高效液相色谱法测定植物根系分泌物中的有机酸.pdf

书书书!#年$月!#!#色谱!#$%&%()*$+,(-!*(.+/(0*+12$%&!%(%&!&(!%!收稿日期：!$)#)!)通讯联系人：王*平，女，副教授，高级工程师，研究方向：环境分析化学，*+&：（!$）+#!)，,)-.&：/0,12-#3%4%-45基金项目：南京林业大学创新科研资助项目（#&.）高效液相色谱法测定植物根系分泌物中的有机酸王*平，*周*荣（南京林业大学现代分析中心，江苏 南京!)&.）摘要：以小麦为例，建立了植物根系分泌物中有机酸的提取和测定方法。小麦根系分泌物由培根法培育收集，先后经阳离子和阴离子交换树脂提取，旋转蒸发至干后用 62!/)的稀 27&8%溶液溶解、定容，以$-%&9 1 2!:8%水溶液为流动相，经;.%)-.5+?20)+.2 阳离子交换树脂柱分离，在波长!)5-处紫外检测。在小麦根系分泌物中，有机酸的检测限为)()!A9 1，日内检测精密度为)/!B(%/.B，日间检测精密度为&/&B()/#B，不同剂量的加标回收率为+!/B(#/!B，相对标准偏差为/#.B(&/&)B。该方法简便快速，灵敏可靠，适用于介质复杂的环境样品中有机酸的测定。关键词：高效液相色谱法；有机酸；植物根系分泌物中图分类号：8#$+*文献标识码：*文章编号：)+.)&（!#）&)!&)%*栏目类别：研究论文!#$%&(#&)*+$,(&-.-&/0 123/*$)%45(#6)#0 789&,:4$*)$%(-;&:8/(C 0.5A，D28E F.-6&+5=3.A3&#F+5F.G.H+-+G3%=IF=+H+&%6+=J%K G3+=+G+K-.5G.%5%J%KA5.44.=F+?L=+=JK%-6&5G K%GF M#3.A3 6+KJ%K-54+&.NL.=43K%-G%AK63#I.G3 L&GKH.%&+G（E$）=+G+4G.%5*3+K%G+?L=G+IF 6FF+=G3K%LA3 4G.%5 5=5.%5+?435A+K+F.5 4%&L-5F FLM)F+NL+5G&#*3+&L5G IF G3+5 4%54+5GKG+=.5 K%GK#+H6%KG%K*3+K+F.=L+IF=.FF%&H+=.5=.&LG+27&8%F%&LG.%5 G 62!/)*3+F+6KG.%5 IF 6+KJ%K-+=%5 ;.%)-.5+?20)+.2 FL&J%5.4 4%&L-5 G$O I.G3 5+&L+5G 4%5G.5.5A$-%&9 1 2!:8%G J&%I)KG+%J/$-19-.5，5=G3+%KA5.4 4.=F I+K+=+G+4G+=G IH+&+5AG3%J!)5-M#E$=+G+4G%K H)+KA+K+4%H+K.+F J%K G3+K%G+?L=G+F I+K+.5 G3+K5A+%J+!/B 0#/!B5=G3+=+G+4G.%5&.-.GF I+K+)0)!A9 1，5=G3+K+&G.H+FG5=K=+H.G.%5F（:P）I+K+/#.B 0&/&)BJ%KG3+F+H+5%KA5.4 4.=F*3+.5GK)=#6K+4.F.%5F I+K+)/!B 0%/.B，5=.5G+K)=#6K+4.F.%5FI+K+&/&B 0)/#B*3+F+K+FL&GF=+-%5FGKG+=G3G G3+6K%6%F+=-+G3%=.F F.-6&+，F+5F.G.H+5=K+&.M&+J%K G3+=+G+K-.5G.%5%J%KA5.4 4.=F.5 6&5G K%G+?L=G+F，=+F6.G+G3+6K+F+54+%J G3+6KG.4L&K&#4%-6&+?-GK.?8)$/0：3.A3 6+KJ%K-54+&.NL.