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芳酸类药物的质量控制
第一节 典型药物与结构特点
非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)是一类不含有甾体骨架的抗炎药，是目前临床使用最多的药物种类之一。本类药物具有抑制前列腺素的合成，进而发挥抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于风湿性关节炎和类风湿关节炎、多种发热和各种慢性疼痛，如头痛、关节肌肉疼痛、牙痛等症状的缓解。本类药物具有不同的化学结构，但多数具有芳酸基本结构，即芳基取代羧酸结构。本类药物的结构特点为同时具有游离羧基和苯环，其酸性特征可作为原料药的含量测定基础，即在中性乙醇或其他水溶性有机溶剂中，用氢氧化钠滴定液直接滴定；苯环的紫外光吸收特性常被用于本类药物的鉴别、定量检查及部分制剂的含量测定。本类药物的酯类易于水解的特性决定了其特殊杂质检查的项目与方法；如阿司匹林中游离水杨酸的检查，ChP曾采用三价铁比色法检查；但由于在供试品溶液制备过程中阿司匹林的继续水解使检查结果不稳定；所以ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制备供试品溶液，以防阿司匹林的水解，增加稳定性，同时采用高效液相色谱法(HPLC)检查，以提高检查结果的可靠性。
芳酸类非甾体抗炎药物在结构上具有苯环和羧基。羧基可呈游离态，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛等；羧基也可成盐或成酯，如双氯芬酸钠、双水杨酯等；也可呈酰胺结构，如吡罗昔康、美洛昔康等。本类药物在苯环上亦存在不同的结构特征，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳等具有邻羟基(游离或酯化)苯甲酸结构；甲芬那酸具有邻胺基苯甲酸结构；酮洛芬具有二苯甲酮结构；吡罗昔康和美洛昔康具有β-羟基-α-不饱和酮结构；吲哚美辛、吡罗昔康和美洛昔康具有杂环结构；二氟尼柳含有氟元素，双氯芬酸钠和吲哚美辛含有氯元素，吡罗昔康和美洛昔康含有硫元素。上述结构特征或杂原子的存在也决定了各药物的化学特性。作为其他非甾体抗炎药，对乙酰氨基酚和尼美舒利的结构分别为取代乙酰苯胺和甲磺酰苯胺，具有苯胺和甲磺酰基结构。主要理化性包括
（一） 酸性
本类药物因分子结构中具有游离羧基而显酸性，但其酸性强度受苯环的取代位置及苯环上其他取代基的影响。具有邻位取代苯甲酸结构的药物，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸等，由于邻位效应使得酸性增强，如阿司匹林的酸性(pKa＝3.49)比苯甲酸的酸性(pKa=4.26)强；其中，水杨酸还由于邻位游离羟基的氢能与羧基形成分子内氢键，更增强了羧基中氧氢键的极性，使其酸性进一步增强(pKa=2.95)。双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛等，由于羧基并非直接与苯环相连，在结构上属于芳环取代的脂肪酸类，其酸性较弱。而吡罗昔康、美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚则为酰胺结构，无明显酸性。
基于本类药物具有较强酸性的特性，大多数药物的原料药均可在中性乙醇或甲醇、丙酮等水溶性有机溶剂中，用氢氧化钠直接滴定法测定含量。
（二） 水解性
本类药物中，阿司匹林和双水杨酯具有酯键，吲哚美辛、吡罗昔康、美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚等则具有酰胺键，均可发生水解反应。水解反应及其产物的理化特性反应可用于鉴别；若水解反应可快速、定量进行，亦可用剩余碱量法测定含量，如美洛昔康可加定量过量的氢氧化钠水解后，剩余的氢氧化钠用盐酸回滴定法测定含量。
（三） 吸收光谱特性
本类药物分子结构中具有苯环和特征取代基，均具有紫外和红外特征光谱，紫外-可见分光光度法和红外分光光度法已被广泛应用于本类药物及其制剂的鉴别；同时，紫外-可见分光光度法亦被广泛用于本类药物制剂的含量均匀度、溶出度或释放度的检查，甚至部分药物制剂的含量测定。
（四） 基团或元素特性
本类药物分子结构中的特征基团或元素具有特征的理化特性，如对乙酰氨基酚的酚羟基、水杨酸的邻羟苯甲酸结构与三价铁可生成有色配位化合物；酮洛芬的二苯甲酮可与苯肼缩合显色；美洛昔康结构中的硫元素热分解后产生的硫化氢可与醋酸铅生成黑色硫化铅等均可用于本类药物的鉴别。
第二节 鉴别试验
依据上述理化性质，芳酸类非甾体抗炎药物可采用显色反应、沉淀反应，以及红外、紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法或薄层色谱法鉴别。
一、与三氯化铁反应
1．水杨酸反应 水杨酸的水溶液加三氯化铁试液，即生成紫堇色配位化合物。

