高效液相色谱-荧光检测多类型肥料中宛氏拟青霉SJ1提取物.pdf

收稿日期:2 0 2 2-0 6-2 9 修回日期:2 0 2 2-0 8-1 0基金项目:国 家 自 然 科 学 基 金(3 2 1 0 1 1 0 4 5 4);山 东 省 中 小 微 企 业 创 新 竞 技 行 动 计 划 新 锐 类 科 技 金 融 补 助 项 目(2 0 1 8 C X J J A 1 0 6 0 0 1 2);山东省第四批技术创新项目(2 0 1 9 4 0 3 0 9 0 2 5)资助*通讯作者:张民,博士,教授,研究方向:土壤资源高效利用、新型肥料创制理论与技术.E-m a i l:m i n z h a n g-2 0 0 21 6 3.c o m第3 9卷第3期V o l.3 9 N o.3分 析 科 学 学 报J OUR NA LO FANA L Y T I C A LS C I E N C E2 0 2 3年6月J u n e 2 0 2 3D O I:1 0.1 3 5 2 6/j.i s s n.1 0 0 6-6 1 4 4.2 0 2 3.0 3.0 1 0高效液相色谱-荧光检测多类型肥料中宛氏拟青霉S J 1提取物王庆彬1,2,向亚美1,李芳霞3,张自翔4,彭春娥5,孙 健1,史 磊1,孙秀丽1,赵红玲1,张 民*2(1.山东蓬勃生物科技有限公司,山东泰安2 7 1 0 0 0;2.土肥高效利用国家工程中心,山东农业大学资源与环境学院,山东泰安2 7 1 0 1 8;3.济南护理职业学院,山东济南2 5 0 1 0 2;4.中化农业(临沂)研发中心有限公司,山东临沂,2 7 6 0 2 4;5.山东省农业科学院,农产品加工与营养研究所,山东济南2 5 0 1 0 0)摘 要:建立了一种测定多类型肥料中肥料增效型宛氏拟青霉S J 1提取物(Z N C)的高效液相色谱-荧光检测分析方法。以乙酸乙酯作为萃取溶剂,肥料增效型Z N C荧光的最佳激发波长为2 6 0n m,发射波长为3 3 0n m,优化洗脱条件为水、甲醇、乙腈混合梯度洗脱,采用H I T A C H IL a C h r o mC 1 8色谱柱进行检测。结果表明,方法的线性关系良好,相关系数(R2)0.9 9,在信噪比(S/N)=3的条件下,复合肥料和尿素中肥料增效型Z N C的检测限为0.2 5m g/k g,氨基酸水溶肥中肥料增效型Z N C的检测限为5.0m g/L,回收率为7 1.6%9 3.5%,相对偏差(R S D,n=3)为2.9%7.3%。本方法利用化合物本身荧光特性,操作简单,准确度和精密度均满足方法学指标,可为肥料监管部门监督和新型肥料质量内部控制提供一种有效的检测手段。关键词:宛氏拟青霉S J 1提取物;肥料;高效液相色谱中图分类号:O 6 5 7.7+2 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-6 1 4 4(2 0 2 3)0 3-3 1 9-0 5近年来,我国年肥料产量和用量约6 0 0 0万吨,居世界首位,但利用率只有3 0%左右1,造成了资源浪费、农业成本增加、土壤环境恶化和水气污染等系列问题2。肥料增效剂是一类添加到肥料中能提高肥料利用率的物质3。智能聪(Z N C)是系列植物内生菌提取物,其中肥料增效型Z N C主要活性成分是宛氏拟青霉S J 1提取物,是一种含有糖类、氨基酸、多肽和核苷类物质等多种成分的混合物,分子量主要分布在7 05 0 0D a之间4,具有促进植物生长和增加植物抗逆性等作用5,6,与肥料配伍可显著提高1 5%3 0%的肥料利用率7,8。肥料增效型Z N C活性高,是腐殖酸、海藻提取物等产品的3 00 0 03 0 00 0 0倍9,在肥料中的添加量为痕量,约为肥料的百万分之一,是一种有较大应用前景的新型肥料增效剂。2 0 2 2年5月1日强制性国家标准G B1 8 3 8 2-2 0 2 1实施,规定肥料中标识添加物必须有检测方法和标准1 0,因此,建立肥料中增效剂检测方法是行业发展的关键。目前肥料增效剂检测方法主要存在杂质干扰大、检测物特异性差、适用肥料类型单一、检测成本高、操作复杂等问题1 1,且部分增效剂如甜菜碱、褪黑素等在肥料中的检测未见报道。现有方法中海藻酸受金属离子和中性糖等杂质干扰,检测结果偏高1 2;腐殖酸检测的是有机碳而非腐殖酸,存在特异性差的问题1 3;聚谷氨酸测定使用氨基酸自动分析913第3期王庆彬等:高效液相色谱-荧光检测多类型肥料中宛氏拟青霉S J 1提取物第3 9卷仪,存在仪器成本高,方法只适用特定肥料的缺点1 4。目前肥料中肥料增效型Z N C的检测鲜有报道,肥料中Z N C添加量极低,本研究选用高效液相色谱-荧光检测,通过对荧光波长和流动相的优化,以提高方法的灵敏度;通过对萃取溶剂优化,以降低肥料中杂质对结果的干扰,建立了一种适用于尿素、复合肥料、氨基酸水溶肥3种代表性肥料中Z N C的检测方法。