PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达_王俊杰.pdf

第 27 卷第 5 期2008年 9月 食 品 与 生 物 技 术 学 报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.27 No.5Sep.2008 文章编号:1673-1689(2008)05-0027-06 收稿日期:2007-07-25.基金项目:国家自然科学基金项目(30570142,20676053);国家 863 计划项目(2006AA020103);江苏省青年科技创新人才基金项目(BK2006504);长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0532).作者简介:王俊杰(1983-),男,湖北武汉人,微生物学硕士研究生.*通讯作者:饶志明(1975-),男,江西临川人,农学博士,教授,硕士生导师.主要从事工业微生物育种及分子生物学改造方面的研究.Email:raozm PScgpd1 启动子融合 GUS 基因在酿酒酵母中的瞬时表达王俊杰1,2,饶志明*1,2,沈 微1,2,方慧英1,2,诸葛健1,2(1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122;2.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡 214122)摘 要:利用 PCR 技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因 gp d1 启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体 pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 基因工程菌分别在 012,015,110 mol/L NaCl 的盐胁迫下培养,首次通过 GUS 组织化学染色法和荧光法测定 GUS 报告基因的瞬时表达酶活检测 gpd1 启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因 gp d1 启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了 gpd1 启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。关键词:甘油代谢;gp d1 启动子;B-葡糖苷酸酶中图分类号:Q 939.97文献标识码:AAnalysis of Promoter gpd1 of the Key Gene of Glycerol Metabolicin Saccharomyces cerevisia at Different Osmotic StressWANG Jun-jie1,2,RAO Zh-i ming*1,2,SHEN Wei1,2,FANG Hu-i ying1,2,ZHUGE Jian1,2(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,M inistry of Education,Jiangnan U niversity,Wuxi214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:A shuttle vector pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS had been constructed and transformedinto Saccharomyces cerevisiae by electroporation.T he transformants was cultured in mediumwith 0 12,0 15 and 110 mol/L NaCl supplement,respectively.T he enzyme activity of promotergpd1 was determined by transient histochemical analysis of GUS gene at different osmoticpressure.T he result showed that the expression of promoter gpd1 in S.cerevisiae at differentosmotic pressure were prominently different.It was concluded that the promoter gpd1 was aninducible promoter,regulated by osmotic pressure.Key words:glycerol metabolic;promoter gp d1;GUS 甘油(glycerol)是甘油三酸酯分子的骨架成分;它具有相对分子量小、容易溶解,在生理 pH 值范围内不带净电荷,能被细胞膜保持住,对生物细胞无任何毒副作用等特点,因此被认为是一种极其理想的耐高渗透压介质。在真核生物中,存在于胞浆中的 3-磷酸甘油脱氢酶,以 NAD+为辅酶,催化磷酸二羟丙酮生成 3-磷酸甘油,然后 3-磷酸甘油磷酸酶催化 3-磷酸甘油生成甘油。当环境渗透压升高时,酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡 1,但是其分子内部作用机理尚未研究清楚。经研究发现 2-4,3-磷酸甘油脱 氢酶(GPDH)至少有两个同工酶,分别为 gp d1、gpd2,且生物体内甘油合成代谢中以 gp d1 为主;GPDH作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平 5。赵有玺等 6克隆到产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因 gpd1,并将其在酿酒酵母中表达,发现甘油合成量有显著的提高;陈献忠等 7从一株产甘油假丝酵母的工业菌种中成功克隆到 GPDH 的编码基因 Cg gpd 的上下游序列,在一定的盐胁迫下将该基因在其它的酵母中异源表达,发现携带 Cg gpd 基因的转基因酵母比野生型的酵母有明显的耐渗透压胁迫的能力。但是,甘油含量的提高与 GPD 基因内部的之间的作用机理也未研究透彻,且 gpd1 基因的启动子与甘油含量的积累之间的研究未见报道。