反应宜在中性或弱酸性(pH 4~6)条件下进行，在强酸性溶液中配位化合物可分解；本反应极为灵敏，试验宜在稀溶液中进行。如取样量大，产生颜色过深时，可加水稀释后观察。
阿司匹林加水煮沸使水解生成水杨酸后，可与三氯化铁试液反应显紫堇色；双水杨酯在氢氧化钠试液中煮沸后与三氯化铁试液反应呈紫色；二氟尼柳溶于乙醇后与三氯化铁试液反应呈深紫色。
2．酚羟基反应 对乙酰氨基酚的水溶液加三氯化铁试液即显蓝紫色。

吡罗昔康与美洛昔康噻嗪环上的烯醇式羟基具有酚羟基的性质，亦可在三氯甲烷溶液中与三氯化铁生成红色配位化合物，分别显玫瑰红色和淡紫红色。
二、缩合反应
酮洛芬具有二苯甲酮结构，在酸性条件下可与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物。取本品，加乙醇溶解后，加二硝基苯肼试液，加热至沸，放冷即产生橙色沉淀。

三、重氮化-偶合反应
对乙酰氨基酚具潜在的芳伯氨基，在稀盐酸中加热水解生成对氨基酚，具有游离芳伯氨基结构，在酸性溶液中与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生成的重氮盐再与碱性β-萘酚偶合生成红色偶氮化合物。

分子结构中具有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物，均可发生重氮化反应，生成的重氮盐可与碱性β-萘酚偶合生成有色的偶氮染料。
四、氧化反应
甲芬那酸溶于硫酸后，与重铬酸钾反应显深蓝色，随即变为棕绿色。
吲哚美辛溶液在硫酸存在下，与重铬酸钾溶液共热，应显紫色；在盐酸溶液中与亚硝酸钠溶液反应显绿色，放置后渐变黄色。
五、水解反应
阿司匹林与碳酸钠试液加热水解，得水杨酸钠及醋酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。

