核桃楸青果皮等浸出物对小鼠巨噬细胞内一TNF基因表达的影响.pdf

第 l 3卷第 l 2期 2 0 0 3年 6月 中国现 代医学杂 志 C h in a J o u rna l o f Mo d e m Me d i c in e V_DI 1 3 No 1 2 】m 2 0 0 3 核桃楸青果皮等浸 出物对小鼠巨噬 细胞 内 一TNF基 因表达 的影 响 第四军医大学吉林军医学院生理教研室(吉林 1 3 2 0 0 1)姜丽萍 北华大学 医学院血液教研室 常殿武傅桂连 长春中医学院 梁志彬 论著 目的：确定小鼠应用核桃楸青果皮等浸出物后腹腔 巨噬细胞内 T NF a mR NA表达的变化。方法：雌雄 小鼠随机分组。口服给药后制备 巨噬细胞涂片；克隆 h TNF c D N A的 P G EMl 质粒转化 E e o l i J M1 0 3。选择阳 性克隆细胞培养扩增；随机引物法制备地高辛标记的探针；利用原位杂交技 术检 测 巨 噬细胞 内 T N F a m R NA的表达。结果：抗肿瘤核桃楸青果皮等浸出物可增强小鼠腹腔 巨噬细胞 内T N F a mR NA表达。结论：本 项目研究揭示了抗肿瘤中草药核桃楸青果皮等浸 出物用于抗肿瘤的作用机理。关键词核桃楸青果皮TNF 原位杂交 分类 号R 9 7 9 1 THE EI ECT oF GREEN PEEL HI CKoRYNI 兀 EXTR ACTI oN oN 1 匝 1【F hGENE EXP RES S I oN I N P E RI T ONE AL M ROP HAGE 0F M I(：E J i a n g Li pi n g，Ch a n g Di a n wu，Fu G ui l i a n，e t a 1 De p a r t me n t o f Ph y s i o l o g y，J i l i n Mi l i t a r y Me d i al Co l l e g e，F o u r t h Mi l i t a r y Me d i al Un i v e r s i t y，J i l i n 1 3 2 0 01 A b s t r a c t Ob j t i v e：T od e t e c t t h e c h a n g e s o f TN F a n l RN A e x p r e s s i o n i n t h e p e r i t o n e a l ma c r o p h a g e o f mi c e t h a t t o o k t he e x t r a c t i v es o f g r e e n p e e l o f h i c k o r y n u t、Me t h o d：Ma l e a n d f e ma l e mic e we r e d i v i d e d a t r a n d o m i n t o g r o u p s t he e x t mc t i v es o f g r e e n p e e l o f h i c k o r y n u t wa s o r a l l y g i v en a n d t h e n S Ime a r s o f ma c r o p h a g e a l i c e s we r e p r e p a r ed P l asmi d o f p GEM 1 wh i c h c o n t a i n ed b TNF qc DNA Was t r a n s f o r med i n t o E Ce l l J M1 0 3。b a c t e r i a w骶 s e l ect ed a n d c u l t u r e dTh e e x p r e s s i o n of TNF amRNA i n ma c r o p h a g es d e t ect ed wi t h h y b r i d i z a t i o n i n s i t u、Re-s u i t s：Th e e x t mc t i v es o f t h e Ch i n e s e medi c i n e c a n p r o mo t e t h e e x p r e s s i o n o f TNF a mRNA i n p e r i t o n e a l ma c r o p h a g e o f mi c e Co n c l u s i o n：Th e me t h o d o f mo l ecu l a r b i o l o g y c a n b e u s e d t o s h o w t h e me c h a ni s m o f an t i c u rin g c a n c e r b y e x t mc t l v es o f g r e e n p e e l o f h i c k o r y n u t e t c s o me c h i n e s e ber hal medic i n e Ke y wo r d s：Gr een P e e l o f Hi c k o r y n u t；TNF a；Hy b r i d i z a t i o n i n S i t u a一肿瘤坏死 因子(t u mo r n e c r o s i s f a c t o r a)是 由巨噬细胞产生，对癌细胞有特异性杀伤作用，而对 机体 的正常细胞无损害 的一种活性蛋 白质【1 2】。