甘草酸通过c-Jun氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的IPEC-J2细胞炎症反应.pdf

动物营养学报，（）：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应赵潇晗，司 玮 赵青余 张军民 赵金山 秦玉昌（青岛农业大学动物科技学院，青岛；中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京）摘 要：本试验旨在研究甘草酸（）缓解脂多糖（）诱导的 细胞炎症的分子机制。选择 细胞作为研究对象，采用 法检测 在不同浓度（、）下处理不同时间（、）后的细胞活力，从而确定合适的 处理条件。试验共设 个组，分别为对照组 细胞生长 后，经二甲基亚砜（）处理 再经杜氏磷酸缓冲液（）共同处理 、组（细胞生长 后，经 处理 再经 的 共同处理 ）、组（细胞生长 后，经 的 处理 再经 共同处理 ）和 组（细胞生长 后，经 的 处理 再经 的 共同处理 ）。采用酶联免疫吸附试验（）法检测 和 处理后细胞上清液中白细胞介素（）、白细胞介素（）和肿瘤坏死因子（）以及高迁移率族蛋白（）的水平，实时荧光定量（）检测细胞中、和 的 表达水平，蛋白质免疫印迹（）法和免疫荧光染色法检测细胞中 样受体（）信号通路相关蛋白的表达水平。结果显示：）与未添加 相比，浓度为 的 处理 对 细胞活力无显著影响（），故后续选择浓度为 的 处理 作为 的适宜处理条件。）与对照组相比，组中 的水平和 表达水平显著升高（）；与 组相比，组中 的水平和 表达水平显著降低（）。）与对照组相比，刺激显著增加了 氨基末端蛋白激酶（）和 的蛋白表达水平（）；与 组相比，预处理显著降低了和 的蛋白表达水平（），但对 丝裂原活化蛋白激酶（）、核因子（）的蛋白表达水平无显著影响（）。）组细胞核中磷酸化（）荧光强度显著高于对照组（），且 预处理可使细胞核中 荧光强度显著下降（）。综上所述，可以通过下调 基因表达以及 氨基末端蛋白激酶（）信号通路相关蛋白表达，缓解 引起的 细胞的炎症反应。关键词：甘草酸；细胞；信号通路；抗炎功能中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家重点研发计划（，）；中国农业科学院科技创新工程（）作者简介：赵潇晗（），女，陕西西安人，硕士研究生，研究方向为畜产品质量与安全。：通信作者：赵金山，教授，博士生导师，：；秦玉昌，研究员，博士生导师，：养猪业作为我国当前养殖业中的重点产业，对于我国农业发展有着相当重要的作用。对于动物来说，肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所，也是机体最大的免疫和内分泌器官，因此充分 期赵潇晗等：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应了解并维护猪的肠道健康是猪养殖的核心。肠道上皮是由单层上皮细胞构成的绒毛样组织，肠上皮细胞作为肠道的物理屏障，将肠腔内容物与内部环境分隔，降低侵入性外来物造成感染的风险，故上皮细胞的完整性对于维持外部和内部环境的稳态至关重要。当肠道在生理或病理情况下发生炎症时，肠道上皮细胞都会分泌信号分子，如黏蛋白、细胞因子和趋化因子，以防止肠道中有害微生物的入侵。脂多糖（，）是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种关键脂质成分，可触发机体及细胞的免疫反应。活化 样受体（，）后，将信号呈递给下游反应因子髓样分化因子（，），从而激活核因子（，）信号通路，入核刺激炎症细胞因子白细胞介素（，）、白细胞介素 （，）和肿瘤坏死因子（，）等的产生。