2 CH3COONa + H2SO4 → 2 CH3COOH +Na2SO4
双水杨酯与氢氧化钠试液煮沸后，加稀盐酸，即生成白色水杨酸沉淀；沉淀在醋酸铵试液中可溶解。
六、特征元素的反应
1．氯元素的鉴别 含氯药物与碱共热分解产生氯化物，显氯化物的鉴别反应。如双氯芬酸钠，与碳酸钠炽灼灰化，加水煮沸、滤过后，滤液显氯化物鉴别反应(详见本书第二章药物的鉴别)。
2．硫元素的鉴别 美洛昔康中含二价硫高温分解产生硫化氢气体，遇醋酸铅生成硫化铅黑色沉淀。如美洛昔康于试管中炽灼，产生的气体能使湿润的醋酸铅试纸显黑色。
七、光谱法
(一) 紫外-可见分光光度法
紫外吸收光谱为电子光谱，一般只有2~3个较宽的吸收带，药物分子结构中的共轭体系决定光谱的形态，如最大吸收波长与最小吸收波长及在各波长处的吸收系数均取决于分子结构中的共轭体系。紫外吸收光谱法被广泛应用于本类药物的鉴别，各药物的紫外吸收光谱特征参数见表6-1。常用的紫外鉴别方法如下：
1．最大吸收波长法 双氯芬酸钠、萘普生、吡罗昔康、美洛昔康等均规定其最大吸收波长，如双氯芬酸钠的水溶液(20μg/ml)在276nm的波长处有最大吸收。
本类药物的多种制剂亦采用本法鉴别，如吡罗昔康片的鉴别：取含量测定项下的溶液，照紫外-可见分光光度法测定，在243nm与334nm的波长处有最大吸收。
2．最大与最小吸收波长法 布洛芬用0.4%氢氧化钠溶液制成0.25mg/ml的溶液，在265nm与273nm的波长处有最大吸收，在245nm与271nm的波长处有最小吸收，在259nm的波长处有一肩峰。布洛芬及美洛昔康制剂亦用同法鉴别。
3．吸光度法 甲芬那酸用1mol/L盐酸溶液-甲醇(1∶99)混合液制成20μg/ml的溶液，在279nm与350nm的波长处有最大吸收，其吸光度分别为0.69~0.74与0.56~0.60。
4．吸光度比值法 二氟尼柳用0.1mol/L盐酸乙醇溶液制成20μg/ml的溶液，在251nm与315nm的波长处有最大吸收，吸光度比值应为4.2~4.6。
(二) 红外分光光度法
红外吸收光谱是由分子振动、转动能级跃迁所产生的分子光谱，与紫外吸收光谱(电子光谱)比较，红外吸收光谱更具指纹特征性。本类药物的原料药均采用红外分光光度法鉴别；亦有少数制剂采用溶剂提取法去除辅料后测定，如布洛芬和对乙酰氨基酚、萘普生、尼美舒利片剂分别用丙酮、甲醇和无水乙醇溶解、滤过、干燥后，采用红外分光光度法鉴别。
八、色谱法
(一) 薄层色谱法
药物制剂中存在大量的辅料，常对原料药所使用的某些鉴别方法，如红外光谱法构成一定的干扰。虽部分药物可用溶剂提取法去除辅料的干扰，但多数药物制剂中辅料的干扰难以有效去除，此时，可采用薄层色谱法(TLC)进行分离与鉴别。如二氟尼柳、美洛昔康等制剂均采用TLC法鉴别。二氟尼柳胶囊的鉴别：以硅胶GF254为固定相，正己烷-二氧六环-冰醋酸(85∶10∶5)为展开剂，展开后在紫外光(254nm)灯下检视，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同。美洛昔康制剂则以三氯甲烷-甲醇-二乙胺(60∶5∶7.5)为展开剂，同法鉴别。
(二) 高效液相色谱法
虽然TLC设备简单、操作方便，但随着高效液相色谱法(HPLC)在药物制剂分析，尤其是在含量测定中的大量应用，近年来更多应用HPLC进行制剂的鉴别。如美洛昔康制剂采用有关物质检查的HPLC色谱条件进行鉴别，而阿司匹林、甲芬那酸、双氯芬酸钠、布洛芬、萘普生、吲哚美辛、对乙酰氨基酚等的多种制剂则均直接取含量测定项下记录的HPLC色谱图进行鉴别。如阿司匹林片、泡腾片、肠溶片、肠溶胶囊等制剂均采用本法鉴别，方法如下：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。当TLC和HPLC均有收载时，二者可任选其一，如美洛昔康片的鉴别。
第三节 特殊杂质及其检查法
典型芳酸类非甾体抗炎药物的有关物质信息见表6-3。
典型非甾体抗炎药物的主要有关物质
药物名称
有关物质结构式
代码/名称

药物名称
有关物质结构式
代码/名称
阿司匹林
双水杨酯

游离水杨酸

萘普生

I． 6-甲氧基-2-萘乙酮
甲芬那酸

2,3-二甲基苯胺

对乙酰氨基酚

氨基酚

对氯苯乙酰胺

一、阿司匹林及双水杨酯中游离水杨酸与有关物质的检查
(一) 阿司匹林及双水杨酯的合成
阿司匹林及双水杨酯的合成路线如下：

(二) 阿司匹林中游离水杨酸与有关物质的检查
1．游离水杨酸 阿司匹林为乙酰水杨酸，在生产过程中因乙酰化反应不完全，或在精制过程及贮藏期间的水解而产生水杨酸。游离水杨酸对人体有毒性，且其分子中所含的酚羟基在空气中易被逐渐氧化生成一系列有色醌型化合物，如淡黄、红棕甚至深棕色而使阿司匹林成品变色，因而需加以控制。

