进行降解13。随着发酵的进行，酵素液中的黄酮含量从 0.070.01 mg/mL 升高至 0.580.01 mg/mL，原因是发酵过程中，微生物代谢产生乙醇，柿子中难溶于水的黄酮类物质被醇溶、提取，引起黄酮含量升高14。此外，发酵后期黄酮醇配糖体（黄酮类物质与糖苷结合）被水解，使柿子酵素中黄酮含量进一步升高。2.4 柿子酵素发酵过程中功效酶活性的变化柿子酵素中含有丰富的功效酶，重点选取超氧化物歧化酶（SOD）、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等进行含量测定，结果如图 5所示。图 5 柿子酵素发酵过程中功效酶活性的变化随着发酵的进行，4 种酶的活性均不断升高并最终趋于稳定，经过 6 d 发酵，SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力从最初的 45.464.71、1.800.20、0.210.01、0.730.02 U/mL 增加至 241.586.80、65.434.90、4.180.07、6.330.12 U/mL，这表明经过发酵，柿子酵素更容易被消化吸收。SOD 是一种自由基清除剂，可以清除机体产生的超氧阴离子自由基（使脂质过氧化，导致人体衰老，加速组织细胞凋亡并可能引起肿瘤、自身免疫性疾病、炎症等病变）。这与段晓宇等测定的草莓菠萝复合酵素 SOD 酶活力相比15，柿子酵素的SOD 酶活力明显更高，因此推测柿子酵素具有清除自由基、抗氧化等功效潜力。64 北京农业职业学院学报 2023 年 第 4 期2.5 柿子酵素发酵过程中抗氧化能力的变化图 6 为柿子酵素发酵过程中抗氧化能力的变化。图 6 柿子酵素发酵过程中抗氧化能力的变化由图 6 可知，经过 6 d 发酵，柿子酵素的 DPPH清除能力显著上升，最终达到90.12%1.85%，表明柿子酵素具有良好的抗氧化性。发酵前5 d，OH清除率也迅速提高，从 14.53%0.42%增加至 45.44%1.42%，随后趋于平稳，可能与体系中所含的多种有机酸有关16；也有研究发现多酚和黄酮类物质有较强的OH 清除能力17-18。近年来，ABTS+清除法被广泛应用于评价生物样品的抗氧化活性。由图 6 可知，发酵过程中，柿子酵素的 ABTS+清除率从最初的46.07%0.25%逐渐提高到 94.73%1.00%，增幅显著。本研究结果与葡萄酵素ABTS+自由基清除能力的测定结果一致，可能与酵素中多酚、有机酸和维生素等多种物质协同作用有关19。由图 6 可以看出，随着发酵时间的延长，柿子酵素对 O2-的清除率持续提高至88.63%2.11%，表明柿子酵素有良好的O2-清除能力，可能与酚类物质和SOD酶有关。2.6 柿子酵素中总酚、黄酮、SOD 活性与抗氧化能力的相关性酵素发酵过程中，乳酸菌在柿子浆中进行繁殖、代谢，同时产生很多复杂的代谢产物，不仅为柿子酵素提供独特的风味和口感，还可以产生一些新的活性成分（如多酚、黄酮及功效酶等），赋予酵素抗氧化、助消化等功能。选择柿子酵素发酵过程中具有抗氧化性能的成分总酚、黄酮、SOD，分析其与 DPPH、OH、ABTS+、O2-清除率之间的相关性，结果见表 1。由表 1 可以看出，柿子酵素在发酵过程中，DPPH、OH、ABTS+、O2-清 除能力与总酚、黄酮和 SOD 酶含量之间均呈极显著的正相关性(P0.01)。由此可知，柿表 1 柿子酵素中总酚、黄酮、SOD 活性与抗氧化能力的相关性分析总酚黄酮SODDPPHOHABTS+O2-总酚1黄酮0.986*1SOD0.937*0.945*1DPPH0.984*0.941*0.892*1OH0.975*0.923*0.851*0.937*1ABTS+0.958*0.925*0.814*0.934*0.916*1O2-0.962*0.863*0.953*0.895*0.863*0.839*1注：“*”表示显著相关（P0.05），“*”表示极显著相关（P0.01）。%65 田文静，等：柿子酵素发酵过程中活性成分及其抗氧化性能的研究子酵素所显现出的良好抗氧化性能主要与黄酮、酚类物质及 SOD 有关。3 结论 本研究对柿子酵素发酵过程中代谢产物的理化指标（pH 值、总酸、可溶性固形物含量）、抗氧化成分（总酚、黄酮）、功效酶（SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）活性以及抗氧化性能（DPPH、OH、ABTS+、O2-清 除 率）进 行 动态分析。结果发现，随着发酵的进行，发酵液的 pH 值持续降低，而总酸含量不断增加；可溶性固形物含量不断降低，并于4 d 后趋向稳定；总酚含量先快速上升至5 d后有轻微下降，黄酮含量呈逐渐上升趋势，发酵结束时分别达到 2.360.05 mg/mL 和 0.580.01 mg/mL；SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力在发酵 6 d 时达到最大值，分别为 241.586.80、65.434.90、4.180.07、6.330.12 U/mL；抗氧化能力呈现迅速升高后趋于平缓的趋势，经过 6 d 发酵，柿子酵素中 DPPH、OH、ABTS+、O2-清除率分别为 90.12%1.85%、45.44%1.42%、94.73%1.00%、88.63%2.11%，说明乳酸菌发酵大幅提升了柿子酵素的抗氧化能力。