除此之外，丝裂原活化蛋白激酶（，）是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，其介导的信号转导通路在机体的炎性反应中发挥重大作用。猪发生肠道炎症会引起腹泻、采食量下降以及体重下降，严重时甚至会引起猪的死亡，影响生产效率，制约养猪业的发展。因此，寻找缓解猪肠道上皮细胞炎症的药物，减轻肠道炎症对养猪业的影响，是目前养猪业中亟需解决的问题。甘草为豆科甘草属植物，是一种古老且常用的药食同源中草药，甘草中的主要功能组分有皂苷类化合物、黄酮类化合物和甘草多糖。甘草酸（，）是甘草皂苷类化合物中的一种，具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、抗病毒等。有研究表明，可以显著降低放射性肠炎中的肠道损伤以及炎症因子、的分泌，并且 作为高迁移率族蛋白（，）的特异性抑制剂，可以通过抑制 信号通路，减轻小鼠放射性肠炎的发生。同时，能通过下调 诱导的小鼠子宫内膜上皮细胞 相关蛋白表达和 活化来抑制炎症相关因子的释放。除 此 之 外，还 可 以 通 过 抑 制 鸡 的 信号通路中的 氨基末端蛋白激酶（，）和 丝裂原活化蛋白激酶（，）的表达来抵抗支原体引发的炎症和细胞凋亡。但目前有关 在猪肠道炎症中作用的研究还较少，本试验通过探究 对 诱导的 细胞炎症的影响来阐明 的抗炎作用机制，以期为猪肠道炎症研究提供参考。材料与方法 试验试剂 胎牛血清（，）、细胞培养基、青霉素链霉素、胰蛋白酶、免疫印迹超敏发光液和 购自 公司；购自 公司；裂解液（中）、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂、溶液和 溶液购自北京华兴博创基因技术有限公司；（分析标准品，）、封闭用山羊血清和抗荧光淬灭剂购自于上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（，）和杜氏磷酸缓冲液（，）购自于 公司；（）细胞活力检测试剂盒和蛋白上样缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗磷酸化 氨基末端蛋白激酶（，）、磷酸 化（，）、核因子（，）、磷酸化核因子 （，）、甘油醛磷酸脱氢酶（，）、（）、（）抗体购自 公 司；猪、和 的酶联免疫吸附测定（，）试剂盒购自江苏雨桐科技有限公司；细胞总 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自宝日医生物技术有限公司。细胞培养 使用含有 的 细胞培养基培养 细胞，培养条件为 、的细胞培养箱，当细胞融合度达到 左右时，用胰蛋白酶进行消化传代。动 物 营 养 学 报 卷 细胞活力检测将 细 胞 按 照 个 孔 接 种 到 孔细胞培养板内，分别在培养、后加入 含有不同浓度 的 溶液，使培养基中 终 浓 度 分 别 达 到、，再 分 别 培 养、后，使 用 试剂盒检测细胞活力，操作步骤按照说明书进行。每个 处理的浓度、时间设置 个重复。试验分组 根据 所得试验结果确定 处理的浓度和时间。试验共设 个组，即对照组（细胞生长 后，经 处理 再经 共同处理 ）、组（细胞生长 后，经 处理 再经 的 共同处理 ）、组（细胞生长 后，经 的 处理 再经 共同处理）和 组（细胞生长 后，经 的 处理 再经 的 共同处理 ）。炎症细胞因子分泌及基因表达检测 将 细胞以 个 孔的细胞数接种于六孔板。按照 中方法分组处理细胞后收集细胞培养基，以 离心 去除颗粒物质，取上清液按照 检测试剂盒说明书检测、和 水平。收取细胞，提取细胞总 并反转录合成。数据库查询得到猪、和 基因 序 列，使 用 设 计 引 物（表），引物由北京新时代众和科技有限公司合成。以 为内参基因，进行实时荧光定量 检测。反应体系为 ，其中上、下游引物各 ，。使用两步法 反应程序进行实时荧光定量。第 步为 预变性 ；第 步为 变性 ，延伸 ，个循环；第 步为 ，的熔解曲线分析。