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临床研究 神经生长因子滴眼液对LASIK术后角膜瓣神经修复的影响朱丹丹 陈 辉Effect of NGF eyedrop on human central corneal nerve regeneration afterlaser in situ keratom ileusisZhu Dandan,Chen Hui.Departm ent of Ophthalm ology,Affiliated Hospital,N antong University,Nantong 226001,ChinaAbstractObjectiveMany studies showed a good effectiveness of nerve growth factor(NGF)on the recovery of cornealsensitivity following the laser in situ keratomileusis(LASIK).However,no study report verified the regeneration of corneal nervefiber in the morphology.This study was to determine if topically administration of NGF plays a role in accelerating thereinnervation of central corneal flap nerve after LASIK.M ethodsA prospective double2masked randomized study wasdesigned.The LASIKwas perfor med in 70 eyes from 30 patients aged 18-40 yearswith the equivalent lens-3100-6100D.NGF was topically utilized in 36 eyes afterLASIK as trail group,and an equal amount of balanced saline solution was used in theother 34 eyes from age and gender2matched patients at the same way in control group.The corneal sensation,tear film break2uptime,tear contentwere examined in 10 days,1,3 and 6 months after LASIK,and corneal nerve fiber density was counted withconfocal scanning laser ophthal moscopy(Heidelberg Retina TomographRostock Cornea Module Rostock System).The HumanResearch Ethics Committee of this hospital approved the study protocol.ResultsAll the patients completed the treating andfollowing2up procedure according to the trialprotocol and were included to the intention2to2treat analysis.No significant differencewas found in the comparison of general data and clinical characteristics bet ween t wo groups(P0105).The corneal sensationwaslower in the 10th day after LASIK than before LASIK and gradually recovered after that time in both groups.The BUT aftersurgerywas significantly shorter than before LASIK(P0105)。术后3个月内角膜神经密度2组间差异无统计学意义(P0105),术后6个月NGF组神经密度高于对照组,2组间差异有统计学意义(P0105)。结论 NGF滴眼液对LA ISK术后角膜神经修复有促进作用。关键词 准分子激光原位角膜磨镶术;神经再生;神经生长因子分类号 R 779163 文献标识码A 文章编号100320808(2009)0520420205 作者单位:226001南通大学附属医院眼科(朱丹丹,硕士研究生,现在南京市鼓楼医院宁益眼科中心 210008)通讯作者:陈辉(Email:chenhuieye1261com)准分 子 激 光 原 位 角 膜 磨 镶 术(laser in situkeratomileusis,LASIK)术后部分患者有异物感等不适。