ChP曾基于水杨酸可在弱酸性溶液中与高价铁盐生成紫堇色配位化合物，而阿司匹林结构中无游离酚羟基，不发生该反应的原理，用稀硫酸铁铵溶液显色反应检查游离水杨酸。但由于在供试品溶液制备过程中阿司匹林可发生水解产生新的游离水杨酸，所以ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制备供试品溶液 (10mg/ml)，以防阿司匹林水解，同时采用高效液相色谱法(HPLC)检查，用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(20∶5 ∶5 ∶70)为流动相，检测波长为303nm。按外标法以峰面积计算，游离水杨酸不得过0.1%。
通常，制剂不再检查原料药物检查项下的相关杂质，但阿司匹林在制剂过程中易水解生成水杨酸，因此药典规定阿司匹林片、肠溶片、肠溶胶囊、泡腾片及栓剂均照原料药方法与色谱条件检查水杨酸，限量分别为0.3%、1.5%、1.0%、3.0%和3.0%。
2．有关物质 阿司匹林中的“有关物质”系指除“游离水杨酸”外的合成原料苯酚及其他合成副产物，如醋酸苯酯、水杨酸苯酯、水杨酰水杨酸、水杨酸酐、乙酰水杨酸苯酯、乙酰水杨酰水杨酸及乙酰水杨酸酐等杂质。ChP采用HPLC法检查：使用ODS色谱柱，以检查“游离水杨酸”的流动相为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱，检测波长为276nm。以供试品溶液 (10mg/ml) 的稀释液(0.5%)为对照，除水杨酸峰外，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(图6-2)。

图6-2 阿司匹林有关物质HPLC检查色谱图
a:阿司匹林供试品(10mg/ml)；
b:0.5%自身对照(50mg/ml)；
c:0.05%自身对照(灵敏度试验5mg/ml)；
d:水杨酸对照(10μg/ml)；
e:空白
1:阿司匹林；
2:水杨酸；
3:乙酰水杨酰水杨酸

(三) 双水杨酯中游离水杨酸的检查
双水杨酯为水杨酰水杨酸，以水杨酸为原料经酯化而成。在生产过程中因酯化反应不完全，或在精制过程及贮藏期间的水解均可产生水杨酸。其检查原理是利用水杨酸可与三价铁生成有色配位化合物的特性，用硝酸铁溶液显色后，在530nm的波长处测定吸光度，规定供试品溶液的吸光度不得大于水杨酸对照溶液的吸光度，限度为0.5%。双水杨酯片同法检查，限度为1.5%。
二、甲芬那酸中2.3-二甲基苯胺的检查
(一) 合成工艺
甲芬那酸主要以邻-氯苯甲酸(o-chlorobenzoic acid)和2，3-二甲基苯胺(2，3-dimethyl- aniline)为原料，在铜的催化下缩合而成。

(二) 2,3-二甲基苯胺的检查
ChP曾采用HPLC法检查有关物质，单一杂质的限量为0.1%，杂质总量为0.5%。但因为2,3-二甲基苯胺可引起高铁血红蛋白血症，并对中枢神经系统及肝脏有损害。故ChP除规定采用HPLC法检查“有关物质”外，采用气相色谱法检查2,3-二甲基苯胺，限度为0.01%。方法如下：
1．色谱条件 以聚乙二醇(PEG-20M)为固定液的毛细管色谱柱；对照品溶液采用恒温150℃，供试品溶液采用程序升温，起始温度150℃维持至2,3-二甲基苯胺峰出峰后，以每分钟70℃的速率升温至220℃，维持20分钟；进样口温度250℃，检测器温度260℃。
2．溶液制备与测定法 取本品适量，精密称定，用二氯甲烷-甲醇(3∶1)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含25mg的溶液，作为供试品溶液；另取2,3-二甲基苯胺适量，精密称定，用二氯甲烷-甲醇(3∶1)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2.5μg 的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液中如有与2,3-二甲基苯胺保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照品溶液中2,3-二甲基苯胺峰面积。
三、二氟尼柳中有关物质的检查
(一) 合成工艺
二氟尼柳的合成路线有多条，其中较为常用的是：以2,4-二氟苯胺(Ⅰ)为起始原料，经过改良的Gomberg-Bachmann偶联反应制得2,4-二氟联苯(Ⅱ)，经过Friedel-Crafts酰化反应得到4-(2',4'-二氟苯基)苯乙酮(Ⅲ)，再经Baeyer-Villiger氧化反应制成4-(2',4'-二氟苯基)苯酚乙酯(Ⅳ)，水解转化为4-(2',4'-二氟苯基)苯酚(Ⅴ)，最后经羧化反应得到二氟尼柳(Ⅵ)。

