标本涂片.pdf

标本直接涂片标本直接涂片标本直接涂片 标本直接涂片 在临床微生物学检验中的应用在临床微生物学检验中的应用在临床微生物学检验中的应用在临床微生物学检验中的应用江西省人民医院检验科江西省人民医院检验科陈陈 会会2011.052011.05检验报告检验报告“慢慢”“假假”报告报告“多多”假阳性假阳性假阴性假阴性现状及原因经验用药特殊病原体实验室技术经验用药特殊病原体实验室技术污染菌定植菌污染菌定植菌方法学局限方法学局限WHOWHOWHOWHO对临床微生物实验室的指导性方针对临床微生物实验室的指导性方针对临床微生物实验室的指导性方针对临床微生物实验室的指导性方针 尽可能将目标集中在尽可能将目标集中在快速诊断快速诊断方面方面 显微镜检查显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值对建立快速的初步诊断具有很大价值 实验室人员须主动实验室人员须主动与临床结合与临床结合，将实验室数据转 化为临床有用的信息，将实验室数据转 化为临床有用的信息以上要求均与“标本直接涂片”有关直接涂片的理论基础直接涂片的理论基础标本涂片的制作与染色标本涂片的制作与染色直接涂片在临床微生物检验中的作用直接涂片在临床微生物检验中的作用直接涂片的局限直接涂片的局限一、直接涂片的理论基础一、直接涂片的理论基础 生物屏障：正常菌群的生物拮抗作用，亦称生物屏障：正常菌群的生物拮抗作用，亦称“定植抗力定植抗力”（占 位保护、营养争夺、分泌杀菌物质）（占 位保护、营养争夺、分泌杀菌物质）机械阻挡：皮肤、粘膜、血脑、胎盘机械阻挡：皮肤、粘膜、血脑、胎盘 细胞免疫：吞噬细胞的吞噬作用细胞免疫：吞噬细胞的吞噬作用中性粒细胞（主要）中性粒细胞（主要）单核-巨噬细胞NK细胞单核-巨噬细胞NK细胞 体液免疫：补体、抗体、溶菌酶及各种杀菌蛋白等体液免疫：补体、抗体、溶菌酶及各种杀菌蛋白等相关知识非特异性免疫非特异性免疫相关知识吞噬过程自身物质：1、荚膜：亲水，带负电荷，阻滞吞噬活性；抑制补 体激活，干扰调理吞噬2、细菌表面蛋白：如A群链M蛋白，阻断补体替代途 径的激活；金葡A蛋白拮抗IgG调理吞噬3、生物被膜：黏液绿脓宿主物质：血浆凝固酶，使菌体周围血浆凝固，形成纤维 外壳，阻断吞噬相关知识：细菌抗 吞噬机制胞外机制胞外机制胞内机制胞内机制1、产生酶类抵抗杀灭：如葡萄球菌产生过氧化氢酶 抵抗中性粒细胞髓过氧化物酶系统2、阻止吞噬体和溶酶体结合3、有些细菌可突破吞噬体逃入细胞质：淋球菌相关知识：细菌抗 吞噬机制细菌感染=中性粒细胞浸润、聚集细菌感染=中性粒细胞浸润、聚集感染菌=中性 粒细胞吞噬、包裹、伴行感染菌=中性 粒细胞吞噬、包裹、伴行标本直接涂片二、标本涂片的制作与染色二、标本涂片的制作与染色 涂片制作极为重要！涂片制作极为重要！涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检 的结果。涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检 的结果。基本要求：基本要求：1、涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜；、涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜；2、染色结果以细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可 见，菌体革兰染色阴、阳性分明为佳。、染色结果以细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可 见，菌体革兰染色阴、阳性分明为佳。