研究发现这些症状体征的出现与术中在切开角膜瓣、024Chin Ophthal Res,May 2009,Vol.27,No.5切削角膜基质的同时,不同程度地损伤了角膜神经有关1-4。如何促进LASIK术后角膜神经的修复是改善术后干眼等症状的关键。神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)是一种重要的神经细胞生长调节因子,兼有神经元营养和促进突起生长的双重效应5。应用NGF是否能促进LASIK术后人眼角膜神经再生尚未见报道。我们于2006年79月对于我院行LASIK的患者采用随机双盲前瞻对照性研究,现将NGF的应用及术后6个月的随访结果报道如下。1 资料与方法1.1 研究对象收集2006年79月于我院行LASIK治疗近视及近视散光的患者共35例(70眼),为一组连续性资料。纳入标准:年龄1840岁;屈光度为-3100-6100D;角膜接触镜停戴 2周;角膜厚度应 615 mm治疗区;无圆锥角膜;无其他明显眼部疾患;未用过影响泪液分泌及泪膜稳定性的药物(抗青光眼药物,糖皮质激素药物等);女性不在妊娠期或哺乳期。排除标准:干眼症患者。所有患者征得知情同意并经医院伦理委员会批准。1.2 检查方法1.2.1检查项目 包括角膜知觉、干眼相关检查 Schir mer试验、泪膜破裂时间(tear film break2uptime,BUT)、中央角膜神经密度检查。1.2.2 角膜知觉检查 应用法国产Cochet Bonnet角膜知觉计测定角膜中央知觉。CohetBonnet角膜知觉计的尼龙纤维直径为0112 mm,长度060 mm可调节,对角膜的压强为11200 mg/01011 3 mm2,从60 mm起每递减5 mm,用每一纤维长度测定角膜压力3次,3次中有2次出现眨眼动作即为阳性,有阳性反应的最大纤维长度即为角膜知觉的阈值。1.2.3 中央角膜神经密度检查 检查前盐酸丙美卡因(美国Alcon公司)滴眼液点眼1次,唯地息凝胶(美国博士伦公司)涂眼1次,用海德堡视网膜断层扫描系统 代共焦激光角膜模块系统(Heidelberg RetinaTomographRostock Cornea Module Rostock)进行检查,选择有效计数面积,定义好的区域被放大显示,点击每根神经完成计数。在上下边界或者左右边界的两行中,只要完整地标记上下其中一行和左右其中一行即可。角膜图像的右上角显示神经计数的结果:当前计数面积内神经个数、所选面积、细胞密度(单位面积细胞数,细胞数/mm2)、当前记数图像所在焦平面位置。所有检查由同一检查者完成。1.2.4 药物配置 注射用NGF(厦门北大之路生物工程有限公司)粉剂,6 000 U/支,平衡盐溶液稀释成100g/mL的透明澄清水溶液,严格无菌操作,过滤法除菌,分别置于一次性5 mL药液瓶中,本实验中NGF滴眼液使用时临时配置,并根据NGF注射剂溶解后12 h仍有有效活性的特性,保证NGF滴眼液配置后8 h内使用,确保了NGF滴眼液的有效活性。1.3 分组及手术方法手术前采用计算机生成随机序列方法将患者分为NGF组18例(36眼)和对照组17例(34眼),由一名不参加研究的工作人员随机分组,分配和研究过程中对参与的研究者和患者施行双盲法。2组患者在行LASIK术后分别接受NGF或平衡盐液(BSS)局部点眼,分配方案记录封存,至所有患者随访6个月结束时由进行分组 的 工 作 人 员进 行 揭 盲。LASIK使 用AllegrettoWave准分子激光系统,Moria M2角膜刀制作角膜瓣,蒂位于上方。根据剩余角膜基质床厚度 250m以及暗光下瞳孔直径选择激光治疗直径,所有患者的治疗区直径均 615 mm(不包括过渡区)。所有患者均参照系统的Nomogram和年龄进行屈光度修正后进行激光切削。1.4 术后用药及随访所有患者均点013%泰利必妥滴眼液1周,每日4次;根据患者术前眼压情况,对非接触眼压测量值在20 mmHg(1 mmHg=01133 kPa)者仅点011%氟甲松龙滴眼液1周,每日4次,15 mmHg者点011%氟甲松龙滴眼液1个月,第1周每日4次,以后每周递减1次。所有患者用药10 d,每日4次。随访满6个月者35例(70眼),随访率为8715%。1.5 统计学方法采用Stata 710统计学软件进行统计学分析。2组患者的临床基线资料比较采用独立样本的t检验,2组患者的性别比较采用四格表资料 2检验。2组LASIK术后不同时期角膜知觉的比较和干眼指标的比较采用两因素方差分析,各时间点的两两比较采用SNK2q检验。2组间术后神经纤维密度的比较采用独立样本的t检验。P0105)(表1)。124眼科研究2009年5月第27卷第5期表12组患者的一般资料和临床特征比较(xs)Table 1Comparison of demography and clinical characteristics(xs)GroupNSE3(xs,D)Spherical3(xs,D)Cylinder3(xs,D)Ablation thickness3(xs,m)Age(xs,years)3Male/female#(n,%)Wearing contact#lens(eyes,%)NGF18-41021138-31841138-0135015077171121762315441707/1110(5516)Control17-41451162-41221166-0147015977160141932416551117/1010(5818)P01490142017901790172018901853:Studentsttest,#:2test2.2 术后角膜知觉的变化在LASIK术后10 d,NGF组与BSS组的角膜中央知 觉均明显低于术前,差异有统计学意义(P0105)。