(二) 有关物质检查
二氟尼柳在合成过程中可能产生多种苯或联苯类中间体及副产物，而且其制备工艺存在多条合成路线，产品中可能存在的有关物质的结构与性质相差较大，使用单一模式的色谱分离技术难以完全检出有关物质。故ChP分别采用TLC(正相)和反相HPLC法，以自身对照法检查有关物质A和B。方法如下：
1．有关物质A 取本品，加甲醇溶解并稀释制成每1ml溶液中约含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇定量稀释制成每1ml溶液中约含50μg的溶液，作为对照溶液，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-二氧六环-冰醋酸(85∶10∶5)为展开剂，展开，晾干，置紫外光(254nm)灯下检视，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。
2．有关物质B 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇-乙腈-冰醋酸(55∶23∶30∶2)为流动相，检测波长为254nm，理论板数按二氟尼柳峰计算不得低于2000。精密量取有关物质A项下的对照溶液5μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%；再精密量取有关物质A项下的供试品溶液与对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(0.5%)。
四、萘普生中6-甲氧基-2-萘乙酮等有关物质的检查
(一) 合成工艺
萘普生早期的合成工艺多采用1981年由Giordano等提出的1,2-芳基迁移重排合成法，即以6-甲氧基-2-丙酰基萘(Ⅰ)为原料，经α-溴化的化合物Ⅱ，再经1,2-丙二醇缩酮化的化合物Ⅲ，最后经分子重排、水解即得萘普生(Ⅳ)[1]。

但本合成工艺中的溴化反应所使用的溴化试剂对环境污染严重，目前萘普生的合成路线有多条，如以2-萘甲醚(Ⅰ)为起始原料，经酰化制备6-甲氧基-2-乙酰萘(6-甲氧基-2-萘乙酮)(Ⅱ)，再经还原、羧化制成2-羟基-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸(Ⅲ)，最后经催化氢化得到萘普生(Ⅳ)[2]。

(二) 有关物质检查
目前，萘普生的合成工艺主要以2-萘甲醚或6-甲氧基-2-萘乙酮为起始原料，故检查6-甲氧基-2-萘乙酮及其他有关物质。方法如下：
1．色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(75∶25)，用磷酸调节pH至3.0为流动相；检测波长为240nm，理论板数按萘普生峰计算不得低于5000，萘普生峰与各相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2．溶液制备与测定法 避光操作。取本品适量，加流动相适量使溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；另取6-甲氧基-2-萘乙酮(杂质Ⅰ)对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含50μg的溶液，作为对照品溶液；分别精密量取供试品溶液1ml和对照品溶液2ml，置同一200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使萘普生色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液中杂质Ⅰ峰面积(0.1%)；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中杂质Ⅰ峰面积的2倍(0.2%)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液中萘普生峰面积(0.5%)。
五、对乙酰氨基酚中氨基酚和对氯苯乙酰胺的检查
(一) 合成工艺
对乙酰氨基酚的合成工艺主要是：以对硝基氯苯为原料，水解后制得对硝基酚，经还原生成对氨基酚，再经乙酰化制得成品；或以苯酚为原料，经亚硝基化及还原反应制得对氨基酚。