利用基因融合来研究现代分子生物学的问题,如基因表达、调控等是非常有效的,GUS(B-葡糖苷酸酶)基因是从大肠杆菌中克隆的,作为基因融合系统中的报告基因广泛应用于细菌、植物、甚至动物的基因调控、表达等分子遗传学的研究中 8。作者从酿酒酵母 S1cerevisiae 中克隆 gpd1 的启动子,并构建真核生物穿梭表达载体 pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转化入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母 S1cerevisiae 基因工程菌分别在不同 NaCl 浓度的盐胁迫下培养,通过 GUS 组织化学染色法和荧光法测定 GUS 报告基因的瞬时表达酶活检测 gpd1 启动子的功能,作者研究酵母甘油代谢关键酶基因 gp d1 启动子在不同渗透压下的表达水平。1 材料与方法1 11 材 料1 11 1 1 菌株及质粒 酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae 303-1A,E1coli JM109 及质粒 pYX212-zeocin,p3300-zeocin 由作者所在实验室保藏。1 1112 工具酶和试剂 限制性内切酶 Hind III、BamHI、BglII、Sal I,T4 DNA 连接酶,TaqDNA 聚合酶等购自 T aKaRa 公司;质粒提取试剂盒,小型DNA 片断回收试剂盒购自博大泰克公司;氨苄西林,卡那霉素,Zeocin 等抗生素购自上海生物工程有限公司;GUS 基因的底物 X-gluc,4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷(4-methylumbellifery-l b-D-glucu-ronide,MUG),4-甲基伞形酮(4-methylumbellifer-one,MU)均购自上海生物工程有限公司。1 1113 PCR 引物 根据酿酒酵母 S1cerevisiae303-1A 基因组和质粒 pBI121 公布的序列,分别设计基因片段 PScgpd 和 GUS 合成 PCR 所需引物(上海赛百盛基因技术有限公司合成):P1:5c-GGAAGATCT GCACGAAATAT AT-GT AGGCAA-3 c;P1:5 c-CGCGGATT CCCAAT ATT T GT GT T-TGT GGAGG-3c;P3:5 c-GGCGGAT T CAACGGATGATATA-CTGACGT AC-3c;P4:5 c-CGGAAGCTT CCAAT AT ATT AAA-GCGCAGTT A-3c引物 1,2,3,4 分别在引物上游引入 Bgl,BamHI,BamHI,H indIII 酶切位点(下划线部分)。1 12 方 法1 1211 菌体的培养 将含有重组质粒 pYX212-zeocin E1coli JM109,在含有 50 mg/L kana LB 固体或液体培养基中,250 r/min、37 e 培养过夜。含重组质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 的酿酒酵母 S1cerevisiae 基因工程菌在含150 mg/mL zeocin的 YPD 固体或液体培养基中于 250 r/min、30 e 培养过夜。1 1212 染色体 DNA 制备 参照文献 9 进行。1 1213 PCR 反应体系及反应条件 反应体系:10 buffer 5 LL,215 mmol/L dNTP 4 LL,MgCl24LL,两条引物各 1 LL,模板 DNA 2 LL,T aq 酶 1LL,ddH2O 33 LL,总体积 50 LL。PScgpd1 PCR反应条件:94 e 预变性 5 min,变性 60 s,55 e 退火 90 s,72 e 延伸 120 s,30 次循环后,72 e 保温10 e。GUS 基因 PCR 反应条件:94 e 预变性 5min,变性 60 s,52 e 退火 90 s,72 e 延伸 120 s,35 次循环后,72 e 保温 10 e。另外,PCR 产物胶回收,Pscgpd1 和 GUS 与pMD-18T Easyvector 连接、转化及质粒提取均参照试剂盒说明书。28食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 27 卷 1 12 1 4 酿酒酵母 S1 cerevisiae 基因工程菌的构建1)酿酒酵母 S1cerevisiae 表达载体的构建:首先将 PCR 来源于酿酒酵母染色体和载体 pBI121 的目的基因 PScgpd1 和 GUS 分别连入载体 PMD-18T,得到重组 质粒 PMD-18T-PScgp d1,PMD-18T-GUS。然 后 分 别 用 Bgl,BamHI 及BamHI,H indIII 双 酶 切 重 组 质 粒 PMD-18T-PScgpd1,PMD-18T-GUS,分别得到 1 11 kb 和 2 11kb 的目的基因 PScgp d1 及 GUS,并将其依次连入表达 载 体 pYX212-zoecin,得到 重 组 表 达 载 体pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,见图 1。随后将连接产物转化 E1coli JM109。挑取转化子,提取重组质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 经 PCR 和酶切验证,见图 2。图 1 质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 的构建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 2)重组质粒电击转化酿酒酵母 加 5 LL 的酵母表达载体 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 质粒于酿酒酵母感受态菌液中预冷 5 10 min,混合并转移至无菌预冷的电击杯中(电击间距为 0 11 cm)。迅速吸干电击杯表面的水,将电击杯放入点转仪的电击之间,在1 800 V 的电压下电击 5 ms,取出电击29 第 5 期王俊杰等:PScgpd1 启动子融合 GUS 基因在酿酒酵母中的瞬时表达杯,迅速加入 1 mL LB 液体培养基混匀,并转移至1 15 mL 的离心管中。