采用 法计算目的基因 表达水平。表 实时荧光定量 引物 基因引物序列 （）登录号 产物长度 白细胞介素：白细胞介素：肿瘤坏死因子：甘油醛磷酸脱氢酶：蛋白质免疫印迹（）检测 将 细胞以 个 孔的细胞数接种于 细胞培养皿中，按照 中的方法分组处理并收取细胞后，使用含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的 裂解液（中）于冰上提取蛋白。使用 试剂盒检测样品蛋白浓度。按照 每孔的蛋白上样量使用 分离胶进行电泳。观察到溴酚蓝染料电泳至离胶底部约 左右处后开始电转。根据蛋白大小将膜裁下进行封闭。使用含有 脱脂奶粉的 于室温下封闭。使用含有 脱脂奶粉的 按照抗体使用说明书推荐比例稀释、和 抗体，孵育过夜。经 洗涤 次后，使用二抗（）室温孵育 ，并再次使用 洗涤 次，使用超敏发光液于 凝胶成像系统发光拍摄。结果使用 软件进行统计分析。免疫荧光检测 将 细胞以 个 孔的细胞数接种 期赵潇晗等：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应于放有爬片的 孔板中，按照 中的方法分组处理细胞。除去培养基，洗涤 次后，多聚甲醛 固定 ，再洗涤后用 室温下通透 ，洗涤后用含有 山羊血清的 在 下封闭 ，用 山羊血清配制的 一抗工作液（）过夜，山羊抗兔二抗工作液（）避光孵育 ，二脒基苯基吲哚（，）避光孵育 ，防荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察并拍照。结果使用 软件进行统计分析。数据统计与分析 使用 统计软件分析数据。采用单因素方差分析（）程序分析细胞活力、炎症细胞因子分泌和基因 表达水平以及相关信号通路蛋白表达水平的统计学差异，差异显著时采用 氏法进行多重比较。表示差异显著，表示差异极显著。结果与分析 对 细胞活力的影响 为确定 的处理条件，用不同浓度（、）分别处理 细胞、和 。如图 所示，处理 时，不同浓度 对细胞活力无显著影响（）；处理 时，浓度为 时细胞活力高于未 添 加 时，而 浓 度 为、时细胞活力均低于未添加 时，但不同甘草酸浓度间差异不显著（）；处理 时，随着 浓度的升高，细胞活性呈先升后降的趋势，当浓度为 时，细胞活力急剧下降，显著低于其他浓度时（）。因此，本试验选择 的 处理 作为后续处理条件。对 刺激后 细胞中炎症细胞因子分泌的影响 为探究 在 炎症反应中的作用，用 刺激 产生炎症，作用 后，激活相关信号通路引起炎症细胞因子、及 等的表达。本试验用 的 预处理 细胞 ，再用 的 共同处理 ，采用 法检测细胞上清液中、的水平。如图、图 和图 所示，与对照组相比，刺激细胞后，细胞上清液中、的水平显著升高（），预处理可显著降低 刺激后细胞上清液中 的水平（），但对、的水平无显著影响（）。刺激细胞后，细胞内 被动释放，诱导炎症反应。作 为 的 抑 制 剂，可 能 通 过 抑 制 的 活 性 来 缓 解 炎 症，因 此 本 试 验 采 用 法检测了细胞上清液中 的水平，如图 所示，细胞上清液中 的水平各组间无显著差异（）。同一处理时间时，数据点标注不同小写字母表示不同甘草酸浓度间差异显著（），相同字母表示不同甘草酸浓度间差异不显著（）。，（），（）图 对 细胞活力的影响 对 刺激后 细胞中炎症细胞因子 表达水平的影响 本试验进一步检测了细胞中、的 表达水平变化。如图 所示，相对于对照组，刺激显著增加了细胞中 的 表达水平（）；相对于 组，预处理显著降低了 刺激后细胞中 的表达水平（）。如图 和图 所示，细胞中、的 表达水平各组间无显著差异（）。动 物 营 养 学 报 卷 对 刺激后 细胞中 信号通路相关蛋白表达水平的影响 为了探究 缓解 刺激下 炎症发生的相关机制，本试验采用 和免疫荧光染色法检测了细胞 信号通路中 和 信号通路相关蛋白表达水平的变化。采用 法检测细胞中 表达水平，由图 和图 可知，细胞中 及 的蛋白表达水平各组间均无显著差异（）。