(二) 有关物质检查
由于本品的合成路线较多，不同生产工艺引入的有关杂质不尽相同，它们主要包括合成中间体、副产物及分解产物，如对硝基酚、对氨基酚、对氯苯胺、对氯苯乙酰胺、o-乙酰基对乙酰氨基酚、偶氮苯、氧化偶氮苯、苯醌和醌亚胺等。ChP采用HPLC法检查对氨基酚及其他有关物质，因为对氯苯乙酰胺的极性小，无法在同一色谱条件下一并检查，故药典将流动相中甲醇的比例由10%提高至40%后单独检查对氯苯乙酰胺。
1．对氨基酚及有关物质 临用新制。取本品适量，精密称定，加溶剂〔甲醇-水(4∶6)〕制成每1ml中约含20mg的溶液，作为供试品溶液；另取对氨基酚对照品和对乙酰氨基酚对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并制成每1ml中约含对氨基酚1μg和对乙酰氨基酚20μg的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法试验。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氢氧化铵溶液12ml)-甲醇(90∶10)为流动相；检测波长为245nm；柱温为40℃；理论板数按对乙酰氨基酚峰计算不低于2000，对氨基酚峰与对乙酰氨基酚峰的分离度应符合要求。取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对氨基酚色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液中对氨基酚保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含对氨基酚不得过0.005%；其他杂质峰面积均不得大于对照品溶液中对乙酰氨基酚的峰面积(0.1%)；杂质总量不得过0.5%。
2．对氯苯乙酰胺 临用新制。取对氨基酚及有关物质项下的供试品溶液作为供试品溶液；另取对氯苯乙酰胺对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并制成每1 ml中约含1μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法试验。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氢氧化铵12ml)-甲醇(60∶40)为流动相；检测波长为245nm；柱温为40℃；理论板数按对乙酰氨基酚峰计算不低于2000，对氯苯乙酰胺峰与对乙酰氨基酚峰的分离度应符合要求。取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对氯苯乙酰胺色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl ，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，含对氯苯乙酰胺不得超过0.005%。
第四节 含量测定
基于药物结构中游离羧基的酸性和芳环的紫外吸收特性，本类药物原料药的含量测定主要采用酸碱滴定法，制剂的检查性定量测定，如溶出度(释放度)、含量均匀度等主要采用紫外-可见分光光度法，而制剂的含量测定则采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法。
一、酸碱滴定法
本类药物原料药的酸碱滴定法主要采用直接滴定法，亦可采用剩余量回滴法或非水溶液滴定法。
(一) 直接滴定法
直接滴定法即将药物溶于中性乙醇、甲醇或丙酮中，以酚酞、酚红或酚磺酞为指示剂，用氢氧化钠滴定液直接滴定。以阿司匹林含量测定为例，反应原理与测定法如下：

取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。
阿司匹林在水中微溶，易溶于乙醇，故使用乙醇为溶剂。因本品相对于氢氧化钠为弱酸，用氢氧化钠滴定时，化学计量点偏碱性，故指示剂选用在碱性区变色的酚酞。因乙醇对酚酞指示剂显酸性，可消耗氢氧化钠而使测定结果偏高。所以，乙醇在使用之前需先用氢氧化钠中和至对酚酞指示剂显中性。
滴定应在不断振摇下稍快进行，以防止局部碱浓度过大，致使阿司匹林酯结构水解。温度在0~40℃范围内对测定结果无显著影响。
因本法缺乏专属性，易受阿司匹林的水解产物水杨酸及醋酸的干扰，故本法不适用于水杨酸含量较高的试样测定。
水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生及尼美舒利等均采用本法测定含量。其中，二氟尼柳和萘普生在甲醇中的溶解度较大，使用甲醇-水为溶剂；尼美舒利则使用丙酮为溶剂。二氟尼柳使用酚红指示剂、甲芬那酸则使用酚磺酞指示剂。
(二) 剩余量滴定法
美洛昔康含有与羰基共轭的烯醇式羟基，具有羧酸性质，显一价酸性。故亦可用氢氧化钠滴定液滴定。但本品甲醇、乙醇及水中极微溶解或几乎不溶，在丙酮中微溶。所以，ChP使用定量过量的氢氧化钠滴定液溶解后，用盐酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液。方法如下：
取本品约0.4g，精密称定，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，微温溶解，放冷，加中性乙醇(对溴麝香草酚蓝指示液显中性)100ml，加溴麝香草酚蓝指示液10滴，用盐酸滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于35.14mg的C14H13N3O4S2。
(三) 水解后剩余量滴定法
1．水解后剩余量滴定法 利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的特性，加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯键水解后，再用硫酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液。USP32-NF27、BP2009、JP15等均采用本法测定阿司匹林含量。

2NaOH + H2SO4→Na2SO4 + 2H2O
USP32-NF27方法：取本品约1.5g，精密称定，加氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)50.0ml，混合，缓缓煮沸10分钟，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液(0.25mol/L)滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)相当于45.04mg的C9H8O4。
碱液在受热时易吸收二氧化碳，生成碳酸盐，当用酸回滴定时，酸滴定液的消耗体积会减小，使测定结果偏高。故需在相同条件下进行空白试验校正。为减少二氧化碳的影响，JP15在装有附带二氧化碳吸收管(Soda Lime，氢氧化钙与氢氧化钠/钾的混合物)的回流冷凝器的锥形瓶中加热水解。
从上述反应式可知：阿司匹林与氢氧化钠反应的摩尔比为1∶2。则：
T=0.5×(1/2) ×180.16 = 45.04(mg/m1)