1、痰液、脓液、粪便标本2、液体标本3、血培养阳性瓶1 1、痰液、脓液及粪便标本、痰液、脓液及粪便标本、痰液、脓液及粪便标本、痰液、脓液及粪便标本 直接涂片法直接涂片法 压片法压片法1 1）直接涂片法）直接涂片法）直接涂片法）直接涂片法 用接种环或洁净竹签挑取标本病理部分，于 玻片上直接涂抹而成用接种环或洁净竹签挑取标本病理部分，于 玻片上直接涂抹而成 优点：简便、快速优点：简便、快速 缺点：厚薄不一，不利于染色缺点：厚薄不一，不利于染色2）压片法:优点：厚薄均匀，染色效果好优点：厚薄均匀，染色效果好 缺点：操作繁琐，不利于大批标本制作缺点：操作繁琐，不利于大批标本制作12342 2、尿液、胸腹水、关节液、心包积液等液、尿液、胸腹水、关节液、心包积液等液、尿液、胸腹水、关节液、心包积液等液、尿液、胸腹水、关节液、心包积液等液 体标本体标本体标本体标本取一定量标本，5ml或更多3000rpm离心弃上清取沉渣制片有形成分较少有形成分较多3 3、阳性血培养瓶、阳性血培养瓶、阳性血培养瓶、阳性血培养瓶 悬滴法：取一滴培养液于载玻片上，盖上盖 玻片，暗视野油镜观察悬滴法：取一滴培养液于载玻片上，盖上盖 玻片，暗视野油镜观察 革兰染色：取2-5ml 培养液，加等量无菌蒸 馏水混匀，3000rpm离心5分钟，取沉渣涂片 革蓝染色革兰染色：取2-5ml 培养液，加等量无菌蒸 馏水混匀，3000rpm离心5分钟，取沉渣涂片 革蓝染色三、直接涂片的作用三、直接涂片的作用三、直接涂片的作用三、直接涂片的作用判断标本合格与否判断标本合格与否感染的确认及性质感染的确认及性质提示补充检查提示补充检查提示补充检查提示补充检查对特殊形态的病原体快速疑诊（30mins）以及细菌鉴定的提示作用对特殊形态的病原体快速疑诊（30mins）以及细菌鉴定的提示作用解释、补充或修正培养结果解释、补充或修正培养结果指导快速药敏指导快速药敏快！快！准准!炎性细胞的检出，是确认感染的重要指标！炎性细胞的检出，是确认感染的重要指标！炎性细胞的种类与感染的性质有关！炎性细胞的种类与感染的性质有关！（一）感染的确认及性质（一）感染的确认及性质鳞状上皮鳞状上皮细菌感染真菌感染中性粒细胞淋巴细胞：病毒感染、结核嗜酸性粒细胞：寄生虫感染、过敏性疾病尿中复粒细胞提示肾小管病变：在慢性肾炎、肾梗死、肾充血性梗阻，及血红蛋白沉着时，肾小管上皮细胞中会出现含铁血黄素颗粒，即复粒细胞尿中复粒细胞提示肾小管病变：在慢性肾炎、肾梗死、肾充血性梗阻，及血红蛋白沉着时，肾小管上皮细胞中会出现含铁血黄素颗粒，即复粒细胞（二）对特殊形态的病原体快速疑诊（30mins）以及细菌鉴定的提示作用（二）对特殊形态的病原体快速疑诊（30mins）以及细菌鉴定的提示作用 仅限于无菌部位标本及合格的有菌部位标本！需结合病原体革蓝染色属性、菌体形态、排列 方式、标本来源部位、相关临床信息综合判 断！需要积累大量感性认识，初学者需循序渐进，慎用！如无法确定或把握不大，请别人看一眼！特殊形态病原体特殊形态病原体特殊形态病原体特殊形态病原体 肺炎链球菌肺炎链球菌 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 卡他布兰汉菌卡他布兰汉菌 葡萄球菌葡萄球菌 阴性杆菌阴性杆菌 棒杆菌属棒杆菌属 L型菌型菌 酵母样真菌酵母样真菌 丝状真菌菌丝丝状真菌菌丝 不动杆菌不动杆菌 产生物被膜型铜绿假单胞菌产生物被膜型铜绿假单胞菌 奴卡氏菌奴卡氏菌 淋球菌淋球菌 链球菌链球菌1 1 1 1、肺炎链球菌、肺炎链球菌、肺炎链球菌、肺炎链球菌 革兰染色阳性，成双排列，矛头状或瓜子仁状，一般有荚 膜，不被WBC吞噬，与之伴行革兰染色阳性，成双排列，矛头状或瓜子仁状，一般有荚 膜，不被WBC吞噬，与之伴行 标本类型：呼吸道标本最为常见，其次为眼分泌物、血液、脑脊液标本类型：呼吸道标本最为常见，其次为眼分泌物、血液、脑脊液荚膜矛头状1 1 1 1、肺炎链球菌、肺炎链球菌、肺炎链球菌、肺炎链球菌 CAP患者呼吸道标本患者呼吸道标本 因产生物被膜，菌体变大，染色着色不均匀，呈带因产生物被膜，菌体变大，染色着色不均匀，呈带“壳花 生状壳花 生状”2 2 2 2、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌 革兰染色阴性，细小或呈多形性杆菌，散在，可见吞噬现象革兰染色阴性，细小或呈多形性杆菌，散在，可见吞噬现象 CAP患者呼吸道标本、眼分泌物、血液、脑脊液CAP患者呼吸道标本、眼分泌物、血液、脑脊液菌体大小比较菌体大小比较菌体大小比较菌体大小比较流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌3 3、卡他莫拉菌、卡他莫拉菌、卡他莫拉菌、卡他莫拉菌 革兰阴性双球菌，肾形或咖啡豆形排列，散在，易见吞噬现 象革兰阴性双球菌，肾形或咖啡豆形排列，散在，易见吞噬现 象 CAP患者呼吸道标本常见，但仅引起局限性感染；亦可累及 全身。