作用 后还可以通过活化 信号通路，介导胞外信号进入细胞调节炎症反应，因此本试验采用 法检测了细胞中 、以及 的蛋白表达水平。由图 可知，的蛋白表达水平不同组间无显著差异（）。由图 和图 可知，相对于对照组，组细胞中 和 的蛋白表达水平显著升高（）；相对于 组，预处理后显著降低了 刺激后细胞中 和 的蛋白表达水平（）。采用免疫荧光法检测了细 胞 核 中 的 蛋 白 表 达 水 平 变 化，由图、图 可知，组细胞核中 的荧光强度显著高于对照组（）；相对于 组，预处理可以显著减弱细胞核中 的荧光强度（）。以上结果说明，相对于对照组，刺激显著增加了 的水平，并显著增加了 和 的水平，且相对于 组，预处理可以显著降低 的水平，并进一步显著降低 与 的水平。数据柱标注不同小写字母表示组间差异显著（），无字母或相同字母表示组间差异不显著（）。下图同。（），（）图 对 刺激后 细胞上清液中炎症细胞因子水平的影响 讨 论 也称为内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的主要生物活性成分。会导致猪肠道炎症，损害肠道健康，故目前 刺激 细胞产生炎症是目前较为理想的研究模型。甘草是目前最常用的中草药之一，南朝医学家陶弘景将甘草尊为“国老”。作为甘草中主要的活性功能成分，在 年被联合国粮农组织和世卫组织食品添加剂联合专家委员会列入了使用名单，已经被证实在体内体外都具有重要的抗炎、抗氧化、抗菌等作用。有研究表明，可缓解沙门氏菌诱导的小鼠空肠炎症反应以及肠道菌群失调。除此之外，还可以提高肉鸡的生长性能与免疫状态。但当前 在缓解猪肠道炎症中发挥的作用的相关研究还比较少见，本试验通过研究 对 诱导的 细胞炎症反应的影响，证明了 对于 诱导 细胞炎症的抑制作用可能与 信号通路有关。期赵潇晗等：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应图 对 刺激后 细胞中炎症细胞因子 表达水平的影响 图 为 法检测细胞中 信号通路相关蛋白的表达情况；图 图 分别为细胞中 、和 的蛋白表达水平。；，图 对 刺激后 细胞中 信号通路相关蛋白表达水平的影响 动 物 营 养 学 报 卷 图 为激光共聚焦显微镜观察到的细胞核中 的荧光图像；为细胞核中 的荧光强度。；图 对 刺激后 细胞核中 信号通路相关蛋白荧光强度的影响 在炎症发生过程中，细胞因子水平变化起着至关重要的作用，是一种促炎细胞因子，发挥传递病原体入侵信号或传递组织损伤信号，从而刺激急性炎症反应发生的作用。在生理条件下，几乎无法检测到，但 分泌过度则会导致机体炎症相关疾病的产生。有研究发现，在大鼠溃疡性结肠炎模型中，的水平显著升高，茜草可以通过下调 的水平改善结肠组织病理学变化以及炎症反应。等发现，通过下调大鼠神经炎症中 的水平，可以缓解大鼠的神经炎症，减轻神经元损失和认知缺陷的症状。在本试验中，刺激 细胞产生炎症，细胞中 的基因表达及分泌水平显著升高，但 预处理可以显著降低 刺激后 水平的升高，改善细胞炎症，这表明 可以有效缓解 诱导的 细胞中 的产生，从而调节炎症的发生。作用 后，可能 会 激 活 和 信号通路，调节机体炎症反应。是几乎存在于所有细胞中的一种转录因子，在细胞炎 症 反 应 中 发 挥 重 要 作 用，可 诱 导、以及 等促炎细胞因子的产生。有研究表明，能抑制 活化的 信号通路，减轻小鼠 细胞的炎性损伤。在本研究中，可显著降低 刺激下 细胞中、的分泌，但 刺激下、的转录水平虽高于对照组但无显著差异，与前人结果不一致。在 刺激单核细胞的相关研究中，研究人员发现 刺激下的单核细胞合成分泌 及 存 在 剂 量 以 及 时 间 依 赖性。本试验中，的 刺激 细胞 后，、可能已过合成分泌峰值，导致其基因表达水平相对于对照组无显著差异，但具体机制还有待进一步研究。