该方法可以为Z N C新型肥料质量内部控制和应用提供技术支撑。1 实验部分1.1 仪器与试剂P r i m a i d e1 1 1 0高效液相色谱仪,配荧光检测器(日本,H I T A CH I);S y n e r g yH 1酶标仪(美国,B i o-T e k);KQ 3 2 0 0 D E数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);C e n t r i f u g e5 8 1 0 R台式离心机(德国,E p p e n d o r f);XH-C旋涡混合器(江苏金怡仪器科技有限公司);S y n e r g yUV超纯水仪(美国,M i l l i p o r e);F A 1 0 0 4分析天平(上海瞬宇恒平科学仪器有限公司)。肥料增效型Z N C对照品(纯度9 9.5%,山东蓬勃生物科技有限公司);甲醇,乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司);乙醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);尿素,复合肥料(品规:1 8-2 0-5),氨基酸水溶肥料(均购于中化山东肥业有限公司);乙酸乙酯,分析纯。实验用水为超纯水(1 8.2Mc m)。1.2 对照品溶液配制准确称取0.0 1 0 0g肥料增效型Z N C对照品于1 0m L容量瓶中,用2 0%乙醇溶液配制成浓度为10 0 0g/m L的对照品储备液。准确移取0.5m L的对照品储备液于1 0m L容量瓶中,用2 0%乙醇溶液配制成浓度为5 0g/m L的对照品中间液,现用现配。1.3 样品前处理称取2 5.0g(精确至0.0 1g)试样于1 0 0m L离心管内,加入2 0.0m L乙酸乙酯,涡旋3 0s,室温下超声5m i n,将提取液移至5 0m L离心管中,试样中再加入2 0.0m L乙酸乙酯,重复上述步骤;合并两次提取液,于50 0 0r/m i n离心1 0m i n,取上清液,5 0下用氮气缓慢吹至近干,加入5 0 0L乙腈复溶,涡旋1m i n混匀后转移至1.5m L离心管中,80 0 0r/m i n离心1 0m i n取上清液过0.2 2m有机滤膜,待测。1.4 液相色谱条件H I T A CH IL a C h r o mC 1 8色谱柱(2 5 0mm4.6mm5m,日本日立);流速:1.0m L/m i n;柱温:4 0;检测波长:激发波长2 6 0n m,发射波长3 3 0n m;进样量:1 0L;流动相:A为水,B为乙腈,C为甲醇。梯度洗脱程序:02 5m i n,6 0%2 0%A,2 0%4 0%B;2 54 5m i n,2 0%A,4 0%B;4 54 6m i n,2 0%0%A,4 0%6 0%B;4 65 8m i n,0%A,6 0%B;5 86 0m i n,0%6 0%A,6 0%2 0%B;6 07 0m i n,7 0%A,2 0%B。2 结果与讨论2.1 荧光波长的选择为了确定肥料增效型Z N C的最佳激发和发射波长,本研究将肥料增效型Z N C分别在激发波长2 5 07 0 0n m和发射波长3 0 07 0 0n m范围下,进行全波长扫描。结果如图1,从图中可知肥料增效型Z N C最佳激发波长为2 6 0n m(图1 a),最佳发射波长为3 3 0n m(图1 b)。图1 全波长扫描图谱F i g.1 F u l l-w a v e l e n g t hs c a n n i n g s p e c t r a023第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷2.2 萃取试剂的选择分别选用正己烷、乙酸乙酯、乙腈、水4种亲水性逐渐增强的试剂,与肥料增效型Z N C冻干粉按照体积质量比1 0 0 1混合。结果显示,肥料增效型Z N C冻干粉在乙酸乙酯、乙腈和水中瞬间全溶,在正己烷中逐渐溶解。分别称取2 5.0g空白尿素、复合肥料、氨基酸水溶肥各3份于1 0 0m L离心管内,分别在每份中加入2 0m L的乙酸乙酯、乙腈和水,涡旋3 0s,室温下超声5m i n离心取上清液,5 0下用氮气吹至近干,分别称量肥料在不同溶剂中溶解物的质量。由于氨基酸水溶肥与水瞬间互溶,两者无法通过离心分离,因此未计算氨基酸水溶肥在水中溶解物的质量,其余结果见表1。结果表明,3种肥料在乙酸乙酯中溶解物的质量最低,因此为了减弱肥料中无机盐及其他可溶于萃取溶剂中杂质对检测结果的干扰,同时考虑到节约实验成本,本研究最终选取乙酸乙酯作为萃取溶剂。