CAP患者呼吸道标本常见，但仅引起局限性感染；亦可累及 全身。与非致病奈瑟菌区别：后者多见成群，常与SEC伴行或粘附 于其他上呼吸道正常菌群之上与非致病奈瑟菌区别：后者多见成群，常与SEC伴行或粘附 于其他上呼吸道正常菌群之上 与不动杆菌区别：后者窄面相对，两种菌患者来源不同，不 动杆菌仅见于免疫力极低的住院患者与不动杆菌区别：后者窄面相对，两种菌患者来源不同，不 动杆菌仅见于免疫力极低的住院患者 易染成革兰阳性，应掌握合适的初染及脱色时间易染成革兰阳性，应掌握合适的初染及脱色时间4 4、葡萄球菌：肝脓肿标本、葡萄球菌：肝脓肿标本、葡萄球菌：肝脓肿标本、葡萄球菌：肝脓肿标本 革兰染色阳性，呈葡萄状、成双或短链状 排列，标本涂片中常可见吞噬现象革兰染色阳性，呈葡萄状、成双或短链状 排列，标本涂片中常可见吞噬现象 可致全身各部位、各器官感染可致全身各部位、各器官感染痰液标本痰液标本痰液标本痰液标本糖尿病足分泌物：金葡菌糖尿病足分泌物：金葡菌糖尿病足分泌物：金葡菌糖尿病足分泌物：金葡菌5 5 5 5、产生物被膜型铜绿假单胞菌、产生物被膜型铜绿假单胞菌、产生物被膜型铜绿假单胞菌、产生物被膜型铜绿假单胞菌 菌体及生物膜均呈革兰阴性，菌体颜色较深，成团 或腊肠状，不被WBC吞噬菌体及生物膜均呈革兰阴性，菌体颜色较深，成团 或腊肠状，不被WBC吞噬 呼吸道生物被膜病患者痰液标本最为常见呼吸道生物被膜病患者痰液标本最为常见 不同分离株生物膜厚薄不一，生物膜着色深浅不一不同分离株生物膜厚薄不一，生物膜着色深浅不一呼吸道生物被膜病（呼吸道生物被膜病（呼吸道生物被膜病（呼吸道生物被膜病（bacterial bacterial bacterial bacterial biofilmbiofilmbiofilm biofilm disease,BBDdisease,BBDdisease,BBDdisease,BBD)呼吸道生物被膜病常见于呼吸道慢性感染，支扩、COPD、囊性纤维化 患者最为多见。呼吸道生物被膜病常见于呼吸道慢性感染，支扩、COPD、囊性纤维化 患者最为多见。患者症状不重，但体征明显，胸片多无浸润性改变，仅示肺纹理增粗患者症状不重，但体征明显，胸片多无浸润性改变，仅示肺纹理增粗 生物被膜的形成：为细菌适应恶劣环境而采用的一种生长方式，细菌 黏附于病变组织后，通过分泌藻酸盐多糖蛋白复合物将自身包裹其中 而形成。生物被膜的形成：为细菌适应恶劣环境而采用的一种生长方式，细菌 黏附于病变组织后，通过分泌藻酸盐多糖蛋白复合物将自身包裹其中 而形成。生物被膜主要由三种成分组成：藻酸盐（基质成分）、菌体、水通道（营养物质和代谢产物流动）。生物被膜主要由三种成分组成：藻酸盐（基质成分）、菌体、水通道（营养物质和代谢产物流动）。形成生物被膜的细菌以两种形式存在：1、表层浮游菌（planktonic cells),容易获取营养和氧，菌体较大，生长繁殖快，易被抗生素清 除；2、深层座生菌（sessil cells），缺乏营养和氧，生长缓慢，菌 体小，有些甚至处于休眠状态，抗生素难以清除。这两种形式并非一 成不变，而是可以相互转化的。形成生物被膜的细菌以两种形式存在：1、表层浮游菌（planktonic cells),容易获取营养和氧，菌体较大，生长繁殖快，易被抗生素清 除；2、深层座生菌（sessil cells），缺乏营养和氧，生长缓慢，菌 体小，有些甚至处于休眠状态，抗生素难以清除。这两种形式并非一 成不变，而是可以相互转化的。