美 国 G e n e n t e c h公 司于是 1 9 8 4年 首次分离 获得 了这 一蛋 白并 制备 获 得 了表 达人 的 TNF c DNA。1 9 8 5 年将其基因产品 T N F a 用于临床治疗。但是，应用 吉林省 教育 厅科 研基金资助项 目，编 号 9 9 5 6 基因工程产品的 T NF a治疗肿瘤 无疑是很 昂贵的。因此，我们利用分子生物技术，来寻找到具有同基因 工程产品 T NF相 同作用的中草药，为恶性肿瘤 的病 人提供一种价格低，且疗效好的药物。我们 在对小 鼠应用 核桃楸 青果皮 浸 出物作用 后，利用原位杂交技术检测小 鼠腹腔 巨噬细胞中 3 2 维普资讯 http:/ 第 1 2期 姜丽 萍，等：核桃 楸青果皮等浸 出物对小 鼠巨噬细胞 内 a TNF基 因表达的影响 TNF a mRNA含量的变化。实验结果 证明核桃楸 青果皮 浸 出物对 TNF a的转 录具有 较强 的促 进效 应。1 材料和方法 1 1 材料 DE P C(焦 炭 酸 二 乙酯)，多 聚 赖 氨 酸，S D S，S e p h a r o s e 2 B，为 S i g ma产 品，多 聚 甲醛，甲酷胺，为 F l u k a产 品，限 制 性 内切 酶 为 P r o me g a产 品，Di g R NA标 记 试 剂盒(S P 6 T 7)C a t，No 1 1 7 5 0 2，An t i d i g Ox i g e n i n A P F a b f r a g me n t Cat，No 1 0 9 3 2 7 4，为 德国宝灵曼产品。1 2方 法 1 2 1 小鼠 口服核桃楸青果 皮水浸物 实验 动物 及分组：采用 白求 思医科大学实验 动物部饲养 的正 常小 白鼠。雌雄随机抽样，体重为 1 8 2 0 g，实验组 9只，对照组 8只。1 2 2 药品及 给 药 核桃 楸青果 皮(Gr e e n p e e l Of Wa l n u t C h i n e s e c a t a l p a)按常规 煎制浓缩含 生药0 2 g ml，小 鼠按每公 斤体重 0 4 ml k g口服 给药，连服 1 0 d，每 日 1次。对照组 口服生理盐水。1 2 3 小鼠腹 腔 巨噬 细胞 的制 备在猝 死 之前 2 4 h，腹腔注射 1 可溶性 淀粉 后，取 5 ml 1 6 0 4培养 液腹 腔 注 射，猝 死。抽 取腹 水 约 2 ml，离 心 1 0 0 0 r p m mi n，3 ml n，弃上清，加适 量 1 6 4 0培养液制成细 胞浓度为 1 1 0 个 ml，待细胞涂片用。1 2 4 探针制备感受态大肠杆菌的制备和转化：主要依据 S a mb r o o k等人 的方 法 】制 备感受态大肠 杆菌，并进行质粒转化。质粒 DNA的小量制备 和快速 鉴定：质粒 D NA 的小量制 备依然采用 S a mb r o o k等人方法。快速鉴 定：取小量制 备 的质粒 各 l u l，上样 于 0 8 琼脂 糖 凝胶样 品槽 内，以 0 5TB E为电泳缓 冲液，在微型 电泳槽 内，电压为 5 0 V 的条件下，电泳 2 0 3 0 mi n，紫外灯下观察电泳结果。质粒 D NA 的中量制备：取 2 5 ml 菌液接 种至 5 0 ml L B培养基 中，3 7 ，2 0 0 r p m，强烈振荡过 夜后 l min，弃上清，用消毒过 的滤纸轻轻吸干残余液，S TE漂洗 2次，离 心后去尽上清。各管 内分别加冰 预冷溶液 I 2 0 0 u l 重悬 菌体，旋 涡 混匀，加入 4 0 0 u l 新配制的溶液，快速颠倒数次，混匀，置冰上 5 mi n 再加入冰预 冷 的溶 液，缓 缓颠 倒 数次，使成 乳浊 状，至冰上 1 0 mi n，1 2 0 0 0 g，4 ，离 心 1 0 mi n让 自然 停转后，用 4层纱布过滤至另一离心管中，滤液加 0 6 V异丙醇，室温离心，5 0 0 r mi n，1 5 m i n，弃上清，沉淀干燥后，加入适当 TB溶解。质粒 DNA的纯化和酶切鉴定：质 粒 DN A 的纯 化依照文献【6 J 方法进行。分别用 Hi n d 和 E e o R I 单酶消化纯化 的 DNA质粒。上样于 1 2 琼脂 糖 凝胶样 品槽 内，以 0 5TB E为 电泳 缓 冲液 电泳。紫外灯下观 察酶 切是否完 全及 质位 DNA的大小，同时参照 DNA ma r k e r 判断其长度是否正确。质粒 DN A 的线性化及纯化：取适量质粒 DN A，按上法水解后，应用质粒 DNA的 中量 制 备方法 纯 化线 性 D NA，TNF amRN A 探 针 的标 记 依 照 文 献l 5 6 J 方法进行。原位杂交。载玻 片 的预处 理参 照文献，】方法 进行。细胞涂 片 的制备 参照文 献 】方 法进行。预 杂交和杂交参照文献 J 方法进行。1 2 5 免疫 学检测 取 己过夜杂交的载玻片，弃杂 交液，并在 4S S C中轻轻 漂洗，移 去 P a r a f i l m膜，放 置 6 0 孵 育1 5 2 0 mi n，然 后 于 3 7 ，含 R Na s e 2 0 u l ml 的 2S S C溶液 中 3 0 ml n，以除去非 结合的R N A探针。