放线菌次级代谢途径的设计.pdf

1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/生物工程进展1999,Vol.19,No.5放线菌次级代谢途径的设计周军唐雅君张惠展(华东理工大学生化工程系上海200237)摘要近来有关放线菌次级产物生物合成的分子遗传学和生物化学方面的进展为我们改造其代谢途径提供了一个明确的方向。近年来,对微生物的初级代谢途径进行基因改造取得了成功,但放线菌的次级代谢工程产物却都没有达到中试或生产规模。进展如此缓慢的主要原因是放线菌自身复杂的代谢途径以及细胞循环中复杂的调节方式及其特异性。目前人们着力于通过基因操作改造酶,从而重新设计以其催化产物为基本骨架的代谢途径,最终产生修饰的或新的天然终产物。本文将讨论达到此目的的几种设计策略。关键词放线菌次级代谢抗生素代谢工程62脱氧己糖代谢多聚链肽。前言所谓代谢工程(metabolic engineering)指的是通过改变细胞内的生化途径产生目的代谢产物的生物技术,使天然终产物过量生产或合成新产物,其中新产物可能是传统途径中的中间产物或经修饰的终产物1。近年来,由于DNA重组技术的发展,使得用基因技术改造代谢途径成为可能。代谢工程的特点是对分解代谢和合成代谢中多步催化反应进行定向的遗传改变。目前,对微生物初级代谢途径的生化改造已有成功的例子,如:(1)通过引入编码依赖NADPH的2,52二酮2D2葡萄糖酸(2,52DKG)还原酶基因产生了欧文氏菌属突变株;2(2)通过多拷贝载体增强使终产物脱敏的32脱氧2D2阿拉伯糖2景天糖酸酶基因以及编码分枝变位酶和预苯酸脱水酶等代谢分支点基因(它们对L2色氨酸和L2苯丙氨酸的反馈抑制不敏感)的表达,构建了高产L2色氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株,该菌株同时可大量产生L2苯丙氨酸3;(3)导入木聚糖醇基因获得了将半纤维素转化成乙醇的大肠杆菌工程菌4。与初级代谢相反,放线菌次级代谢产物或菌株都没有达到中试或生产规模,在此领域进展缓慢的主要原因是放线菌代谢途径的复杂性、菌株特异性(大部分情况下一种途径仅存在于某一特定种类的少数菌株中)以及遗传不稳定性。1放线菌次级代谢产物生物合成途径的特性放线菌可以产生相当多的低分子量次级代谢物。迄今为止,大约上万种生物活性物质(如抗生素)中的三分之二是由放线菌产生的,这与其自身的生理特性是分不开的。在放线菌生活周期中,营养细胞分化成气生菌丝和孢子时,需要大量丰富多彩的次级代谢来合成各种控制分化和细胞周期的专一性物质,并且次级代谢在细胞进化过程中不断被优化改造,这种改造过程的特征是生物合成途径中新基因组的形成,酶蛋白的功能转换及某种现存基因或酶的缺失,结果产生了为数众多的代谢物家族。细菌细胞内终产物的多样性是由以下因素决定的:(1)各种形式的酶催化功能向不同方向演变;(2)代谢途径发生多样性异化;(3)产生新产物的生物合成基因重新组合。次级代谢的途径可能是线性的(所有反应都发生于一个前体),也可能是分支的(两个或多个前体缩合之前被活化或修饰过)。一般说来,绝大多数不同的次级代谢途径基本上包括:(1)由细胞中间代谢活化前体生成的各种次级代谢产物;(2)以均一、不04 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/均一前体或活性前体(如酰基辅酶A单位)为反应单位的重复寡聚化反应;(3)在根途径或中间代谢分枝途径中,前体经不同修饰生成的中间物为单位的缩合反应;(4)大量修饰作用如氧化还原、基因转移、水解作用或同分异构化等的存在;(5)大部分放线菌次级代谢产物的专一性耗能输出系统;(6)调节物对代谢途径基因表达的专一性调控。上述性质构成了代谢工程的基本特征。2代谢途径中酶的演化次级代谢中参与生物合成的功能特异性酶大多是从一般的前体酶或蛋白质的功能区域演化而来。进化过程中,酶蛋白的子代组成了大的酶家族。这可能是通过基因的聚合形成特殊的功能簇,也可能由多功能酶蛋白的结构域融合而成(如?型多聚链合成酶)5;或经单亚基或小分子的功能蛋白融合而成。