浮游菌座生菌浮游菌座生菌1座生菌座生菌2座生菌座生菌浮游菌被WBC吞噬浮游菌被WBC吞噬呼吸道生物被膜病（呼吸道生物被膜病（bacterial bacterial biofilmbiofilm disease,BBDdisease,BBD)生物被膜菌（座生菌）可能的耐药机制：1、藻酸盐屏障使抗生 素难以渗透，停用抗生素后，座生菌游离，感染复发；2、多数 抗生素仅作用于生长期细菌，对休眠菌无效，因此无论如何均 有一部分细菌得以存活；3、藻酸盐可阻断中性粒细胞钙通道，致使其无法表达趋化相关的受体，吞噬作用减弱，从而使细菌 逃避免疫攻击；4、形成被膜后，细菌可以有足够的时间激活一 些抗生素灭活酶的表达，进一步减少抗生素的渗透。生物被膜病的治疗：难点并非杀菌，而是如何破坏藻酸盐屏障 和抑制其形成。研究已经证实，十四、十五元环的大环内酯类 药物可以破坏藻酸盐结构并抑制其形成，大大提高了氟喹诺酮 类药物的渗透浓度，因此两者联用对于治疗生物被膜病具有较 好的疗效。实验室在发培养报告时，应注明菌株为产生物被膜型，这对于 临床选择治疗方案至关重要！6 6 6 6、不动杆菌、不动杆菌、不动杆菌、不动杆菌 革兰阴性球杆菌，窄面相对，可见吞噬现象革兰阴性球杆菌，窄面相对，可见吞噬现象 医院环境常见，毒力极低下，定植能力及耐药性极 强，对外界理化因素抵抗力极强，常见于免疫力极 低患者如医院环境常见，毒力极低下，定植能力及耐药性极 强，对外界理化因素抵抗力极强，常见于免疫力极 低患者如ICUICU、移植术后、肿瘤患者放化疗后等、移植术后、肿瘤患者放化疗后等 呼吸道标本、呼吸道标本、伤口分泌物、血液等伤口分泌物、血液等 易染成革兰阳性，注意染色条件易染成革兰阳性，注意染色条件痰液标本痰液标本痰液标本痰液标本吞噬伴行吞噬伴行上呼吸道标本：大量不动及曲霉菌菌丝上呼吸道标本：大量不动及曲霉菌菌丝上呼吸道标本：大量不动及曲霉菌菌丝上呼吸道标本：大量不动及曲霉菌菌丝痰液标本：粘液型不动杆菌，菌体变大痰液标本：粘液型不动杆菌，菌体变大痰液标本：粘液型不动杆菌，菌体变大痰液标本：粘液型不动杆菌，菌体变大常在患者治疗过程中出现！常在患者治疗过程中出现！7 7 7 7、酵母样真菌（念珠菌）、酵母样真菌（念珠菌）、酵母样真菌（念珠菌）、酵母样真菌（念珠菌）上呼吸道、生殖道、消化道常见的正常寄生菌上呼吸道、生殖道、消化道常见的正常寄生菌 涂片大量出现或见出芽现象有意义，但必须结合标 本来源部位和患者临床表现确定涂片大量出现或见出芽现象有意义，但必须结合标 本来源部位和患者临床表现确定 革兰染色呈阳性，椭圆形，可见吞噬现象革兰染色呈阳性，椭圆形，可见吞噬现象出芽酵母样菌出芽酵母样菌WBC假菌丝（芽管）假菌丝（芽管）痰液：痰液：痰液：痰液：WBCWBC吞噬念珠菌孢子吞噬念珠菌孢子吞噬念珠菌孢子吞噬念珠菌孢子上呼吸道标本：大量出芽酵母样菌上呼吸道标本：大量出芽酵母样菌上呼吸道标本：大量出芽酵母样菌上呼吸道标本：大量出芽酵母样菌7 7 7 7、酵母样真菌（隐球菌）、酵母样真菌（隐球菌）、酵母样真菌（隐球菌）、酵母样真菌（隐球菌）广泛分布于人口腔、体表及肠道广泛分布于人口腔、体表及肠道 可引起可引起亚急性或慢性脑膜炎亚急性或慢性脑膜炎、肺炎以及皮肤、淋巴结、骨的 慢性炎症、肺炎以及皮肤、淋巴结、骨的 慢性炎症 印度墨汁负染镜检具有较高的敏感性印度墨汁负染镜检具有较高的敏感性注意与红细胞、组织细胞等区别注意与红细胞、组织细胞等区别普通国产墨汁负染普通国产墨汁负染普通国产墨汁负染普通国产墨汁负染印度墨汁负染印度墨汁负染印度墨汁负染印度墨汁负染8 8 8 8、霉菌菌丝、霉菌菌丝、霉菌菌丝、霉菌菌丝 深部真菌感染曲霉菌最为常见深部真菌感染曲霉菌最为常见 合格标本涂片镜检具有价值，但不可作为确诊依据合格标本涂片镜检具有价值，但不可作为确诊依据 粗大、有隔、革兰染色多呈阳性，竹节状或鹿角状粗大、有隔、革兰染色多呈阳性，竹节状或鹿角状 呼吸道感染最常见，多为医院内感染呼吸道感染最常见，多为医院内感染痰液标本痰液标本痰液标本痰液标本气管内吸取物气管内吸取物气管内吸取物气管内吸取物中耳脓肿中耳脓肿中耳脓肿中耳脓肿上呼吸道标本上呼吸道标本上呼吸道标本上呼吸道标本9 