表1 肥料在不同溶剂中的溶解度T a b l e1 S o l u b i l i t yo f f e r t i l i z e r s i nd i f f e r e n t s o l v e n t sE x t r a c t i o ns o l v e n t sM a s s(g)C o m p o u n df e r t i l i z e rU r e aAm i n oa c i dw a t e r-s o l u b l e f e r t i l i z e rE t h y l a c e t a t e0.0 1 6 80.0 1 3 40.0 0 8 5A c e t o n i t r i l e0.0 5 7 60.0 7 3 80.0 0 9 1W a t e r3.2 9 8 62.0 3 9 7-2.3 流动相的优化流动相的组成和配比不但会影响目标化合物在色谱柱中的保留行为,还会影响到目标化合物和杂质的分离度。称取2 5.0g复合肥料样品加入2 5 0L的肥料增效型Z N C对照品中间液,按照样品前处理的条件处理样品,首先使用水/乙腈的二元体系在梯度洗脱条件下对肥料增效型Z N C进行色谱分析。结果表明,此流动相条件下目标化合物出峰时间与杂质出峰时间相近,目标化合物分离效果差(图2 a)。根据乙腈、甲醇极性差异,改变流动相中乙腈、甲醇的比例,延迟了目标化合物出峰时间,结果表明,优化后的色谱洗脱程序下,目标化合物与杂质的分离度好,峰型呈正态分布(图2 b)。因此本研究最终确定水/乙腈/甲醇三元体系梯度洗脱。图2 优化前(a)后(b)色谱图F i g.2 C h r o m a t o g r a m so fZ N Cb e f o r e(a)a n da f t e r(b)o p t i m i z a t i o n2.4 方法学评价2.4.1 线性、回归方程、相关系数及检出限 分别移取一定量的肥料增效型Z N C对照品中间液配制成一定浓度的对照品工作液,按照上述的色谱条件进样,以溶液质量浓度(X,g/m L)为横坐标,对应的色谱峰峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。结果显示在相应浓度范围下与峰面积响应呈良好线性关系,线性范围、回归方程、相关系数及检出限满足方法评估要求(表2)。表2 线性范围、回归方程、相关系数及定量限T a b l e2 L i n e a r r a n g e,r e g r e s s i o ne q u a t i o n,c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t a n dL O QS a m p l eR e g r e s s i o ne q u a t i o nL i n e a r r a n g e(g/m L)C o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tR2L OQ(m g/k g(L)C o m p o u n df e r t i l i z e r/U r e aY=11 08X+31 071 2.5-7 5.00.9 9 9 20.2 5Am i n oa c i dw a t e r-s o l u b l e f e r t i l i z e rY=2.51 05X-7.11 051 2 5-7 5 00.9 9 6 85.0123第3期王庆彬等:高效液相色谱-荧光检测多类型肥料中宛氏拟青霉S J 1提取物第3 9卷2.4.2 回收率 在空白的复合肥料、尿素、氨基酸水溶肥样品中,分别添加3个浓度水平的Z N C,按上述的前处理方法和色谱条件进行检测,计算各个添加浓度下样品回收率。从表3可以看出,该方法平均回收率在7 1.6%9 3.5%之间,相对标准偏差(R S D,n=3)1 0%。表明本方法具有良好的准确度,满足肥料样品中肥料增效型Z N C的检测要求。表3 不同肥料样品的加标回收率(n=3)T a b l e3 R e c o v e r yr a t e so fd i f f e r e n t f e r t i l i z e r s a m p l e s(n=3)S a m p l eAm o u n to fZ N Ca d d e d(m g/k g(L)F o u n d(m g/k g(L)A v e r a g er e c o v e r y(%)R S D(%)A v e r a g eR S D(%)C o m p o u n df e r t i l i z e r0.2 50.1 97 1.66.07.30.7 50.5 21 0.01.51.0 26.0U r e a0.2 50.1 87 4.70.6 35.70.7 50.5 51 2.01.51.2 04.7Am i n oa c i d1 2 51 2 0.8 99 3.53.22.9w a t e r-s o l u b l e3 7 53 6 3.4 92.8f e r t i l i z e r7 5 06 5 0.9 42.72.4.3 精密度 在空白的复合肥料、尿素、氨基酸水溶肥样品中,准确称取6个平行试样,分别添加不同适宜浓度的肥料增效型Z N C,按上述的前处理方法和色谱条件处理后进行检测,测得3种肥料中肥料增效型Z N C的标准偏差(表4)。