式中，V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积(m1)；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积(m1)；W为阿司匹林样品的称取量(g)；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为氢氧化钠滴定液的滴定度。
2．两步滴定法 两步滴定法系水解后剩余量滴定法的改进。因阿司匹林片剂中除存在其水解产物水杨酸及醋酸外，在制剂工艺中添加了抑制阿司匹林水解的稳定剂酒石酸或枸橼酸。因而无法使用直接滴定法测定含量，且使用水解后剩余量滴定法时，稳定剂对测定亦存在干扰，为消除片剂中酸性降解产物及稳定剂对阿司匹林测定的干扰，ChP2005曾收载两步滴定法测定阿司匹林片和肠溶片的含量。
两步滴定法系指测定过程分为两步进行：第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂(同时中和阿司匹林的游离羧基)，以消除其干扰；第二步水解与滴定，即水解后剩余量滴定法。阿司匹林片含量测定方法如下：
中和：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量(约相当于阿司匹林0.3g)，置锥形瓶中，加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml，振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液(0.1moL/L)至溶液显粉红色。此时中和了供试品中存在的游离酸，阿司匹林也同时成为钠盐。
水解与滴定：在中和后的供试品溶液中，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)40ml，置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。
含量计算：供试品中阿司匹林的含量，由水解时消耗的碱量计算。因为在第一步中和时，已将阿司匹林的游离羧酸中和，所以在第二步水解后剩余量滴定法时阿司匹林与氢氧化钠反应的摩尔比为1∶1，故氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的滴定度T = 0.1×(1/1) ×180.16=18.02(mg/m1)。含量计算式如下：

式中，V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积(m1)；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积(ml)；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为氢氧化钠滴定液的滴定度(mg/ml)；W为供试品片粉的取样量(g)；`W为供试品的平均片重(g)；标示量为片剂的规格(mg/片)。
(四) 非水溶液滴定法
吡罗昔康具有吡啶环、显碱性，可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定。方法如下：取本品约0.2g，精密称定，加冰醋酸20ml使溶解，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于33.14mg的C15H13N3O4S。
二、紫外-可见分光光度法
本类药物制剂含量测定可采用直接紫外-可见分光光度法，或采用柱分配色谱-紫外分光光度法。
(一)直接紫外-可见分光光度法
ChP2010收载的二氟尼柳、美洛昔康、尼美舒利制剂，对乙酰氨基酚及其部分制剂均采用本法测定。以二氟尼柳胶囊含量测定为例，方法如下：
取装量差异项下的内容物，研细，精密称取适量(约相当于二氟尼柳0.1g)，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸乙醇溶液适量，超声处理10分钟使二氟尼柳溶解，放冷，用0.1mol/L的盐酸乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，用0.1mol/L的盐酸乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，在315nm的波长处测定吸光度；另取二氟尼柳对照品，精密称定，用0.1mol/L的盐酸乙醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液作为对照品溶液，同法测定，计算，即得。

式中，AS和AR分别为供试品溶液和对照品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度(mg/m1)；`W为胶囊平均装量(g/粒)；W为胶囊内容物细粉的称取量(g)；D为供试品溶液的稀释体积(ml，D=100´100/5=2000)；标示量为胶囊剂的规格(mg/粒)。
三、高效液相色谱法
药物制剂中的有关物质、辅料、稳定剂等，常对主成分的含量测定构成干扰。除可采用两步滴定法、柱分配色谱-紫外分光光度法外，高效液相色谱法作为在线分离检测技术被广泛应用于本类药物制剂的含量测定。ChP2010收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂大多采用离子抑制-反相高效液相色谱法测定，用外标法计算含量。以阿司匹林栓的含量测定为例，方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)为流动相；检测波长为276nm。理论板数按阿司匹林峰计算不低于3000，阿司匹林峰与水杨酸峰的分离度应符合要求。
测定法：取本品5粒，精密称定，置小烧杯中，在40~50℃水浴上微温熔融，在不断搅拌下冷却至室温，精密称取适量(约相当于阿司匹林0.1g)，置50ml量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液适量，在40~50℃水浴中充分振摇使阿司匹林溶解，放冷，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1小时，取出，迅速滤过，取续滤液作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿司匹林对照品，精密称定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。

