佛山地区55例新生儿血红蛋白E合并地中海贫血病例的基因型和血液型特征分析.pdf

分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7论著基金项目：广东省联合基金面上项目（2021A51515220091）作者信息：1.南方医科大学检验与生物技术学院医学检验系，广东，广州 5105152.佛山市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心，广东，佛山 5282003.南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室，广东，广州 510515通信作者：余楠，Email：佛山地区55例新生儿血红蛋白E合并地中海贫血病例的基因型和血液型特征分析林粤1，2周万军3余丰2张澎怡2刘海平2余楠1摘要 目的分析佛山地区新生儿血红蛋白 E（Hb E）合并地中海贫血基因型和血液学表型的关系。方法选取 2019 年 1 月至 2020 年 12 月佛山市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心 126 939 例新生儿血斑进行毛细管电泳初筛，Hb E 阳性样本采用反向斑点杂交法检测其珠蛋白基因，并进行血液学分析，采用红细胞数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、Hb E、血红蛋白 Bart（Hb Barts）含量比较血液学表型。结果126 939 例新生儿血斑卡经毛细管电泳检出 HbE 条带样本 208 例，召回 55 例（召回率 26.44%），经珠蛋白基因检测确诊为异常 Hb E 病，佛山地区新生儿异常 Hb E 病检出率为 0.16%。55 例中 Hb E 杂合子 44 例，Hb E 合并SEA/3 例，Hb E 合并3.7/3 例，Hb E 合并 CS/2 例，Hb E 合并 4.2/、SEA/合并 654/E、SEA/3.7 合并 N/E各 1 例。55 例异常 Hb E 的新生儿均呈小细胞低色素性贫血，单纯 Hb E 杂合子为中度贫血，HGB（107.912.8）g/L，MCV（80.49.9）fL；1 例 Hb E 合并SEA/3.7，HGB 99 g/L，MCV 62.5 fL；1 例 Hb E 合并、地贫（SEA/654/E），RBC 3.91012/L，HGB 89 g/L，MCV 为 72.8 fL。结论异常 Hb E 可合并不同地中海贫血基因型，临床表型具异质性，与贫血程度相关，临床应重视 Hb E 合并地中海贫血的筛查并尽早予以干预治疗。关键词新生儿筛查；血红蛋白 E；地中海贫血；基因型Genotype and blood type characteristics of 55 neonatal hemoglobin E combined withthalassemia cases in Foshan areaLIN Yue1，2，ZHOU Wanjun3，YU Feng2，ZHANG Pengyi2，LIU Haiping2，YU Nan1（1.Department of Laboratory Medicine，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern MedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong，China，510515；2.Neonatal Disease Screening Center，Foshan Maternaland Child Health Hospital，Foshan，Guangdong，China，528200；3.Department of Medical Genetics，Schoolof Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）ABSTRACTObjectiveTo investigate the distribution of thalassemia/Hb E disease and therelationship between thalassemia/Hb E genotype and hematologic changes in newborn screening program inFoshan，Guangdong Province，China.MethodsFrom January 2019 to December 2020，126 939 neonatalblood spots from the Neonatal Disease Screening Center of Foshan Maternal and Child Health Hospital wereselected for primary screening by capillary electrophoresis.The globin gene of Hb E positive samples wasdetected by reverse spot hybridization，hematological phenotypes were compared using number of red bloodcells（RBC），hemoglobin（HGB），mean volume of red blood cells（MCV），mean hemoglobin concentration（MCHC），Hb E，hemoglobin Bart（Hb Bart s）.ResultsTotally，208 from 126 939 newborns were 1138分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7血红蛋白 E（hemoglobin E，Hb E）是世界常见的三大异常血红蛋白之一，多见于东南亚地区，我国以广东、广西多见1。