结果表明精密度良好,符合仪器定量分析要求。表4 不同肥料样品的精密度(n=6)T a b l e4 P r e c i s i o no fd i f f e r e n t f e r t i l i z e r s a m p l e s(n=6)S a m p l eA m o u n t o fZ N Ca d d e d(m g/k g(L)C o n t e n t(m g/k g(L)123456A v e r a g e(m g/k g(L)R S D(%)C o m p o u n d f e r t i l i z e r10.5 90.6 60.7 10.7 30.7 10.7 80.7 09.3U r e a10.7 60.7 50.7 80.7 60.8 50.7 10.7 75.9A m i n oa c i dw a t e r-s o l u b l ef e r t i l i z e r5 0 05 0 2.5 2 5 1 5.5 2 4 6 0.2 5 5 2 5.3 9 5 3 0.5 2 5 2 7.1 65 1 0.2 35.23 结论本研究建立了适用于多类型肥料中肥料增效型Z N C的H P L C-荧光检测方法。利用肥料增效型Z N C本身具有荧光的特性,无需再对样品进行衍生化处理,简化了试验步骤;采用乙酸乙酯萃取样品中的肥料增效型Z N C,同时对流动相组成进行优化,降低无机盐等杂质对试验结果的干扰。与常规肥料增效剂检测方法相比,本方法的灵敏度提高4 0倍1 5,准确度和精密度都满足方法学指标,为肥料监管部门监督和新型肥料质量内部控制提供一种有效的检测手段,同时也为其他内生菌提取物检测提供了参考依据。参考文献:1 HA OSL,C A ITY,F E NGXJ,e t a l.J o u r n a l o fP l a n tN u t r i t i o na n dF e r t i l i z e r s(郝胜磊,蔡廷瑶,冯小杰等.植物营养与肥料学报),2 0 2 1,2 7(9):1 4 9 6.2 ME N GYD,X UFH,YANGF,e t a l.P h o s p h a t e&C o m p o u n dF e r t i l i z e r(孟远夺,许发辉,杨帆等.磷肥与复肥),2 0 1 5,3 0(9):1.3 M e s s a,LL,S o u z aCF,F a e zR.P o l y m e rT e s t i n g,2 0 2 0,8 1:1 0 6 1 9 6.4 W a n gQB,P e n gCE,S h iLR,L i uZG,Z h o uDF,Z h o uDF,M e n gH,Z h a oHL,L iFC,Z h a n gM.F r o n t i e r s i nB i o e n-g i n e e r i n ga n dB i o t e c h n o l o g y,2 0 2 1,9:6 7 1 8 7 9.5 C a oJ,L i uBY,X uXN,Z h a n gXY,Z h uCX,L iY,D i n gXH.F r o n t i e r s i nP l a n tS c i e n c e,2 0 2 1,1 2:1 9 6 9.6 L uCC,L i uHF,J i a n gDP,W a n gLL,J i a n gYK,T a n gSY,H o uXW,H a nXY,L i uZG,Z h a n gM,C h uZH,D i n gXH.P l a n t a n dS o i l,2 0 1 9,4 4 1(1):3 8 3.223第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷7 Z HA O H M,YAN GGT,L I UZG,e t a l.J o u r n a l o fP l a n tN u t r i t i o na n dF e r t i l i z e r s(赵洪猛,杨贵婷,刘之广等.植物营养与肥料学报),2 0 1 9,2 5(1 2):2 1 8 9.8 Q I N GRJ,Z HAN G M,L I UZG,e t a l.J o u r n a l o fS o i l a n dW a t e rC o n s e r v a t i o n(秦瑞劼,张民,刘之广等.水土保持学报),2 0 1 8,3 2(4):3 2 7.9 J I ACH,L I UZG,Z HANG M,e t a l.J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a lR e s o u r c e sa n dE n v i r o n m e n t(贾春花,刘之广,张民等.