术后3个月、6个月与术前水平比较差异无统计学意义(P 0105)。NGF组与BSS组术后10 d、1、3、6个月比较,差异无统计学意义(P 0105)(表2)。表22组LASIK术后不同时期角膜知觉的变化(xs,mm)Table 2Results of corneal sensation examination afterLASIK in two groups(xs,mm)GroupnBeforeLASIKCorneal sensation measurement in different time afterLASIK10 d1month3months6 monthsNGF365511581653016113190b5313010138541827183541827183Control345516081182817819182b5313010138541629103541629103Fti me=4931164,P=01000,Fgroup=41899,P=01091;bP0105vsrespective before LASIK(Two2wayANOVA,SNK2qtest)2.3LASIK术后干眼指标的变化2.3.1BUT的变化及其比较 LASIK术后10 d、1个月、3个月NGF组与BSS组的BUT均明显低于术前(P0105)(表3)。表32组LASIK术后不同时期干眼指标的变化(xs)Table 3Changes of dry eye test afterLASIK(xs)GroupnBUT in pre2op and different time of post2opPre2LASIK10 d1month3months6monthsSchirmer test in pre2op and different time of post2opPre2LASIK10 d1month3months6monthsNGF369195115731651109b71501157b81651156b9187116020192101802016411121201441116820150101982017311115Control349187116231571112b61921163b81341158b9179115721115101512019410164211021111420187111052111210134BUT:Fti me=5491300,P=01000,Fgroup=51203,P=01085;Schir mer test:Fti me=01936,P=01525,Fgroup=01683,P=01455;bP0105vsrespective pre2LASIK(Two2wayANOVA,SNK2qtest)2.4LASIK术后中央角膜神经的再生术后10 d,35例患者除19眼角膜可见上皮下纵行12支神经纤维外,余角膜未见上皮下神经丛。NGF组与BSS组无明显差异(图1)。术后1个月2组患者角膜中央区上皮下浅基质层均未见神经纤维。NGF组与BSS组差异无统计学意义(图2)。术后3个月角膜瓣内上皮下浅基质层神经纤维有所增加,但未达到术前神经纤维数量的一半,2组中央角膜瓣新生神经纤维密度2组差异无统计学意义(图3)。术后6个月切削区内角膜上皮下浅基质层神经纤维仍未达到术前水平。2组角膜瓣中央区新生神经纤维数量NGF组明显多于对照组,差异有统计学意义(P0105)(表4,图4)。表42组LASIK术后不同时期中央角膜神经密度的变化(xs,根 m2)Table 4Changes of central corneal nerve densityafterLASIK(xs,fibers/m2)GroupnBefore LASIK3months6 monthsNGF361010011263140019961401132Control34918011152187019131651114t013630123751798P017180181301000(Studentsttest)224Chin Ophthal Res,May 2009,Vol.27,No.5图1 共焦显微镜下显示LASIK术后1个月NGF组角膜瓣中央75m处未见再生神经纤维(800)图2 共焦显微镜下观察LASIK术后3个月NGF组角膜瓣中央75m处(观察范围380m380m)可见短的无连接的再生神经纤维,走行迂曲(箭头)(800)图3共焦显微镜下观察LASIK术后6个月NGF组角膜瓣中央75m处,可见再生神经纤维走行迂曲,密度较术后3个月明显增多(箭头)(800)图4LASIK术后6个月BSS组角膜瓣中央75m处可见较多再生神经纤维(箭头)(800)Fig.1No new nerve fiber was seen in