(如 型多聚链合成酶或氨基酸转移酶)。放线菌中62脱氧己糖(62DOH)及其衍生物的合成是酶修饰作用多样性的一个典型例子。62DOH是构成各种次级代谢产物的基本单位,一般由活化核苷二磷酸己糖(D2葡萄糖或D2甘露糖)生成42酮基262脱氧中间物,然后在NAD依赖的NDP2己糖24,62脱水酶催化下生成。通过在己糖不同位置上的异构化、还原、转氨、甲基化、脱水、C2C键断裂以及乙酰化等修饰作用可形成种类繁多的衍生物,其中超过七十种是在已知的放线菌代谢物中单独发生反应的6。若是在己糖链的2,3或4位上进行修饰,将生成D26DOH;若脱水后被3,52差向异构酶催化,则终产物将是L26DOH中的一种。产生D26DOH和L26DOH的路径可同时存在于同一菌株中,并产生相同的终产物。从蛋白质的相似性来看,所有的NDP2己糖合成酶与其它代谢合成酶类构成酶家族,其中如dTDP2葡萄糖合成酶、CDP2葡萄糖合成酶7和GDP2甘露糖合成酶,属于NDP2己糖合成酶;大肠杆菌中的UDP2N2乙酰氨基葡萄糖合成酶8及大肠杆菌和小麦中的ADP2葡萄糖合成酶则属于中间代谢合成酶9,10。在沙门氏菌属中编码脂多糖O2链的rf b基因簇附近,功能未知的第四NDP2己糖合成酶是由编码胞外肠道多糖cps2相关基因簇中的rf b2ORF218基因编码的10。目前已有证据表明放线菌只利用dTDP2葡萄糖途径合成6DOH6。在62DOH合成和其它糖修饰过程中,一组结构功能相关的酶都属于UDP2葡萄糖42异构酶(GalE)酶家族11,它包括NDP2葡萄糖4,62脱水酶(StrE、LmbM、Rfb、RfbG和RffE)、dTDP双氢链霉糖合成酶(StrL)、dTDP2L2鼠李糖合成酶(RfbD)、CDP2阿可比糖合成酶(RfbJ)、CDP2泊雷糖合成酶(RfbS)、CDP2泰威糖22差向异构酶(RfbE)以及迄今功能未知的酶。StrP可能参与了链霉素生物合成途径中12形成NDP2(N2甲基)2L2葡萄糖胺中间物的氧化还原反应,其功能可能是催化42差向异构化。氨基转移酶2脱水酶家族也是一个功能多样性的酶家族,它包括StrS、StsA、StsC、LmbS和RfbH蛋白,这个酶家族在肽链的主要结构上是同源的,并在典型的次级代谢途径中广泛存在。最初认为这些基因产物是多效的调节物(如基因簇或其亚组表达的活化物),近来的研究结果有力地证明了这个蛋白家族的成员是次级代谢途径中的生物合成酶13,因为:(1)这个酶家族的成员之一A scC酶与RfbH非常相似(蛋白质顺序85%相似),前者的功能是将吡哆胺磷酸转移到CDP242酮262脱氧葡萄糖分子上14;(2)StrS类的蛋白质并非调节物,而是与 天 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶 相 似12;(3)A mycolatopsis m ed iterranei中纯化的AHBA S(42氨基52羟基酪酸盐合成酶)表现出吡哆醛的紫外光谱。氨基转移酶亚组的成员在蛋白质序列中保留了一个赖氨酸残基,这在其它氨基转移酶中也存在,而脱水酶亚组(A scC和RfbH)在这个位置上为组氨酸残基。此酶家族其它成员不含A csC和RfbH蛋白所具有的七个保守的半胱氨酸残基,其中四个存在于A scC和RfbH的插入肽链上,这两种蛋白质与纯化的14 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/氨基转移酶亚组有关。这个结果与含有四个半胱氨酸结合型铁2硫束14的A csC的蛋白质的性质一致。显然,ABHA S属于氨基转移酶亚组,因为它含有保守的赖氨酸残基而缺少丰富的半胱氨酸残基,但它的反应机制与氨基酸转移酶亚组不尽相同,而与脱水酶亚组的一些关键序列相似。此酶家族在代谢工程的设计中非常有用,因为它在底物识别(也可能是辅助底物的识别)上显示出结构域的多样性。例如,链霉胍合成途径中的氨基供体分别是谷氨酸和丙氨酸15,由于反应是由氨基转移酶催化的,所以属于次级代谢反应,并且是生产阶段氮调节的关键目标。氮的调节在大多数次级发酵过程中为几个关键控制因素之一,而且是一个难以解决的问题。