Hb E 生成是由于珠蛋白基因发生点突变，其 链第 26 位谷氨酸被赖氨酸替代2。近年，血红蛋白毛细管电泳检测技术不断发展，较之以往采用的琼脂糖凝胶电泳技术和高效液相色谱分析技术，毛细管电泳技术区分血红蛋白 A2 与 Hb E 条带更敏感，从而提高了 Hb E检出率3。本研究采用血红蛋白毛细管电泳检测技术从 126 939 例佛山地区新生儿血斑标本中筛查出有 Hb E 条带者 208 例，进一步对其中召回的55 例进行基因型和表型分析，为 Hb E 病的新生儿筛查工作和临床诊治提供参考。1资料与方法1.1研究对象选取 2019 年 1 月至 2020 年 12 月佛山市新生儿疾病筛查中心 126 939 例，男女比为 1.251。纳入标准：出生满 320 天的新生儿；符合 新生儿疾病筛查技术规范（2010 版），血斑卡质量符合采血要求；有完整的采血卡片信息及结果登记册。排除标准：采血日期超过（含）出生 20天；血斑卡质量不合格。本研究通过院伦理委员会批准，并获得患儿法定监护人的知情同意书。1.2标本采集按照 新生儿疾病筛查血片采集技术规范（WS376.32013）要求4，采集新生儿足跟血，垂直滴于新生儿筛查采集卡上制成直径8 mm 的血斑34 个，自然晾干，置密闭封口袋，28 冰箱暂存，定期送至本中心待检。1.3方法1.3.1血细胞分析采用 Sysmex XT2000i 全自动血细胞分析仪测定血细胞参数，包括红细胞计数（red blood cells，RBC）、血红蛋白含量（hemoglobin，HGB）、红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均红细胞含量（mean corpsular hemoglobin，MCH）、平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobinconcentration，MCHC）等。根据 儿童血细胞参考区间（WS/T 7792021）5判断贫血程度：新生儿HGB 为 144120 g/L 者为轻度，11990 g/L 者为中度，8960 g/L 者为重度，60 g/L 者为极重度。1.3.2全自动毛细管电泳检测采集的干血片打孔制成试验用直径 3.2 mm 血斑，加入蒸馏水浸泡。于 272 h 内采用全自动毛细管电泳仪（CAPILLARYS 2 FLEXPIERCING，法国 Sebia 公司）及配套 CAPILLARYS HEMOGLOBIN（E）试剂盒，按厂家提供的标准操作程序检测。经稳定恒压电泳，于 415 nm 波长比色检测HGB 各组分百分比。正常和异常（或变异体）HGB在碱性缓冲液中电泳，从阴极到阳极依次为：A2（A2变异体）、C、A2/O阿拉伯 HGB（OArab）、E、S、D、G 费城 HGB（GPhiladelphia）、F、A、Hope、Bart、J、N巴尔的摩 HGB（NBaltimore）和 H，电泳仪自动识别电泳条带位置，从而区分HGB A2和Hb E。1.3.3地中海贫血基因分析毛细管电泳初筛到 HGB Hb E 阳性者，召回采血进一步基因检测。采用 DNA 快速提取试剂盒（潮州凯普生物技术有限公司）提取全血 DNA，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）后，detected Hb E by capillary electrophoresis neonatal plaque samples，55（26.44%）of 208 were recalled andconfirmed Hb E abnormal by globin gene testing.Abnormal Hb E disease was confirmed by globin genetesting，and the detection rate of abnormal Hb E disease in Foshan was 0.16%.Among the 55 cases，Hb E washeterozygous（44 cases），Hb E combined withSEA/3 cases，Hb E combined with 3.7/3 cases，HbE combined with CS/2 cases，Hb E combined with 4.2/、SEA/combined with 654/E、SEA/3.7 combined with N/E 1 case each.All 55 neonates with abnormal Hb E disease had microcytichypochromic anemia，simple Hb E heterozygous was moderate anemia，HGB（107.912.8）g/L，MCV（80.49.9）fL；1 case Hb E complexSEA/3.7，HGB 99 g/L，MCV 62.5fL；1 case Hb E composite ，thalassaemia（SEA/654/E），RBC 3.9 1012/L，HGB 89 g/L，MCV 72.8 fL.ConclusionAbnormal Hb E can compound different thalassemia genotypes，and the clinical phenotype is heterogeneous，which is related to the degree of anemia，and clinical attention should be paid to the screening of Hb Ecombined with thalassemia and early intervention and treatment.KEY WORDS Neonatal screening；Hemoglobin E；Thalassemia；Genotype 1139分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7扩增产物与标记不同缺失或突变类型地中海贫血探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，通过化学显色判读结果。