the ablated zone(thickness:75m,range:380m380m)in NGF group at 1 month after LASIK under the CMTF(800)Fig.2At 3 months after LASIK,some short,solo,bent regenerated nerve fibers werefound in NGF group under the CMTF(thickness:75m,range:380m380m)(black arrow)(800)Fig.3At 6 months after LASIK,density regenerated nervefibers were much more than at the third month in NGF group under the CMTF(thickness:75m,range:380m380m)(black arrow)(800)Fig.4At 6month after LASIK,less regenerated nerve fibers was seen in control group comparedwith NGF group under the CMTF(thickness:75m,range:380m380m)(800)2.5 药物安全性评价2组患者中均未发现角膜新生血管、结膜充血、上皮细胞剥脱、基质层水肿、内皮减少等不良事件。3 讨论NGF是一种较强的促细胞分裂因子,能促进神经细胞及多种非神经元性细胞的增生和分化。Joo等6 将NGF用于LASIK,结果显示实验组患者的角膜敏感度较对照组恢复好。故推测对LASIK术后神经再生、角膜敏感度的恢复能够发挥积极作用,并在动物实验中得到证实7。You等8 和Lambiase等9 应用原位杂交及RT2PCR等技术发现,角膜上皮细胞、内皮细胞及基质细胞既能合成释放NGF,同时也存在NGF受体TrkA。Nilsson等10 应用PCR及Western印迹技术发现,在活体及离体培养的角膜缘干细胞表面也表达高亲和力的受体TrkA。Kruse等11通过实验发现,NGF能够促进体外细胞培养的兔角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞克隆的有丝分裂,加速其生长与分化。You等8 发现,在无血清培养基中NGF能够促进人角膜基质细胞分化。Lambiase等9 的研究也表明NGF能够防止角膜基质混浊,促进基质愈合,对角膜内皮细胞损伤愈合亦有一定影响。Lambiase等12 运用自制的NGF滴眼液(质量浓度为200g/mL)治疗43例(45眼)患有神经营养性角膜溃疡的患者,使用方法为每2 h点眼1次持续2 d,随后每日点眼6次直至溃疡痊愈,10 d6周内所有病例全部愈合。Joo等6发现眼局部应用NGF(质量浓度为200g/mL)对LASIK术后新西兰白兔早期角膜知觉的恢复有明显促进作用。Lee等13 观察到LASIK术后角膜感觉减退和干眼症的发生与泪液中NGF水平相关,认为NGF是一种良好的促神经修复因子。本研究结果发现LASIK术后6个月内NGF用药组角膜知觉、BUT、泪液分泌量与对照组比较差异均无统计学意义,但在术后6个月时,NGF用药组中央新生神经纤维密度较对照组显著增加。表明NGF在LASIK术后对角膜神经纤维的修复有促进作用。由于人眼角膜为脂质-水-脂质的夹心层,上皮和内皮细胞层脂质含量比基质层约大100倍。这种结构使脂溶性物质容易通过角膜上皮和内皮层,但水溶性制剂则无法通过。水溶性物质容易通透角膜基质层。而本研究所用NGF滴眼液为水溶性制剂,可能会影响药物在角膜上皮层的通透性,从而影响药物疗效。安晓燕等14 研究表明NGF可有效促进培养角膜缘干细胞的生长,培养的适宜质量浓度为10100g/mL,本实验采用的药物质量浓度为100g/mL,结果显示在6个月时对角膜神经修复有促进作用,但在13个月时不明显,是否与质量浓度低有关尚需进一步研究。目前对NGF的研究主要集中在其治疗作用上,而对应用NGF是否会引起不良反应报道较少。毒理学研究方面尚未见NGF有严重不良反应。韦侃侃等15 在兔眼局部应用不同剂量NGF时,利用直接检眼镜、324眼科研究2009年5月第27卷第5期光镜及透射电镜等检查手段证实眼局部应用合适剂量NGF对视网膜无不良反应。正常人角膜神经的共聚焦显微镜观察结果显示16,正常人(2645岁)中央角膜神经纤维丛密度为(712312)根/m2,结果与本实验一致。Calvillo等17报道,LASIK术后2年,角膜神经修复至术前水平,但在术后的第3年,角膜神经的数量又有所下降,降至术前60%。因此,NGF的临床效果尚需更长时间观察,能否促进LASIK术后角膜神经的修复尚未确定。参考文献1 Ambrosio R,W ilson SE.Complications of laser in situ keratomileusis:etiology,prevention,and treatment J.Refract Surg,2001,17(3)350-3792 Aras 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