9、革兰阳性杆菌：棒杆菌属、革兰阳性杆菌：棒杆菌属、革兰阳性杆菌：棒杆菌属、革兰阳性杆菌：棒杆菌属条件致病菌：住院患者呼吸道标本常见条件致病菌：住院患者呼吸道标本常见痰液标本：棒杆菌属，脱色过度痰液标本：棒杆菌属，脱色过度痰液标本：棒杆菌属，脱色过度痰液标本：棒杆菌属，脱色过度1010、革兰阴性杆菌：医院感染常见、革兰阴性杆菌：医院感染常见、革兰阴性杆菌：医院感染常见、革兰阴性杆菌：医院感染常见痰液：大量WBC伴行大量G-杆菌尿液标本：大量尿液标本：大量WBCWBC，GG-杆菌大量杆菌大量图1：宫颈分泌物涂片低倍镜所见：WBC大量，EPC少图2：WBC吞噬G-杆菌图3：大量G-杆菌与WBC伴行图1图2图3图1图2图31111、淋球菌、淋球菌、淋球菌、淋球菌 引起急性尿道综合征 女性化脓性阴道炎及宫颈炎 化脓性咽炎（性乱人群）新生儿脓瘘眼（产道感染）对男性尿道分泌物而言，若涂片见到胞内G-双球菌，无需培养即可确诊男性尿道分泌物男性尿道分泌物男性尿道分泌物男性尿道分泌物 某男，某男，50岁，皮肤科 门诊患者，急性化脓 性尿道炎就诊，第一 次标本涂片革兰染色（图岁，皮肤科 门诊患者，急性化脓 性尿道炎就诊，第一 次标本涂片革兰染色（图1：低倍镜，图：低倍镜，图2：油镜）：油镜）图2图1 第二次于实验室就 地取材，革兰染色 镜检（图第二次于实验室就 地取材，革兰染色 镜检（图3、图、图4均 为油镜视野）均 为油镜视野）图3图41212、奴卡菌奴卡菌奴卡菌奴卡菌、放线菌、放线菌、放线菌、放线菌 均属放线菌目，奴卡菌为需氧，放线菌为厌氧或 微需氧 细胞壁含少量分枝菌酸，弱抗酸染色阳性 条件致病菌，皮质激素、免疫抑制剂或广谱抗生 素使用，恶性肿瘤、AIDS、移植术后、烧伤等为 易患因素 临床少见，以肺部感染、皮肤感染为主，脑部感 染和全身性播散型感染多源自肺部 星型奴卡菌多见，巴西奴卡菌和豚鼠奴卡菌相对 少弱抗酸染色弱抗酸染色弱抗酸染色弱抗酸染色 试剂 1、无水甲醇 2、50%乙醇 3、石炭酸复红 4、1%硫酸 5、亚甲基兰试剂 1、无水甲醇 2、50%乙醇 3、石炭酸复红 4、1%硫酸 5、亚甲基兰弱抗酸染色弱抗酸染色弱抗酸染色弱抗酸染色操作步骤 1、将1-2滴标本涂于玻片上，自然风干。2、无水甲醇固定1min；3、石炭酸复红充满玻片，染色5min；4、以50%乙醇短暂冲洗玻片，约3-5s；5、然后用蒸馏水彻底冲洗玻片；6、1%硫酸脱色2min，或脱色至玻片上颜色刚刚 脱去；7、用蒸馏水彻底冲洗玻片，吸去多余水分；8、亚甲基兰或孔雀绿复染1min；9、然后用蒸馏水彻底冲洗玻片，风干。痰液标本革兰染色痰液标本革兰染色痰液标本革兰染色痰液标本革兰染色痰液标本：弱抗酸染色痰液标本：弱抗酸染色纯培养涂片弱抗酸染色纯培养涂片弱抗酸染色纯培养涂片弱抗酸染色纯培养涂片弱抗酸染色1313、L L型菌型菌型菌型菌 临床上以G-杆菌形成的L型多见临床上以G-杆菌形成的L型多见 细菌在作用于细胞壁的抗生素（内酰胺类或糖 肽类）作用后，细胞壁部分（不稳定型）或完全 缺失（稳定型），细菌外形改变细菌在作用于细胞壁的抗生素（内酰胺类或糖 肽类）作用后，细胞壁部分（不稳定型）或完全 缺失（稳定型），细菌外形改变“纺锤状纺锤状”、“长丝状长丝状”等等 部分初代普通培养分离即可返祖，多数需高渗糖 培养基反复传代部分初代普通培养分离即可返祖，多数需高渗糖 培养基反复传代 提示临床，用药有效，但需联合用药提示临床，用药有效，但需联合用药血培养瓶中不动杆血培养瓶中不动杆血培养瓶中不动杆 血培养瓶中不动杆 菌不稳定菌不稳定菌不稳定菌不稳定L L型型型型返祖后菌落涂片返祖后菌落涂片返祖后菌落涂片返祖后菌落涂片痰标本：肺炎克雷伯菌不稳定痰标本：肺炎克雷伯菌不稳定L L型型1414、链球菌、链球菌、链球菌、链球菌 草绿色链球菌为感染性心内膜炎的主要病原体 A群链球菌（化脓链）可致咽峡炎、扁桃体炎、皮肤粘膜浅表脓肿、术后伤口化脓感染 B群链球菌（无乳链球菌）可致围生期孕产妇 感染，新生儿感染血培养：链球菌血培养：链球菌血培养：链球菌血培养：链球菌胸水：星座链球菌胸水：星座链球菌胸水：星座链球菌胸水：星座链球菌标本中非病原性有形物的辨认标本中非病原性有形物的辨认标本中非病原性有形物的辨认标本中非病原性有形物的辨认在标本采集过程中，有时不可避免的混入非病原 性有形物。如痰和粪便标本中的花粉、菌类孢子及 食源性微生物（乳制品中的乳杆菌和短杆菌，发酵 食品中的真菌孢子等）。有时因留取标本不当，在 液体标本中污染有水生原虫。