=43K%-G%AK63#（2017）；%KA5.4 4.=F；6&5G K%G+?L)=G+F*在植物根系分泌物中最常见的有机酸有：柠檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸、乙酸和丙二酸等。这类物质在植物中具有调节细胞代谢的功效，能活化和固定植物根际潜在的养分。它们一方面可降低根际的 62 值，提高难溶性的磷化合物的溶解度，另一方面可与铝、铁、钙等金属元素形成螯合物，使根际土壤中难溶性的磷释放出来，从而显著提高根际有效磷的浓度，增加植物的吸磷量，达到自身调节和改善营养状况的目的。因此，植物根系分泌物中有机酸的含量和分布对植物营养学的研究起着重要的作用)0%。文献报道有机酸的测定方法有酶法、分光光度法、气相色谱法（C7）、离子色谱法（Q7）、高效液相色谱法（2017）及毛细管电泳法（7,）等，其中 Q7、2017 和 7,是目前较精确、较常用的仪器分析法$0#，但它们在使用中都存在一些问题：Q7 易受介质干扰，对样品的要求较高；7,也能测定有机酸，但由于毛细管柱内径小，导致检测光程变短，检测灵敏度较低，远不能满足环境样品中痕量、超痕量色谱第!卷有机酸分析的要求。低分子质量的二元有机酸的分析以往大多采用反相液相色谱和离子交换色谱系统，但由于植物根系分泌物成分复杂，其中有机酸的含量又很低，再加上经取样到分析的全过程极易受到污染，分析难度较大，因此长期以来缺少准确、可靠且适用于植物根系分泌物中有机酸的分析方法。#本文采用!#$%&()*+,-./$%-阳离子交换树脂柱，以&)#01 2-!34水溶液为流动相，选取前述植物根系分泌物中最常见的%种有机酸为研究组分，考察流动相的 5-值及分离温度对%种有机酸，特别是对较难分离的柠檬酸、酒石酸和丙二酸等有机酸分离效果的影响。本文所建立的方法精密度、准确度和再现性均符合痕量组分测定的要求，并且具有样品用量少、分析快速等特点，用于铝胁迫时植物根系分泌物中有机酸的分析与研究，结果令人满意。!实验部分!仪器和试剂#仪 器：6&7+89(高 效 液 相 色 谱 仪，6&7+89!)紫外吸收检测器，:*5#;+8 色谱工作站（美国6&7+89 公司）；%!(*旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；3&87#8；进样量*(!2；紫外检测波长!*(*)。在选定的色谱条件下，得到%种有机酸混合标准品的色谱图见图*。图!$种有机酸标准品的色谱图#$!%&()*+($*)(,($*-#.*.#/0+*-/*/0.+&?9：*#,&0A&A；!A78A&A；+7&87&8A&A；)&$0A&A；&)&0#*A&A；9）浓缩至近干，用 5-!,*的稀-E04溶液溶解残留物并定容至*()2，用(,&!)滤膜过滤后作为试液，同时做样品空白，供-.2E 分析。!&有机酸的分析$!#定性#采用两种方法对植物根系分泌物中的有机酸组分定性：在相同的色谱条件下，将样品色谱图与有机酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的有机酸；在样品中加入有机酸的标准溶液，根据峰高的突增进一步验证色谱峰的归属。#定量#植物根系分泌物中的有机酸浓度很低。本实验采用:*5#;+8 色谱工作站中增强型积分法测量峰面积，按外标法定量。#结果与讨论#!色谱条件的优化(#!分离柱的选择#本实验先后使用美国 6&7+89 公司的%+9#0F+E*$色谱柱、2&E*$色谱柱、(0&*79 E*$色 谱 柱 和!#$%&公司的()*+,-./$%-色谱柱筛选分离柱，其中前+种色谱柱均为硅胶基质的 E*$化学键合相柱，结果发现：%+9#0F+E*$色谱柱基线漂移，干扰(!第 期王!