式中，CR为对照品溶液浓度(mg/ml)；AX和AR分别为供试品溶液和对照品溶液的峰面积；D为稀释体积(ml，D=50´100/5=1000)；W为栓剂熔融物取样量(g)；`W为栓剂平均粒重(g)；标示量为栓剂规格(mg/支)。
本法为反相离子抑制色谱，流动相中添加冰醋酸是为抑制阿司匹林的解离，进而消除因色谱柱对阿司匹林的吸附而造成的色谱峰拖尾现象。同时，流动相及供试品溶液中的醋酸也可抑制阿司匹林的水解，增加溶液的稳定性。
ChP2010收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂含量测定的色谱条件及定量方法见表6-4。
典型非甾体抗炎药物制剂含量测定的色谱条件与定量方法
药物制剂
色谱条件
定量方法
色谱柱
流动相
检测波长
阿司匹林片/肠溶片
/肠溶胶囊/泡腾片/栓
ODS
乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)
276nm
外标法/
峰面积
甲芬那酸片/胶囊
ODS
0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(用氨试液调节pH至5.0)-乙腈-四氢呋喃(40∶46 ∶14)
254nm
外标法/
峰面积
双氯芬酸钠肠溶片
ODS
甲醇-0.12%冰醋酸溶液(20∶80)
276nm
外标法/
峰面积
布洛芬片/胶囊/缓释
胶囊/口服溶液/糖浆
ODS
醋酸钠缓冲液(取醋酸钠6.13g，加水750ml使溶解，用冰醋酸调节pH至2.5)-乙腈(40∶60)
263nm
外标法/
峰面积
布洛芬混悬滴剂
ODS
甲醇-乙腈-水-磷酸(65∶10∶25∶0.03)
220nm
外标法/
峰面积
酮洛芬肠溶胶囊/搽剂
ODS
磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾68.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH至3.5±0.1)-乙腈-水(2∶43∶55)
255nm
外标法/
峰面积
萘普生片/胶囊
/栓/颗粒
ODS
甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(75∶25)，用磷酸调节pH至3.0
272nm
外标法/
峰面积
对乙酰氨基酚泡腾片
/注射液/滴剂/凝胶
ODS
磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠二水合物15.04g、磷酸氢二钠0.0627g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH至4.5)-甲醇(80∶20)
254nm
外标法/
峰面积

药品质量控制中现代分析方法的进展

随着我国对药品质量的日益重视和自主创新药物研制的迫切需要，色谱分析和光谱分析已成为药物研究中最重要的分析方法，色谱分析和光谱分析技术结合的联用技术更是必不可少，发展亦十分迅速。
第一节 毛细管电泳及其应用
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。与HPLC法相似，两者均为液相分离技术，有多种分离模式，且仪器操作可自动化；但遵循不同的分离机制。虽然由于CE的工作原理和运行方式所限，CE检出的灵敏度和精密度通常不及HPLC，但是，CE和HPLC的适用范围在很大程度上互为补充。所以，早在2000年USP24中就收录了CE法。自此，毛细管电泳法就相继被国际上主要的药典所收录。这为毛细管电泳在药物分析中更广泛的应用奠定了基础。
CE具有如下优点：
1.高效 理论板数为每米几十万，高者可达几百万乃至几千万，而HPLC一般为几千到几万。
2.高速 最快可在约1分钟内完成分离。有文献报道，在4分钟内可分离10种蛋白质，1.7分钟内分离19种阳离子及3分钟内分离30种阴离子。
3.微量 只需纳升级的进样量，仅为HPLC的几百分之一。
4.低消耗 只需少量(ml量)溶剂和价格低廉的毛细管。
所以CE也常常被称为HPCE。CE使用的检测器主要为紫外-可见分光光度检测器，此外还有激光诱导荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。以下重点讨论毛细管电泳的主要分离模式，及其在药物分析中的应用。
一、CE的主要分离模式
采用CE作为药物分离的手段时，首先需要根据待分离物质的存在状态来选择不同的分离模式。
(一) 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)
CZE是毛细管电泳中最基本、应用最广泛的一种分离模式。主要适用于以离子状态存在的样品。在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移，产生电泳流。CE通常采用的是石英毛细管柱，在一般情况下(pH>3)内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子整体地朝负极方向移动，产生电渗流。在多数情况下，电渗流的速度是泳流速度的5～7倍。
CZE 既可以使用水相缓冲溶液，也可以使用有机相缓冲溶液进行分离。在有