地中海贫血试剂检测中国人常见的 3 种非缺失型（CS/、WS/、QS/）和3种缺失型（3.7/、4.2/及SEA/）。地中海贫血试剂检测常见 17 个位点突变（CD41 42、CD7172、CD14 15、CD27/28、CD17、CD31、CD43、IVS II 654、IVSI1、IVSI5、28、29、30、32、E、Cap、Int）。1.3.4统计学处理采用 SPSS 21 进行统计学分析。计量资料以（x s）表示，采用 t 检验，以 P0.05）。Hb E 与合并 654地中海贫血时，Hb E 含量比单纯 Hb E 杂合子高，Hb A 含量比单纯 Hb E 杂合子低。本研究中44 例单纯 Hb E 杂合子样本，毛细管电泳均未见Hb Barts 条带；11 例 Hb E 复合静止型地中海贫血（3.7/、4.2/、CS/）或轻型 地中海贫血（SEA/），毛细管电泳均可见 Hb Barts 条带。见图 1。55 例新生儿 Hb E 合并、地中海贫血的各组分血红蛋白的情况见表 2。3讨论地中海贫血是最常见的常染色体隐形遗传病，是由于珠蛋白基因突变造成蛋白缺陷或合成不足而引起的一种遗传性溶血性疾病6。近些年遗传性血红蛋白病在全球的致病率呈现增高趋势7。我国南方是地贫高发地区，特别广东、广西，基因型/ESEA/复合/E3.7/复合/ECS/复合/E4.2/复合/ESEA/复合 654/ESEA/3.7复合/En44332111Hb E（%）3.191.22.50.52.830.92.20.52.35.62.9Hb Barts（%）01.72.00.20.30.800.21.613.1Hb A（%）8.83.09.84.59.33.58.12.45.21.514.5Hb A2（%）0.030.100.070.10000Hb F（%）88.04.286.04.387.64.688.93.192.391.369.5表 255 例新生儿 Hb E 合并、地中海贫血的各组分血红蛋白的情况（xs）Table 2Hemoglobin E associated with and thalassemia in 55 neonates（xs）基因型/ESEA/复合/E3.7/复合/ECS/复合/E4.2/复合/ESEA/复合654/ESEA/3.7复合/En44332111RBC（1012/L）4.050.84.370.54.400.33.353.413.95.31HGB(g/L)107.912.810510.2107.512.0103948999MCV(fL)80.49.973.410.774.83.090.780.972.862.5MCH(pg)27.24.024.431.124.51.130.727.622.818.6表 155 例新生儿 Hb E 合并、地贫的血液学指标分析及基因型分布比较（xs）Table 1Analysis of hematological indexes and comparisonof genotype distribution of 55 neonates with Hb Ecomplicated with and thalassemia（xs）1140分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7A AB B注：A.单纯 Hb E 病例，出现 Hb E 条带。B.Hb E 合并 地中海贫血病例，同时出现 Hb E 和 Hb Barts 条带。图 1单纯 Hb E 病例与 Hb E 合并 地中海贫血病例的毛细管电泳图比较Figure 1Capillary electrophoretic diagram of Hb E and HbE with thalassemia 链异常血红蛋白绝大部分为 Hb E8。血红蛋白E 的致病机理是由于 珠蛋白肽链第 26 位的密码子发生突变，从而降低了 mRNA 前体剪接加工的效率，导致 链的合成减少，形成 珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白病9。目前，大多数异常血红蛋白 E 复合、地中海贫血病例报道来自成人：广东粤北地区Hb E检出率为 0.19%10，广 东 梅 州 地 区 Hb E 的 检 出 率 为0.118%11，广东中山地区的Hb E检出率为0.16%12，广东信宜地区育龄人群异常 Hb E 病检出率为0.398%13，重庆地区的 Hb E 检出率为 0.25%14。本研究报道了佛山地区 126 939 例新生儿人群异常Hb E 病检出率为 0.16%，由 208 例发现异常血红蛋白 E 中，经召回的 55 例通过基因检测确诊，并按召回比例计算所得。佛山地区新生儿异常血红蛋白E检出率低于广西和广东信宜地区成人的报道，可能由于召回率（26.44%）偏低导致，若有更多毛细管电泳检测出 Hb E 条带的新生儿能通过地中海贫血基因检测确认，会获得更准确的Hb E病检出率。通过比较血液学指标，发现 Hb E 复合地中海贫血时，HGB、MCV、MCH 比单纯 Hb E 杂合更低，小细胞低色素也更加明显。