值得注意的是在灰色链霉菌的发酵生产阶段,StrS只有在一种自动调节因子(即A因子)的存在下才能高效表达16。存在于根瘤菌中的根菌素合成酶M osB与链酶胍途径中的第一个氨基转移酶催化类似的反应,然而M osB与灰色链霉菌str基因簇中的三种氨基转移酶StrS、StsA和StsC没有相似之处,因此只能使用另一种氨基供体作为辅助底物17。从遗传学的角度看,放线菌的次级代谢也有一些规律,例如以经典模式使用遗传物质,从而以最小的基因和酶的保留获得最大的改变;实验室的许多菌株经常发生大规模的缺失或扩增作用引起遗传不稳定性18;链霉菌的基因组分为必需和非必需两部分;DNA中的高G+C含量使基因的组成对某个密码子产生偏爱性19。另外,在所有迄今研究过的放线菌中,人们发现次级代谢产物的生物合成基因都存在于大的基因簇中,包括表达抗性、调控物、运输和细胞外加工功能的基因20。但一些次级代谢使用的专一性辅酶是由单独基因簇来表达的,如四环素和林可霉素生物合成中的“辅合成因子”。放线菌次级代谢的调控位点包括启动子、转录终止子、核糖体结合位点以及另一些特殊机制,如在次级代谢和细胞分化调控的自调节以及翻译调控中的稀有密码子TTA的使用等1。放线菌次级代谢的调控元件是典型的细菌型的,其基因的演变可能在细胞生命和分化的早期已有基础21。3策略及举例就目前所掌握的有关放线菌分子生物学的知识而言,合成低分子量次级代谢物的典型途径对于整个代谢工程设计仍是非常不充分的,因为这种设计非常复杂,要求产生全新的分子结构。目前有六种对放线菌次级代谢进行遗传改造的策略,它们分别是1:311在一个现存途径中提高代谢物质的流量在次级代谢途径中提高底物流量可用以下几种方法:31111通过增加基因拷贝数或使用更强的启动子有效地强化限速步骤酶的表达。这种方法已在真菌的 2内酰胺途径中获得成功22。在头孢菌属的工业菌株中增加基因cef EF的拷贝,以提高催化青霉素N转化为去乙酰基头孢菌素的双功能酶去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(该酶由链霉素的基因编码)的浓度,可以使头孢菌素C(CPC)的产量提高15%以上。这种方法并没有提高代谢路径中总的通量,而是增加基因的拷贝数使中间产物的转化率提高,从而导致终产物产量的增加。31112通过对负控制因素的抑制或激活因子的高效表达对代谢途径进行调控。在放线菌次级代谢中提高通量速度更优化的方法是操纵调控基因,例如:(1)dnrI基因在产多诺红菌素的波赛链霉菌中过量表达时,其产物作为抗生素生物合成基因转录的激活因子而发挥作用13。(2)天蓝色链霉菌A 3(2)和变铅青链霉菌66中的一个多效基因调节点abaA不仅大大增加了放线菌紫素的产量,而且影响到其它代谢途径23。(3)在链霉素生物合成途径中,与DNA结合的激活因子StrR大大增加了链霉胍支路中的StrB酶(脒基转移酶?)的表达24。淡青链霉菌中也存在此调节位点。现已证实,StrR是str基因簇中若干基因的DNA结合蛋白18。24 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/31113通过基因突变产生一个对反馈抑制不敏感的酶,以减轻反馈抑制。这一种方法可能与提高抗生素的产量关系不大,因为很少有证据表明在这些途径中存在反馈抑制作用,原因可能是细胞具有很强的抗生素分泌机制来维持细胞内的低浓度,因而无法进行有效的反馈抑制。最后,其它与通量速度没有内在关系的因子也对产物的过量生产有很大影响,其中前体库,能荷,物化总平衡,抗药性机制和最终产物的输出是这些因素中最重要的一部分。例如,基质中的脂肪酸和分枝点氨基酸能大大提高某些聚乙酰化物的产量,尤其是由?类聚乙酰合成酶催化的产物25。膜结合输出蛋白的过量表达也可以提高产量。312鸟枪法构建产生杂合终产物的杂合途径相似途径的鸟枪法改造的经典例子是将从天蓝色链霉菌A 3(2)中克隆的放线菌紫素基因(act)导入到其它的异氧杂萘满醌产生菌中,结果产生了杂合抗生素26。它们和其它细菌合成的物质在结构上的差别很小,仅在双氢榴菌素环状化物上有立体化学变化,或在美达紫红素的结构上增加了一个羟基。