也有将染色后的精子 误当真菌孢子报告（如尿液或阴道分泌分标本）。这些有形物有时会被误诊为病原性微生物。食用乳制品后未漱口食用乳制品后未漱口食用乳制品后未漱口食用乳制品后未漱口纤刷片或痰液标本1、避免假阳性2、补充或修正不完整阳性结果3、避免假阴性（三）解释、补充或修正培养结果（三）解释、补充或修正培养结果1 1、假阳性（产生原因）、假阳性（产生原因）、假阳性（产生原因）、假阳性（产生原因）易受有菌部位分泌物污染的标本（多见）易受有菌部位分泌物污染的标本（多见）1）培养前经验用药：削弱或消除定植抗力（杀灭正 常菌群），环境菌株（高耐）定植，有菌部位菌 群紊乱）培养前经验用药：削弱或消除定植抗力（杀灭正 常菌群），环境菌株（高耐）定植，有菌部位菌 群紊乱2）标本留取不合格：有菌部位分泌物污染）标本留取不合格：有菌部位分泌物污染3）常见类型：）常见类型：咳痰、中段尿、伤口分泌物咳痰、中段尿、伤口分泌物 无菌体液（相对少见）无菌体液（相对少见）1）临床标本留取操作不慎）临床标本留取操作不慎2）实验室操作不当）实验室操作不当3）标本类型：血液、胸腹水、脑脊液、心包积液等）标本类型：血液、胸腹水、脑脊液、心包积液等假阳性假阳性假阳性假阳性咳痰标本咳痰标本咳痰标本咳痰标本 涂片：示标本来自上呼吸道（标本不合格），涂片：示标本来自上呼吸道（标本不合格），WBC：SEC1：2.5 培养：培养：1、生长非上呼吸道正常菌群，包括各种常见阴性 杆菌（绿脓、不动、肺杆、大肠）、阳性球菌（葡萄球菌、肠球菌）、念珠菌等、生长非上呼吸道正常菌群，包括各种常见阴性 杆菌（绿脓、不动、肺杆、大肠）、阳性球菌（葡萄球菌、肠球菌）、念珠菌等2、伴或不伴上呼吸道菌群生长、伴或不伴上呼吸道菌群生长3、生长数量从数个至大量（三区）不等、生长数量从数个至大量（三区）不等低倍镜油 镜低倍镜油 镜培养培养例1：咳痰标本涂片及培养结果几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性图1图2图3图1：涂片镜检标本来自上呼吸道G-球杆菌大量图2、3：培养纯生长大量不动杆菌几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性上呼吸道标本：大量形态一致G-杆菌培养：纯生长大量铜绿假单胞菌几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性例2：生长少量金葡、绿脓、肺杆金葡绿脓肺杆几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性例3：生长大量甲链、少量不动甲链不动几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性几种生长模式：假阳性金葡甲链假阳性假阳性假阳性假阳性中段尿标本中段尿标本中段尿标本中段尿标本 尿沉渣涂片：未见尿沉渣涂片：未见WBC，仅见大量细菌，或单一，或混合菌丛，仅见大量细菌，或单一，或混合菌丛 培养：生长大量与涂片一致细菌培养：生长大量与涂片一致细菌 这种情况临床最为常见，多为标本留取不合 格所致这种情况临床最为常见，多为标本留取不合 格所致 涂片见大量G+球菌，及少量出芽酵母样菌 培养：生长10万以上/ml粪肠球菌 原因：标本自导尿袋留取 涂片仅见大量形态一致涂片仅见大量形态一致G-杆 菌，未见杆 菌，未见WBC 生长生长10万以上万以上/ml大肠埃希菌大肠埃希菌 常见原因：标本放置时间过长常见原因：标本放置时间过长例3例3 涂片：未见WBC，见少量或大量SEC，伴数量不等，形态 或单一或混合菌丛涂片：未见WBC，见少量或大量SEC，伴数量不等，形态 或单一或混合菌丛 培养：生长大量相应细菌培养：生长大量相应细菌 原因：生殖道分泌物、尿道前段污染原因：生殖道分泌物、尿道前段污染假阳性假阳性假阳性假阳性伤口分泌物伤口分泌物伤口分泌物伤口分泌物 与取材有关与取材有关1、不合格：不合格：浅表分泌物，直接涂片镜下未见 浅表分泌物，直接涂片镜下未见 WBC，仅见坏死组织，多用拭子，仅见坏死组织，多用拭子2、合格：深层脓液（带血更好），最好注射 器抽取或无菌生理盐水去除表层分泌物后拭 