平，等：高效液相色谱法测定植物根系分泌物中的有机酸部分有机酸出峰；!#$#$色谱柱分离效果不是很好；而%&()*$#$色谱柱和+),-.#%/)01 234-$%2 色谱柱基线稳定且分离效果也很好。但由于+),-.#%/)01 234-$%2 色谱柱是阳离子交换树脂柱，柱分离效能高，方法的再现性和检出限均优于%&()*$#$色谱柱，且色谱峰形尖而窄，适宜痕量分析，所以本方法选用+),-.#%/)01 234-$%2 阳离子交换树脂柱为分离柱。!#流动相的选择!流动相的优化实验表明，被测组分的保留时间在很大程度上取决于流动相的 52 值：52 值越高，分离度越差，灵敏度越高；采用&/,&6!278(水溶液为流动相，样品中各有机酸的分离效果最好，既能得到满意的分离度，又能保证合适的灵敏度。!$#检测器的选择!实验初期，我们曾使用 9(0:*(#(示差折光检测器测定有机酸，该检测器通用性好，能有效地检测多种有机酸，但灵敏度较低，不适宜用于痕量分析。而 9(0:*)*紫外吸收检测器灵敏度高、选择性好、线性动态范围宽、对流动相速度波动以及温度变化不敏感，同时还适用于梯度洗脱。基于有机酸在+,(+/范围有较强的紫外吸收，最终确定在#+/波长处紫外检测。!#样品预处理条件的优化!在文献#报道的植物样品预处理的基础上，分别取一定量的小麦根系分泌物，加入不同浓度水平的标准混合溶液，在优化的色谱条件下，筛选样品预处理条件。主要优选内容如下：（#）阴、阳离子交换树脂的筛选。阳离子交换树脂主要用于除去样品中干扰离子（如%&-和$-），阴离子交换树脂用于富集有机酸。目前实验效果较好的有%/;0:&)(001#.$阴离子交换树脂、%?&+9-4$+),-.#阳离子交换树脂和%),%?#-4$+),-.#阴离子交换树脂。通过与标准混合溶液比对，分别选用%/;0:&)(0 01#.$作为本实验用阳离子、阴离子交换树脂。（）洗脱剂的筛选。能将有机酸从阴离子交换树脂中定量洗脱的洗脱剂主要有 /,&6!甲酸和#/,&6!盐酸，后者的洗脱率稍高于前者。（）溶解液种类、浓度和 52 值的筛选。查阅文献 ，再经实验数据比对，选定 52#的稀 2$&8(溶液作为溶解液。最终选定的样品预处理条件见“#”节。!$#标准曲线及检测限!根据前述实验步骤和条件，将混合标准系列溶液依次等体积进样，分别得到%种有机酸组分的工作曲线，并以信噪比为 确定检测限，结果见表#。表#有机酸的工作曲线和检测限#$%&#%($)#*(+,-.)/&0#,1 1&*&-*(+,%(2(*0+3*4&+)5#,(-#-(108:A)BB)#!)0:A06（/A6!）.0A:0*),0CD(),#）!)/)(,E#0(0B(),）6（/A6!）81&)B B)#+&/#+0#($(.#+&$-#+*+)%+#$)(:)B B)#+&+/#+0#&+).#+($-($+)&+$F:(:)B B)#+&/&+0#&$*.#+($-#$&+)+G&)B B)#+&+/#+0+#)(.#+($-#+)$+#+7DBB)B B)#+&/&+0%#*+.#+*$/*+)&+%B0()B B)#+%&/#&+0&#*)*.#+($/$#+)+#&G&,)B B)#+&+/#+0#+(.#+($-$*+)$+#+!#）：50H:0；$：/*B,B0(:(),，/A6!）=0(0B(),&)/)(*0:0#0(0:/)0#;*0#,*)A&-(,-,)*0:(),E（%&0）!%#方法性能指标的考察!%!#精密度试验!本 实 验 采 用 加 标 法 对 添 加 高（#1+,&1+/A6!）、低（+1#,+1&/A6!）两种不同质量浓度的混合有机酸标准溶液的小麦根系分泌物样品分别于同一天内平行测定&次，计算日内精密度；再分别平行测定&#，计算日间精密度。