除此之外，以及 对 蛋白表达水平无显著影响，故本试验中 可能是通过其他炎症相关通路来缓解 引起的细胞炎症。是一种核蛋白，广泛存在于哺乳动物细胞中。细胞受到外界刺激后可被动释放 参与机体炎症的发生。有研究表明，作为 的抑制剂，可以通过抑制 和 信号通路抑制 样受体热蛋白结构域相关蛋白（期赵潇晗等：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应 ，）的 产 生 来 改 善 大 鼠 的 坏 死 性 肠 道 炎症。但在本研究中，刺激后 细胞培养液中 水平无显著变化。张芸等在关于 诱导 细胞内 转位及释 放 的 研 究 中 也 有 类 似 结 果，该 研 究 发 现 细 胞 接 受 刺 激 后 活 化 和 释 放 存在剂量依赖关系，较小剂量的 不会显著增加细胞内 的释放，且与其他炎症因子相比，的释放时间较为延迟，可能是由于本试验中 刺激时间不足以引起 细胞中 的释放。信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是细胞增殖、分化、凋亡以及炎症发生中关键的信号通路。分为 个亚族，其中 信号通路可被外界刺激激活后作用下游多种转录因子，其中包括、样 蛋 白 （，）、等，产生生长、分化、炎症等生理效应。等研究发现，姜黄素类似物 可以通过抑制 磷酸化来防止心肌细胞的炎症和凋亡，保护心脏免受肥胖引起的心肌损伤。也有研究表明，反式甲氧基肉桂醛抑制了巨噬细胞中由 诱导的 磷酸化以及 的表达，从而降低诱导型一氧化氮合酶（，）和环氧化酶（，）的水平。综上可知，和 在机体炎症进程中发挥着重要的作用，故可通过抑制 和 的磷酸化来调节机体炎症的发生。本试验发现，刺激 细胞后，促炎细胞因子 的水平升高，通过检测上游信号通路相关的蛋白的表达水平发现，刺激下细胞中、及 的蛋白表达水平显著升高，而 可以通过调节 信号通路相关蛋白的表达缓解炎症发生，说明 可以通过下调 信号通路来缓解 引起的 细胞的炎症反应，该结果可为 作为饲料添加剂的使用提供理论依据。结 论 综上所述，可以通过减弱由 刺激引起的 磷酸化，进而减少 和 的水平，降低下游 的基因表达和分泌，来减轻 细胞的炎症反应。参考文献：江慧青，李宁植物提取物对猪肠道健康的影响养猪，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，：王斌色氨酸缓解动物肠道炎症的作用机制研究博士学位论文北京：中国农业大学，：，（），：由大鹏，张絮颖，刘丽娜，等替代抗生素饲料添加剂研究进展畜牧与饲料科学，（）：，（）：，（）动 物 营 养 学 报 卷 刘一甘草提取物及有效成分的抗菌活性研究硕士学位论文延吉：延边大学，：，（），（）：，（）：，：，：，（）：，：，：李林霏，毛福英，李斯琦，等甘草甜素的药理活性、作用机制及其应用进展 中华中医药学刊，（）：，（）：，：高嘉豪，乔彦杰，连科迅，等甘草酸对脂多糖应激黄羽肉仔鸡免疫性能的影响 中国畜牧兽医，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：郇长超 在猪流行性腹泻病毒感染中作用机制的研究博士学位论文南京：南京农业大学，：，（），（）：马铮铮脆弱类杆菌 对人外周血单核细胞分泌 期赵潇晗等：甘草酸通过 氨基末端蛋白激酶通路缓解脂多糖诱导的 细胞炎症反应 和 的影响硕士学位论文长沙：中南大学，：，（）罗敏，肖婷婷，曾星，等甘草酸对 诱导的 细胞 通路及炎症因子表达的影响中国免疫学杂志，（）：，（）：，（），（）：张芸，赵中夫 诱导 细胞内 转位及释放实验研究长治医学院学报，（）：，（）：（），：，（）：，：，：，：，：；，：，（，；，）：（）（）（，）（，），（）（），（），（动 物 营 养 学 报 卷 ）（）（）（），（），（）（），（）（）：），（），），（）；，（），（）（）；，（），（）（）（）（）（），（），（），（）：；（责任编辑 菅景颖）