近期,更多复杂实验的目标是组合芳香族多聚链的生物合成基因,或克隆产蒽环霉素的天蓝色链霉菌及突变菌中放线菌紫素基因的不同亚组27。使之合成新的蒽醌终产物芦荟皂草苷 和脱氧虫胶红素。通过验证放线菌中生物合成次级代谢产物的酶基因重组的例子,可得出以下结论:(1)转化单一基因或基因簇的方法对于寻找杂合产物同样适用;(2)至少一部分抗生素合成基因编码的酶对底物专一性要求不高,能作用于起始底物的相似中间物生成杂合分子;(3)鸟枪法的最大价值在于它提供了更先进的途径设计方法,也为以后利用生物合成酶进行更高级的设计提供必要的生化背景知识。313交换修饰酶的新产物合成途径转化修饰螺旋霉素L2碳霉糖的乙酰转移酶单一基因是放线菌次级代谢物生产途径设计的经典实验28。L2碳霉糖的修饰是另一个大环内酯抗生素产生菌中自然发生的反应。为此,在产碳霉素的耐温链霉菌中获得编码异戊巯基转移酶的基因carE首先是在抗药性基因carB附近克隆碳霉素基因,然后将之次级克隆在螺旋霉素产生菌生二素链霉菌中。该菌株以4 2异戊巯基2螺旋霉素的形式合成几乎100%的大环内酯类抗生素。变铅青链霉菌66中通过表达carE基因以及给重组菌添加螺旋霉素而建立的生物转化系统,也能产生相同的化合物。其它单一步骤修饰酶主要是转移酶(如甲基转移酶)和氧化还原酶(如脱氢酶),它们是此战略中理想的工具。这些酶催化不依赖于专一性的辅底物,使用从中间代谢物中普遍获得的辅酶或前体库,而不是所谓的“辅合成因子”(如四环素、林可霉素生物合成中的辅底物)29。由于其它抗生素如阿沙霉素、尼菲霉素,一碳霉素B等中含有胍基或氨甲基侧链,因而可以通过测定产链霉素2布鲁霉素型氨基糖苷的菌株中脒基转移酶和氨基甲酰基转移酶的活性16,从而确定其它次级代谢产物中各种主要氨基和羟基的底物专一性范围。314融合不同前体库代谢途径的新合成途径。不同前体库分支路径组合的例子是在体内重组卡那霉素前体,以合成卡那霉素相关的氨基糖苷,此法由Davies和Yagisawa 1983年首先提出,目前的进展已经半合成了卡那霉素,并用于临床治疗。形成或转运(S)2(2)2N12 2羟基2 2氨基丁酰残基的酶与生物合成肽类抗生素的肽合成酶有关,一些相关基因也已从环状芽孢杆菌中克隆并鉴定。利 用6DOH生 物 合 成 途 径 以 及 合 成6DOH2衍生残基反应中的糖基转移酶可以设计类似的不同组合途径。此法具有吸引力的原因有三6:(1)在放线菌的生物活性化合物中,6DOH修饰己糖是按侧链基团分类的;(2)所有的己糖都是经相同的初始途径合成的,由此只需要改造较少的反应步骤就能达34 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/到终产物结构上的改变;(3)许多研究表明,终产物的生物活性如抗药性、药理性或毒理性主要是由糖基决定的。细菌中有两种以核苷酸活化糖为底物的糖基转移酶,一种与膜结合,参与胞质外多糖的寡聚或多聚反应,另一种为占胞浆小部分的可溶性蛋白,它参与细胞内的糖基化反应。迄今为止,由糖苷配基的不同化学基团生成杂合衍生物的糖基化反应,其可行性依赖于催化转移反应的糖基转移酶对特定的62DOH衍生物所具有的底物专一性范围。由于不易在体内检测,因此有必要利用一系列的糖基转移酶和互补的具有核苷酸活性的糖苷衍生物进行体外实验。315利用蛋白质工程产生多功能蛋白。通过对酶的蛋白质结构进行改造可以实现 2内酰胺途径的异化。目前,作为半合成头孢菌素的前体物质72氨基乙酰氧基头孢烷酸(72ADCA)是通过扩环作用生成的(即青霉素V的苯氧乙酰基团发生去酰化反应)。为采用纯生物细胞(或酶)过程生产头孢菌素V,最好的方法是使放线菌的cef E基因产物(青霉素N扩环酶)能以青霉素V作为扩环的底物,然而目前还没有酶能以青霉素V为底物,由此我们有必要扩展关于酶对底物的识别位点方面的知识,以便借助于代谢工程思路设计底物专一性更广的酶来修饰底物。同时可用这种方法通过对青霉素转酰基酶进行修饰,使头孢菌素或头霉素成为底物。蛋白质工程是在一个或一些多功能蛋白质链上进行不同的低聚化反应,尽管其操作复杂性较高,但肽合成酶和?