我国大多数异常血红蛋白没有明显贫血表现，少数异常血红蛋白合并地中海贫血之后才出现贫血象加重的表现，发生中度或重度贫血15。当出现 Hb E 复合 地中海贫血和 地中海贫血基因型时，链和 链之间可能互相影响，表现不同程度贫血，贫血严重程度随地中海贫血基因型而改变。本研究有 2 例罕见的复合型：SEA/复合 654/E及SEA/3.7复合/E，较之单纯 Hb E 杂合和Hb E 复合中间型或轻型 地贫的中度贫血，两种罕见的复合型 HGB、MCV、MCH 降低更明显。因病例较少，无法进一步确定新生儿 Hb E 同时合并 地贫、地贫时，链与 链之间是否存在相互平衡的影响。本研究采用全自动毛细管电泳法初筛，相比于琼脂凝胶电泳仪和高效液相色谱分析仪能更好地区分 Hb E 和 Hb A23。新生儿 链合成比成人少，Hb E 含量也比成人低，毛细管电泳仪的高灵敏度能适合筛查出新生儿 Hb E。目前，新生儿的 地中海贫血主要通过出现特征性 Hb Barts 来进行判断1617。因此，通过 55 例新生儿 Hb E 研究，单纯 Hb E 杂合子（/E）时，均未出现 HbBarts，当电泳同时出现 Hb E 和 Hb Barts 条带时，应考虑 Hb E 复合静止型地中海贫血（3.7/、4.2/、WS/、CS/、QS/）或轻型 地中海贫血（SEA/）。新生儿 Hb E 在合并不同地贫基因型中，Hb E 含量均有不同的变化。综上所述，佛山地区是 Hb E 异常血红蛋白高发地区，提高初筛电泳召回，尽早筛查出 Hb E 异常血红蛋白病患儿，能够尽早提供遗传咨询及临床治疗，对该疾病的患儿的生长发育进一步进行干预治疗。参考文献1杨继青，王华伟，张尊月，等.云南省 100 例异常血红蛋白 E患者的血液学和基因型分析 J.中华医学遗传学杂志，2020，37（1）：3336.2王继成，郭浩，黄华洁，等.罕见异常血红蛋白的诊断和临床特征分析 J.中国实验血液学杂志，2020，28（6）：20282032.3秦立，阳文辉，苏航就.血红蛋白电泳在新生儿地中海贫血筛查中的应用 J.中国优生与遗传杂志，2020，28（4）：493508.4卫妇社发 2010 96 号，新生儿疾病筛查血片采集技术规范（2010 年版）S.2010.5WS/T 7792021，儿童血细胞分析参考区间 S.2021.6Behdani F，Badiee Z，Hebrani P，et al.Psychological aspects in children and adolescents with major thalassemia：acasecontrol study J.Iran J PEdiart，2015，25（3）：322.7Angastiniotis M，Lobitz S.Thalassemias：An OverviewJ.Int J Neonatal Screen，2019，5（1）：16.8钟玉杭，叶立新，蔡小娟，等.东莞地区新生儿地中海贫血基因特征及变化趋势 J.中国当代儿科杂志，2020，22（5）：454459.9苏恒学，梁亮，李友琼，等.血红蛋白 E 病中血红蛋白 A2 和血红蛋白 F 水平及其分布研究J.中国临床新医学，2019，12（12）：13001302.（下转第 1146 页）1141分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7织细胞分化，进而增加软骨细胞的生成；另外血小板能分泌大量 PDG 因子，增强局部纤维细胞的分化，诱导骨形成。进一步研究结果还示，研究组组骨不连、骨折愈合延迟、伤口感染的总发生率低于对照组。进一步说明同种异体骨移植有一定的安全性，与赵敬凯等17研究结果一致。需注意的是，同种异骨治疗会引起一定免疫排斥反应，临床针对此可采取相对应的解决措施，如采用冷冻法、脱钙法等进行预防处理。综上所述，同种异体骨移植辅助 PRP 技术对Hepple V 型距骨骨软骨损伤患者短期治疗效果明显，可改善患者 TGF1、PDG、VEGF 因子水平，有较高的临床应用价值，可经深入试验后推广应用。参考文献1康健，付志厚，王冰，等.自体骨软骨移植治疗 Hepple型距骨骨软骨损伤的临床疗效评价 J.生物骨科材料与临床研究，2021，18（1）：8588.2Choi G，Kim BS，Chang JH，et al.Defining the role of transforming growth factor 1 in Foxp3+T regulatory cells J.Immunity，2021，54（3）：393394.3Koba T，Watanabe K，Goda S，et al.The effect of transforming growth factor1 on the mineralization of human cementoblasts J.J Endod，2021，47（4）：110117.4刘林，杨宗宇，刘核达，等.自体带骨膜髂骨移植联合 PRP治疗 Hepple V 期距骨骨软骨损伤 J.中国矫形外科杂志，2021，29（2）：154157.5顾文奇，施忠民，柴益民.距骨骨软骨损伤治疗研究进展J.国际骨科学杂志，2009，30（3）：181183.6范家强，常步青，陶友伦，等.周围预减压式自体骨软骨移植术治疗大面积 Hepple型距骨骨软骨损伤的效果分析J.中华外科杂志，2022，60（6）：615618.7Nam MH，Pantcheva MB，Rankenberg J，et al.Transforming growth factor2mediated mesenchymal transition in lensepithelial cells is repressed in the absence of RAGEJ.Biochem 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