然后，将玻片依次置于 1 S S C，0 5 S S C和 0 1 S S C中，6 0 洗涤 1 5 2 0 mi n，再 移入 P B S中洗涤 5 mi n，取 出后，用 3 B S A非特异 性封闭，室 温 1 0 2 0 mi n，吸去封 闭剂，加 新鲜配制 的碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(抗 DI G A P F a b，1：5 0 0稀释)约 5 0 u l，室温下孵育 2 h。待反应完 毕后，用 0 1 Twe e n TB S洗涤 3次，每次 5 mi n。显 色，室温下避光反应 1 h以上，时 常用显微镜观察颜 色反应，至出现满意结果 即可用 TE(p H8 0)终止反 应。甲基绿复染：待颜色反应终止后，用消毒水洗玻 片数分钟，滤纸 然后加入 1 的甲基绿染液复 转入 1 5 ml的 E p p e n d o ff管，以 1 2 0 0 g室温 离 心 染。最后用 9 0 甘油(P B S：稀 释，3 3 维普资讯 http:/ 中国现代 医学 杂志 第 l 3卷 封片、拍照。2 结果 重组 TNF a的 p G E M 一1质粒 图谱 见 图 1。质 粒的纯化层析图谱见 图 2。质粒 的酶切鉴定 图谱见 图 3。使用核桃楸青果皮浸出物的实验组原位杂交 结果：通过计算 1 0 0 0个细胞 中的 阳性细胞个 数(胞 浆兰紫染 色为 阳性 杂交信号)，对 比对照组计算 两组 有显著差异 P0 0 0 1。图 1 p G EM l质粒 图谱，h T NF一口c DN A插 入 位 点位 于 Hi n d 和 X b a l之 间 图 2 S e p h a r o s e2 B层析 法分 离 R NA与质粒 DN A，l T E缓 冲液 洗脱，流 速 0 3 ml mi n,峰 l 为质 粒 6 0 o I 2 o 0 2 5 o 0 3 O 0 0 4 O 0 0 1 2 l：标准 DNA片段 对照；2：重组体 Xhal E c o Rl酶切鉴 定：克 隆片段 约 6 0 0 b p，载体 约 3 0 0 0 b p 图 3 重组体 的酶切 鉴定 3 讨论 本研究采用原位杂交技术分析核桃楸青果皮等 浸出物与小 鼠腹腔巨噬细胞 TNF a 基 因表达的相关 性。获得令人满意的结果。核桃楸青果皮(G r e e n p e e l o f Wa l n u t C h in e s e c a t a l p a)，它具 有抗菌作 用，核桃楸 青果皮醇提取 物 在体外能抑制大肠 杆菌、金 黄 色葡 萄球菌及枯草杆 菌；它还具有抗病毒作用。核桃楸青果皮煎剂对流 感、亚洲型 6 8 1株和弧儿病毒 E C H O有抑制作 用。我们通过原位 杂交检测技 术，首 先发 现了它具 有促 进小 鼠巨噬细胞 的 TNF amR NA表达 的效 应，因此它具有抗肿瘤作 用。本实验研究过程 中应 用原位杂交技术，由于我们使用的是 R N A探针，R NA特别易受 Rn a s e水 解。为 了排除特 异性 杂交 信号，必须考虑严谨性 的问题。因此我们选择在高 温 6 0 ，按低 盐漂洗顺 序进 行。因为，通过 高温能 发生解链，在低盐时使氢键结合降低，两种因素同时 排除 了非特异性杂交信号，保证原 位杂交的高度严 谨性和科学性。参考文献 1 Ca r s we l l EA An e x o t o xin i n d u c e d s e r u l T l f a c t o r t h a t G u s e s n 硅c n)s j s o f t u mo u s Pr o c Na t l S c i U s A，1 9 7 5：1 2 Ca r s we l l EA Ef f e c t o f TNF o n c ul t ur e d h t u n a m me l a n o ma c e l l s n a t u r e，1 9 7 5：2 5 8：73 1 3 S a mb r o o k J Mo l e c u la r C l o n i n g：A L a b o r a t o r yMa n u a 1 2 n ded C o l d s p rin gHa r bo rLa bor a t o ry Pr e s s1 9 89：1 4 苏翠芬 遗 传工程理论 与方 法 北京：科 学出版社。1 9 8 7：1 6 9 5 Sh a l a b y MRAc t i v a t i on o f h u ma n p o l y mo r p h on u c l e a r n e ut r o p h i l f u n c t i o n s b y i n t e r f e r o n r a n d t u m o r n e c lo e a i s f a c t o r s，J i mmu n o l，1 9 8 5；1 35：2 0 6 3 6 梁国栋 最新分 子生物学实验技 术 北 京：科学技术 出版社 2 0 0 1：1 7 S u m Yi n g，e t a 1 TNF 口一mRNA e xp r e s s i o n i n a l l e r g i c i n f l a mme t l o n Cl imi c a l a n d Exp e r i me ntal Al l e r g y。1 9 91；21：7 457 5 0 8 伍欣 星 医学 分 子 生物 学 原 理与 方 法 北 京：科 学技 术 出版 社 2 0 0 0：1 (2 0 0 20 82 9收稿王 学铭审稿席浩编辑)3 4 目 1 1 s l 7 0 2 2 4善昌 4 9 ，6 ：8&剐蒯 垂 维普资讯 http:/