子沾取、合格：深层脓液（带血更好），最好注射 器抽取或无菌生理盐水去除表层分泌物后拭 子沾取 菌群特点菌群特点1、腐生菌腐生菌：多呈混合存在：多呈混合存在2、感染菌：多为单一菌，化脓性细菌常见，如金葡、化脓链、绿脓等、感染菌：多为单一菌，化脓性细菌常见，如金葡、化脓链、绿脓等2 2、不完整的阳性结果、不完整的阳性结果、不完整的阳性结果、不完整的阳性结果 常见标本类型常见标本类型1、深部脓肿：肺脓肿、腹腔或盆腔脓肿、深部脓肿：肺脓肿、腹腔或盆腔脓肿2、外科手术感染：普外科术后伤口感染最为 常见，其次为妇科术后、外科手术感染：普外科术后伤口感染最为 常见，其次为妇科术后 原因：原因：1、来源于、来源于同一生境的菌丛同一生境的菌丛混合感染混合感染2、普通培养条件无法满足所有感染原因菌、普通培养条件无法满足所有感染原因菌例例1 1：普外患者伤口脓液：涂片中究竟有几种菌？：普外患者伤口脓液：涂片中究竟有几种菌？腹腔脓液：腹部脓肿或继发性细菌性腹膜炎腹腔脓液：腹部脓肿或继发性细菌性腹膜炎肺脓肿，支气管肺泡灌洗液（肺脓肿，支气管肺泡灌洗液（BALFBALF）问题：问题：问题：问题：此类情况微生物报告如何发？此类情况微生物报告如何发？此类情况微生物报告如何发？此类情况微生物报告如何发？尤其是混合生长时尤其是混合生长时 挑取优势菌分纯做药敏？挑取优势菌分纯做药敏？所有生长的菌皆分纯做药敏？所有生长的菌皆分纯做药敏？不做药敏，仅描述涂片和培养生长情况？不做药敏，仅描述涂片和培养生长情况？3 3、假阴性（原因）、假阴性（原因）、假阴性（原因）、假阴性（原因）培养前抗生素的使用，病原菌被杀灭培养前抗生素的使用，病原菌被杀灭 标本污染导致病原菌生长受正常菌群干扰标本污染导致病原菌生长受正常菌群干扰 慢生长细菌、苛养菌等慢生长细菌、苛养菌等 其它病原体：普通培养和涂片革蓝染色均不能 覆盖其它病原体：普通培养和涂片革蓝染色均不能 覆盖咳痰标本：阴性杆菌被标本中抗生素抑制咳痰标本：阴性杆菌被标本中抗生素抑制抑制区抑制区抑制区抑制区培养前抗生素使用的证据粪便标本粪便标本抑制区抑制区抑制区抑制区培养前抗生素使用的证据 本实验室对同一天接受的咳痰标本中抗生素的定性检测结果！本实验室对同一天接受的咳痰标本中抗生素的定性检测结果！用用ATCC25922大肠埃希菌制备大肠埃希菌制备0.5麦氏单位浊度菌悬液，棉签涂抹麦氏单位浊度菌悬液，棉签涂抹M-H平 板平 板 无菌滤纸片于标本中浸透，贴在平板上，无菌滤纸片于标本中浸透，贴在平板上，35C 24h孵育孵育 出现抑菌环即说明该份标本含抗生素！出现抑菌环即说明该份标本含抗生素！培养前抗生素使用的证据假阴性：假阴性：假阴性：假阴性：经验用药有效经验用药有效经验用药有效经验用药有效 标本合格标本合格 镜检可见明显吞噬、伴行或包裹现象镜检可见明显吞噬、伴行或包裹现象 培养目标菌不生长或未见优势生长培养目标菌不生长或未见优势生长 例1：肖，女，64岁，患者于09年12月13日始咳 嗽、咳脓痰，气短、喘息加重，并伴发热，于15日以 AECOPD收入我院呼吸科，除COPD外既往有高血压病史。入院前未使用任何抗生素 入院当日下午给予头孢哌酮/他唑巴坦(2.0g Q8h)并医嘱留痰培养 16日送检痰培养2次，清晨痰（编号200912787），下 午痰（编号200912812）200912787200912787号标本涂片及培养所见号标本涂片及培养所见 涂片示大量WBC伴行大量G+形似肺炎链球菌细菌（100cfu/op）培养仅生长少量肺炎链球菌（菌落形态不典型）及非致病奈瑟菌 血平板上标本涂布原始区见明显抑制肺炎链球菌生长现象肺链生长抑制区肺链生长抑制区200912787200912787号体外药敏及号体外药敏及号体外药敏及号体外药敏及optochinoptochin抑制试验抑制试验抑制试验抑制试验Optochin纸片抑菌环直径20mmOX纸片抑菌环直径20mm,此菌为PSSP200912812200912812号标本涂片及培养情况号标本涂片及培养情况号标本涂片及培养情况号标本涂片及培养情况 涂片同200912782号涂片同200912782号 培养仅生长少量奈瑟菌，肺炎链球菌未见生长培养仅生长少量奈瑟菌，肺炎链球菌未见生长非致病奈瑟菌非致病奈瑟菌肺链 例2 男性患者，78岁，COPD病史数年，近期曾因急性加 重住院，临床予泰能（静滴）+莫西沙星（口服）治 疗，疗程不详，痊愈出院。