结果表明，所测样品的日内精密度为#1 I,(1%I，日间精密度为 1 I,#+1*I。!%!#回收率试验!准确吸取已测知含量的小麦根系分泌物样品试液&份，每份准确加入一定量的有机酸混合标准溶液，按“#”节“离心冲洗液，上层清液”后所述对加标样品试液处理后制成待测溶液，在优化的条件下测定并计算各有机酸的加标回收率和平均相对标准偏差（.7=），结果见表。!&#样品的测定!样品预处理后，根据“#(”节所述定性方法，分别将#+!适宜质量浓度的标准液和样品液注入高效液相色谱仪中，根据保留时间对样品色谱峰定性。小麦根系分泌物中可以检出的有机酸有苹果酸、柠檬酸，还有少量草酸，其他有机酸未检出。样品色谱图见图。结果表明，用本方法测定植物根系分泌物中的有机酸，其中草酸、柠檬酸和苹果酸的质量浓度分别为（+1#+&2+1+）/A6!，（#1+#*2+1#)）/A6!和（1&2+1($）/A6!。#(色谱第!卷表!小麦根系分泌物中有机酸的回收率（!#$）!#$%!&%()%*+%,(-(*./+0,%120%0-*(3 45%6*(6,（!#$）!#$%&$&(!&#&%$)*（+#*,）-(.(*（+#*,）/01%(*（+#*,）2.03.4*5267*5!8$)&$&(%9&%$%9!%9!(9)!9)*%9$%9$*%)(9%&9+%9%9*!)$9)&9$:&;&$&(&9%&+%9$%&9+!)9!%9+*&9%&9)&)%9(&9!*!9%!9*$)!9)&9&).$?：&9 08$)&$&(；!9&;&$&(；(9+$)&$&(9#结论-采用 A,:法测定植物根系分泌物中的痕量有机酸，样品制备简便，分离效果好，方法的线性范围及分析结果的精密度、准确度和回收率都能满足植物根系分泌物中痕量有机酸定性和定量分析的要求。由于植物根系分泌物样品介质复杂，待测组分浓度低，所以样品预处理需要经过复杂的提取和净化过程，并且所用器皿使用前一定要清洗干净，以保证测定结果准确可靠。本方法的建立为植物根系分泌物中痕量有机酸的研究，以及植物根际环境中有机酸作用机理的探寻提供了重要的实验手段。参考文献：&-=$B/，)$%;E4，!%，&!：+*!-=$B/，24$%2，7.)E$&F.G9)$%;6&.%.，!%&，+：!*(-=$B/，DE.%#6 B，=$;1+0;0 A9)$%;:.)E4&0)，&)*，(：&%&)-B0%.7,9)$%;60&)，&)，!%$：!$-,0(&6，20&%H9 B:E0+$;0#-，&)$，*%+：(*$+-C$%#D=，6&3$#11=，A0;I B，=$;1+0;0 A9 E4&0)$%;，!%，&%：*!*-I$%#DE.%#J$%9K1$)&;$;&3.$%(K1$%;&;$;&3.-%$)4&L4:E0+$;0#$ME49 N.&O&%#：:E.+&$)P%(1;4.（汪 正范9 色谱定性与定量9 北京：化学工业出版社），!%-H$0 A$&4$%，,&$0 Q&$0O1%，I$%#6E$%#1$%#，A1 Q&$00%#9:E&%.B01%$)0J-%$)4;&$):E.+&;4（高海燕，廖小军，王善广，胡小松9 分析化学），!%，(!（&!）：&+$)-H10 C&%#，Q&$0 DE$0M&%#，I$%#A0%#，A1$%#.%#Q&%8&$%#，C$%#:E0%#，,&1 C0%#E$&，/$%C$%M&%#9:E&%.B01%$)0J-%$)4;&$):E.+&;4（俞乐，彭新湘，杨崇，刘拥海，范燕萍9 分析化学），!%!，(%（)）：&)&!-6E$%,&$%O1，I$%#:E.%#E0%#，6E$%,&%#R&%#，,&%C$%9:E&%.B01%$)0J-%$)4;&$):E.+&;4（单连菊，王成红，单凌青，林艳9 分析化学），!%，!（）：$!