农业资源与环境学报),2 0 1 9,3 6(2):1 7 6.1 0G B1 8 3 8 2-2 0 2 1.F e r t i l i z e r M a r k i n g-P r e s e n t a t i o na n dD e c l a r a t i o n(肥料标识 内容和要求).1 1Z HAN GZC,Z HA OY,Z HAN GC,e t a l.F e r t i l i z e r&H e a l t h(张宗彩,赵影,张翠等.肥料与健康),2 0 2 0,4 7(1):7 0.1 2Y EY,G E N GYY,S HE N H.P h o s p h a t e&C o m p o u n dF e r t i l i z e r(叶颖,耿银银,沈宏.磷肥与复肥),2 0 1 9,3 4(1 2):3 0.1 3NY/T1 9 7 1-2 0 1 0.W a t e r-s o l u b l eF e r t i l i z e r s-D e t e r m i n a t i o no fH u m i c-a c i dC o n t e n t(水溶肥料 腐殖酸含量的测定).1 4N Y/T3 0 3 9-2 0 1 6.W a t e r-s o l u b l eF e r t i l i z e r s-D e t e r m i n a t i o no f P o l y-g l u a t a m i cA c i dC o n t e n t(水溶肥料 聚谷氨酸含量的测定).1 5G B/T3 7 5 0 0-2 0 1 9.D e t e r m i n a t i o no fP l a n tG r o w t hR e g u l a t o r s i nF e r t i l i z e r-H i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y(肥料中植物生长调节剂的测定 高效液相色谱法).D e t e r m i n a t i o no fE x t r a c t f r o mP a e c i l o m y c e s v a r i o t i iS J 1 i nV a r i o u sF e r t i l i z e r sb yH i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h yWANGQ i n g b i n1,2,X I AN GY a m e i1,L IF a n g x i a3,Z HAN GZ i x i a n g4,P E NGC h u n e5,S UNJ i a n1,S H IL e i1,S UNX i u l i1,Z HAO H o n g l i n g1,Z HAN G M i n*2(1.S h a n d o n gP e n g b oB i o t e c h n o l o g yC o.L TD,T a ia n2 7 1 0 0 0;2.N a t i o n a lE n g i n e e r i n gC e n t e rf o rE f f i c i e n tU t i l i z a t i o no fS o i la n dF e r t i l i z e r,C o l l e g eo fR e s o u r c e sa n dE n v i r o n m e n t o fS h a n d o n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,T a ia n2 7 1 0 1 8;3.J i n a nV o c a t i o n a lC o l l e g eo fn u r s i n g,J i n a n2 5 0 1 0 2;4.S i n o c h e mA g r i c u l t u r e(L i n y i)R&DC e n t e rC o.L TD,L i n y i,2 7 6 0 2 4;5.I n s t i t u t e o fA g r o-F o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,S h a n d o n gA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,J i n a n2 5 0 1 0 0)A b s t r a c t:Ah i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y(H P L C)m e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff e r t i l i z e rs y n e r g i s t i cZ N C(P a e c i l o m y c e sv a r i o t i iS J 1f e r m e n t a t i o ne x t r a c t)i nv a r i o u sf e r t i l i z e r sb yu s i n gf l u o r e s c e n c e t e c h n o l o g y.E t h y la c e t a t ew a su s e dt oe x t r a c tt h ef e r t i l i z e rs y n e r g i s t i cZ N Cf r o mf e r t i l i z e r s.T h eo p t i m a l e x c i t a t i o nw a v e l e n g t ha n de m i s s i o nw a v e l e n g t ho f f e r t i l i z e r s y n e r g i s t i cZ N Cw e r e2 6 0n ma n d3 3 0n m,r e s p e c t i v e l y.T h eo p t i m i z e de l u t i o nc o n d i t i o n sw e r em i x e dg r a d i e n t s o l v e n t so fw a t e r,m e t h a n o l a n da c e t o n i t r i l e,a n d t h ed e t e c t i o nw a sp e r f o r m e do nH I T A C H IL a C h r o mC 1 8c o l u m n.T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t(R2)w a sg r e a t e r t h a n0.9 9.U n d e r t h ec o n d i t i o no fS/N=3,T h e l i m i to fq u a n t i f i c a t i o no f f e r t i l i z e rs y n e r g i s t i cZ N Ci nc o m p o u n df e r t i l i z e ra n du r e aw a s0.2 5m g/k g,a n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o no ff e r t i l i z e rs y n e r g i s t i cZ N C i n a m i n o a c i dw a t e r-s o l u b l e f e r t i l i z e rw a s 5.0m g/L.T h e r e c o v e r y r a t ew a s 7 1.6%-9 3.5%,a n dt h e r e l a t i v ed e v i a t i o nw a s2.9%-7.3%.T h em e t h o di ss i m p l et oo p e r a t e,a n di t sa c c u r a c ya n dp r e c i s i o nm e e t t h em e t h o d o l o g i c a l i n d i c a t o r sb yu s i n gt h e f l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c so f f e r t i l i z e rs y n e r g i s t i cZ N Cc o m p o u n d s.I tp r o v i d e sa n e f f e c t i v e d e t e c t i o n m e t h o df o rt h es u p e r v i s i o n o ff e r t i l i z e rr e g u l a t o r yd e p a r t m e n t sa n dt h e i n t e r n a l q u a l i t yc o n t r o l o fn e wf e r t i l i z e r.K e y w o r d s:E x t r a c t f r o mP a e c i l o m y c e s v a r i o t i iS J 1;F e r t i l i z e r;H i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y323