类聚乙酰合成酶的改造很有吸引力。这两种酶都是在蛋白分子内以一定顺序排列而成的一个或多个合成单位的复合物,它们通过硫酯活化前体和中间物起作用,因而参照脂肪酸合成酶的结构与功能数据对其改造可能有意义。蛋白质改造最简单的方法就是缺失一些修饰步骤以产生新的终产物,用这类改造方法可以合成出更复杂的聚乙酰化物及其衍生物。例如抗真菌和驱虫的阿凡曼菌素是在六个大?型聚乙酰合成酶(PKS2?)蛋白组成的EryA聚乙酰合成酶(EryA PKS)催化下形成的,由65kb的DNA片段编码,经酶分子改造后的?型PKS产物模式的改变使得产生不同顺序的延伸单元成为可能5。代谢工程策略的先决条件是明确生物合成酶的活性位点、结构特点及具有催化和底物识别功能的结构域特征,这对于多步反应的单一步骤催化酶而言特别复杂耗时,其中值得注意的是:(1)修饰链霉素和其它氨基糖苷抗生素的磷酸转移酶与真核生物的蛋白激酶结构有关21;(2)这个庞大蛋白家族成员的底物识别区域似乎位于多肽链的C末端;(3)用杂合的磷酸转移酶可将底物识别区域转至其它蛋白链上12;316设计特定终产物的全新生物合成途径提出次级代谢全新的途径设计目前仍为时尚早,然而在十到二十年之内,随着次级代谢分子生物学研究的不断积累,以上五种方法将变得可行,届时人们可能会象在大肠杆菌中表达人胰岛素那样设计出能合成任何生物活性次级代谢途径。参考文献 1 WolfgangPiersberg.CriticalReview sinBiotechnology.,1994;14:251-285 2 U rsula Peschke et al.MolecularM icrobiology.,1995;16:1137-1156 3 Ikeda,M.and Katsumata,R.Appl.Env.M icrobiol.1992;58:781-785 4 Lawford,H.G.and 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their metabolic pathways in a clear direction.In contrast to successfulexamplesofdesignedbiochem icalimprovementofprimarymetabolicprocessesinm icroorganism s,noreoftheproducts orstrainsderivedfrompathwayengineeringinactinomycetes have reached pilot or production scale.The main reasons for this slow progress arethe complicated pathways them selves,their complex regulation during the actinomycete cell cycle,and their uniqueness.Now,people make stress on transform ing enzymes in order to redesign thepassway which use their intermediates as building blocks,and to gain modified or new naturalproducts at last.Several strategies that can be followed to reach this aim are discussed,mainly forthe various 62deoxyhexose metabolism as an applicable example.Key wordsA ctinomycete,Secondary metabolism,A ntibiotics,Passway engineering,(62deoxy hexose)metabolism,Polyketides,Peptides54