在 28 e 下振荡孵育培养 3h,离心 1 min,取下层悬浮菌液涂布于含相应质量浓度 zoecin 的选择培养基上,28 e 培养 2 3 d。将得到的重组转化子提取重组质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,并进行酶切验证 10。1 12 1 5 SDS-PAGE 采用 5 g/dL 浓缩胶及 12 g/dL 分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白质分离,考马斯亮蓝 G-250 染色,以酿酒酵母 S1cerevisiaeW30321A 作为对照 11。1 12 1 6 GUS 的瞬时表达 1)GUS 的 组 织 化 学 染 色:提 取 含 质 粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS酿酒酵母S1cerevisiae 基因工程菌的转化子接种于 YPD 培养基中,培养 8 h 后,以非基因工程菌作为对照,于30 e 培养 18 24 h。取培养好的转基因酵母培养液 10 mL,离心收集细胞,置于 20 mL 固定液 V(95%的乙醇)BV(冰醋酸)=3B1,室温下固定酵母细胞 30 min,离心收集细胞,然后将细胞浸泡于染色液(50 mmol/L PBS 缓冲液,5 mmol/L 铁氰化钾,5 mmol/L 亚铁氰化钾,0 13 g/dL X-葡萄糖醛酸苷酸和 0 1 5 g/dL T ritonX-100)中,37 e 下保温过夜,显微镜下观察。2)GUS 的荧光法测定:提取含质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 酿酒酵母 S1 cerevisiae 基因工程菌的转化子,培养 8 h 后,分别接种在添加有0 12,0 15,1 10 mol/L NaCl 的 YPD 培养基中,分别以非基因工程菌和不加 NaCl 胁迫培养的基因工程菌作为对照,于 30 e 培养 18 24 h。取培养好的转基因酵母培养液 10 mL,离心收集细胞,置于 20mL GUS 提取溶液(50 mmol/L Na3PO4,pH 710,10 mmol/L Na2EDTA,0 11 g/dL T riton X-100,10mmol/L B-巯基乙醇,0 11 g/dL 十二烷基肌酸纳)中,与400 W 超声波破碎 20 min,用 115 mL 的 Ep-pendorf 离心管在小型离心机上离心破碎 5 min;分别将 100 LL 上清液转移到 2 个试管中,一个标记为0,一个为 60;向标记为 0 的试管中加入 900 LL 的终止液;将 2 个试管放到冰浴上,加入 100 LL 的检测溶液(提取液中含有 1 mmol/L 的 4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷,MUG);轻轻摇动试管将溶液混匀,将标有 60的试管放在 37 e 水浴中 1 h;60 min后,向标有 60 的试管中加入 900 LL 的终止液(012mmol/L Na2CO3);在激发光 365 nm、发射光 455nm 下测各样品的荧光,以反应终止液为空白溶液,用荧光仪测定甲基伞酮(MU)的浓度。以单位时间内单位蛋白质产生 4-methlumbelliferone(MU)的量比较各启动子对 GUS 基因表达的影响,每个梯度做 3个平行对照,取各梯度的平均值进行比较。2 结果与分析2 11 T-GPD 和 T-GPP 的构建通过 PCR 成功扩增了 PScgpd1 与 GUS 基因,将 PScgpd1 与 GUS 基因分别与 pMD-18T Easyvector 连接,转化 E1coli JM109。挑取白色转化子,过夜培养,提取质粒。然后用 EcoR I 酶切验证质粒,酶切有 217 kb 和 1 1 1 kb 左右条带的为 T-PScgpd1 阳性克隆,酶切有 217 kb 和 211 kb 左右条带的为 T-GUS 阳性克隆,见图 2。M1.K DNA/H ind markers;1.Double digestion of pMD-18T-PScgpd1 by Bgl and BamHI;2.Double digestion ofpMD-18T-GU S by BamHI and H indIII图 2 pMD-18T-PScgpd1,pMD-18T-GUS酶切验证Fig.2 Restriction map of pMD-18T-PScgpd1 and pMD-18T-GUS2 12 酿酒酵母 S 1cerevisiae 表达载体的构建挑取转化子,提取重组质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,经 PCR 分别得到 PScgpd1-GUS 基因片段约 111 kb 和 GUS 基因片段约 2 11 kb;同时用 Sac I 和 H indIII 双酶切,得到质粒的两个片段分别为 1016 kb 和 312 kb,这与连接前的基因片段大小是一致的,见图 3。2 13 酿酒酵母 S 1cerevisiae 基因工程菌的获得将重组构建得到的酿酒酵母 S1cerevisiae 基因工程菌表达载体 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 电击转化酿酒酵母,将电击后的悬浮菌液涂布于含150 mg/mL zoecin 的 YPD 固体选择培养基上,30e 静置培养 2 3 d。挑取转化子,接种于 150 mg/mL zoecin 的 YPD 液体选择培养基中,在 250 r/min 30 e 下培养 18 20 h,提取重组质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,用 Sac I 和 H indIII 双酶切质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,得到两个片段分别为 1016 kb 和 3 12 kb,与预期结果一致,说明30食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 27 卷 酿酒酵母 S1cerevisiae 基因工程菌已经构建成功,见图 4。