相关性分析结果显示，柿子酵素的抗氧化性能与总酚、黄酮和 SOD 的含量显著相关（P0.05），说明酚类物质、黄酮和 SOD是柿子酵素良好抗氧化能力的主要来源。发酵过程中代谢产物及其抗氧化活性的变化规律，可以较直观地反映酵素发酵进程、营养价值和产品品质。柿子酵素代谢产物及其抗氧化性能的研究可为柿子精深加工及构建柿子酵素的综合评价体系提供一定的技术支撑。【参考文献】1 高清山.柿子的营养价值及其利用 J.山西果树，2015(01):10-12.2 GEORGE A 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increased continuously.With the fermentation,the content of soluble solids decreased continuously,and tended to be stable after 4 days of fermentation.The contents of total phenol and flavone show an overall increasing trend,which reaching 2.360.05 mg/mL and 0.580.01 mg/mL at the end of fermentation,respectively.The activity of SOD,protease,amylase and lipase reached the maximum value of 241.586.80 U/mL,65.434.90 U/mL,4.180.07 U/mL,6.330.12 U/mL respectively at the sixth day from fermentation.Anti-oxidation capacity presents the characteristics from rapid rise to stabilization.The DPPH,OH,ABTS+,O2-removal rates were as high as 90.12%1.85%,45.44%1.42%,94.73%1.00%,88.63%2.11%respectively after 6 days of fermentation,indicating that lactic acid bacteria fermentation greatly improved the anti-oxidation capacity of persimmon ferment.Correlation analysis shows that the increase of anti-oxidation properties of persimmon ferment was significantly positively correlated with the changes of total phenol,flavonoids and SOD content(P0.05).Keywords:persimmon ferment;metabolite;bioactive compound;anti-oxidant property及其体外生物活性研究 J.天然产物研究与开发，2021,33(10):1635-1642,1706.16 XU B,CHANG S.Total Phenolics,Phenolic Acids,Isoflavones,and Anthocyanins and Antioxidant Properties of Yellow and Black Soybeans As Affected by Thermal ProcessingJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(16):7165-7175.17 CHUA J Y,LU Y,LIU S Q.Biotransformation of Soy Whey Into Soy Alcoholic Beverage by Four Commercial Strains of Saccharomyces CerevisiaeJ.International Journal of Food Microbiology,2017,262:14-22.18 NG C C,WANG C Y,WANG Y P,et al.Lactic Acid Bacterial Fermentation on the Production of Functional Antioxidant Herbal Anoectochilus formosanus HayataJ.Journal of Bioscience&Bioengineering,2011,111(3):289-293.19 蒋增良，刘晓庆，王珍珍，等.葡萄酵素有机酸分析及其体外抗氧化性能 J.中国食品学报，2017,17(05):255-262.（责任编辑宋晓华）