M1.K DNA/H ind markers;1.Production PScgp d1 of PCRfrom plasmid of pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS;2.ProductionGUS of PCR from plasmid of pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS;3.pYX212-zeocin-PScgp d1-GUS/EcoR;4.Double diges-tion of pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS by Sac I and H ind III;M2.DL2000 markers.图 3 质粒 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 的 PCR 及酶切验证Fig.3 Analysis of plasmid of pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS by PCR and digestionM1.K DNA/H ind markers;1.pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS/EcoR;2.Double digestion of pYX212-zeocin-PScg-pd1-GUS by SacI and H ind III;M2.DL2000 markers图 4 酿酒酵母 S 1 cerevisiae 基因工程菌的验证Fig.4 Confirmation of S 1 cerevisiae transformants2 14 重组菌全细胞蛋白 SDS-PAGE电泳分析将重 组 酿 酒 酵 母 S1cerevisiae W303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 离心收集菌体,超声波破壁,进行 SDS-PAGE 全细胞蛋白质电泳分析,见图 5。以酿酒酵母 S1 cerevisiae W303-1A 为对照,发现重组酵母在64 000处出现蛋白质特征带,与文献报道的目的蛋白质大小相符。2 15 渗透胁迫对 GPD1 启动子表达的影响从图 6 可见,经过 GUS 基因的组织化学染色后,非基因工程菌完全没有蓝色沉淀,即无 GUS 表达(图 6a);同时,转入了质粒 pYX212-zeocin-PScg-pd1-GUS 的转基因酿酒酵母 S1 cerevisiae,染色后在酵母细胞内出现蓝色沉淀(图 6b),即在酿酒酵母中 PScgpd1 启动子成功的启动了 GUS 基因的表达。1.S.cerevisiae W30321/pYX212-zeocin-PScgpd1-GU S;2.S.cerevisiae W30321A(control);M.Protein markers(kDa)图 5 重组菌全细胞蛋白 SDS2PAGE 电泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cellsa.酿酒酵母 S 1 cerevisiae;b.酿酒酵母 S 1 cerevisiae 基因工程菌图 6 不同渗透压下 GUS基因的瞬时瞬时组织化学染色Fig.6 Transient histochemical analysis of GUS gene un-der different osmotic pressure 由于表达载体 pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS中,GUS 融合蛋白基因的表达由 gp d1 启动子驱动GUS 报告基因的表达,因此通过 GUS 基因的瞬时组织化学染色法分析 GUS 报告基因的表达水平,可以间接反应出 gp d1 启动子的表达水平的情况。从图 7 可见,当无渗透压胁迫,即在没有 NaCl 盐胁迫处理的情况下,转基因酵母内的 GUS 活性不及经盐胁迫处理后的高,且在一定胁迫范围内 GUS的活性随着胁迫力度的加大而上升,0 18 mol/LNaCl 盐胁迫时达到最高。但是由于酿酒酵母的抗渗透压胁迫能力有限,因此 NaCl 胁迫处理力度的进一步加大使细胞开始死亡,并且不启动 GUS 基因。综上所述,可以充分说明,在盐胁迫处理条件下,酵母菌内的 PScgpd1启动子的表达明显强于未经胁迫处理的酵母菌,且 PScgpd1 启动子是受盐胁迫调控的诱导型启动子。31 第 5 期王俊杰等:PScgpd1 启动子融合 GUS 基因在酿酒酵母中的瞬时表达图 7 不同 NaCl 浓度胁迫下 GUS表达活性Fig.7 GUS activity under different NaCl osmotic stress3 结 语PScgpd1 启动子为酵母内甘油代谢主要关键限速酶 gp d1 的启动子,决定着该酶基因的表达,而甘油又是良好的耐渗透压调节剂,过量的合成甘油可以提高生物体对外界环境的耐受能力。作者利用PCR 方法成功克隆到酿酒酵母 S1cerevisiae W303-1A 甘油代谢关键酶基因 gpd1 启动子,构建了真核生物穿梭表达载体 pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并通过电击转化的方法将其电击转化入酿酒酵母S1 cerevisiaeW303-1A中 得 到 酿 酒 酵 母S1 cerevisiaeW303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 基 因 工 程 菌。将 构 建 成 功 的 酿 酒 酵 母S1 cerevisiaeW303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS 基因工程 菌分别在 0 12,015,110 mol/LNaCl 的盐胁迫下培养,通过 GUS 组织化学染色法测定 GUS 报告基因的瞬时表达酶活来检测 gpd1启动子的表达情况。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因 gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异,且随着盐胁迫力度的加大,gpd1 表达量也相应增加,证实了 gp d1 启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子。参考文献(References):1 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