出院半月后因受寒出现急 性症状，咳嗽，咳大量黄脓痰，不发热，未做血常规 及影像学检查，一般情况尚可，未住院。家属反映此 前半月内未使用任何抗生素 送检即刻咳痰标本痰液涂片所见痰液涂片所见痰液涂片所见痰液涂片所见 外观黄脓痰，镜检大量外观黄脓痰，镜检大量WBC未见未见SEC，标本合格，标本合格 WBC吞噬和伴行大量吞噬和伴行大量G-双球菌，肾形排列双球菌，肾形排列 分析：分析：1、涂片所见菌常见为卡他或不动、涂片所见菌常见为卡他或不动2、患者为社区获得性感染，不动杆菌可能性不大、患者为社区获得性感染，不动杆菌可能性不大3、患者症状不重，符合卡他引起局限性感染的临 床表现、患者症状不重，符合卡他引起局限性感染的临 床表现 结论：可能为卡他莫拉菌感染，建议口服阿莫西 林结论：可能为卡他莫拉菌感染，建议口服阿莫西 林/克拉维酸钾克拉维酸钾 第二天培养结果：四区划线仅第一区生长少 量卡他莫拉菌第二天培养结果：四区划线仅第一区生长少 量卡他莫拉菌 培养结果与涂片结果明显不符（数量）培养结果与涂片结果明显不符（数量）仔细询问家属：送检前一天晚上曾口服阿莫 西林仔细询问家属：送检前一天晚上曾口服阿莫 西林/克拉维酸钾克拉维酸钾中段尿（假阴性）中段尿（假阴性）中段尿（假阴性）中段尿（假阴性）尿沉渣涂片：大量尿沉渣涂片：大量WBC伴行大量形态单一细菌伴行大量形态单一细菌 培养：培养：1、未生长真菌；、未生长真菌；2、生长少量菌落，菌落计数达不到诊断 标准、生长少量菌落，菌落计数达不到诊断 标准 原因：培养前抗生素使用原因：培养前抗生素使用仅生长数个溶血性大肠埃希菌菌落 上述经验用药所致的假阴性为特殊例子上述经验用药所致的假阴性为特殊例子 实际工作中最为多见的情况：实际工作中最为多见的情况：1、标本合格：可见大量、标本合格：可见大量WBC，未见或少见其 它污染细胞，未见细菌和真菌，未见或少见其 它污染细胞，未见细菌和真菌2、培养：不生长细菌或仅生长少量正常菌群、培养：不生长细菌或仅生长少量正常菌群3、患者症状或体征有所缓解、患者症状或体征有所缓解假阴性假阴性假阴性假阴性标本污染正常菌群标本污染正常菌群 咳痰标本常见咳痰标本常见 极易漏检而致假阴性极易漏检而致假阴性 涂片镜检是防止漏检的有效手段涂片镜检是防止漏检的有效手段奈瑟菌甲链1：小菌落甲链 2：大菌落一份咳痰标本培养生长情况直接涂片镜检情况直接涂片镜检情况合格低倍镜视野合格油镜视野不合格低倍镜视野不合格油镜视野血平板中甲链大菌落为肺双血平板中甲链大菌落为肺双血平板中甲链大菌落为肺双血平板中甲链大菌落为肺双假阴性假阴性假阴性假阴性慢生长细菌或苛养菌慢生长细菌或苛养菌慢生长细菌或苛养菌慢生长细菌或苛养菌 慢生长细菌：慢生长细菌：粘液绿脓粘液绿脓、奴卡菌等、奴卡菌等 苛养菌：苛养菌：HAECK菌群等菌群等 24h生长不良或不生长，易漏检致假阴性生长不良或不生长，易漏检致假阴性假阴性假阴性假阴性假阴性其它病原体感染其它病原体感染 标本涂片合格，但未见细菌及真菌标本涂片合格，但未见细菌及真菌 患者取材前患者取材前未用药或用药无效未用药或用药无效 培养未生长细菌或仅生长少量正常菌群培养未生长细菌或仅生长少量正常菌群 可能的病原体：可能的病原体：结核、支原体结核、支原体、衣原体、军团菌等、衣原体、军团菌等腋窝下脓肿：腋窝下脓肿：1 1、病程、病程2 2月，无症状及体月，无症状及体 征，近日因增大就诊，之征，近日因增大就诊，之 前未曾治疗前未曾治疗 2 2、穿刺细胞学：以中性粒、穿刺细胞学：以中性粒 细胞为主，未见类上皮样细胞为主，未见类上皮样 细胞群和朗罕氏巨细胞细胞群和朗罕氏巨细胞 3 3、革蓝染色：未见细菌，、革蓝染色：未见细菌，未见真菌未见真菌 4 4、抗酸染色：、抗酸染色：+以上抗以上抗 酸菌酸菌 5 5、结论：结核感染所致冷、结论：结核感染所致冷 脓肿脓肿 近年来结核病发病率呈上升趋势，肺外结核 所占比例越来越高近年来结核病发病率呈上升趋势，肺外结核 所占比例越来越高 症状体征不典型或不明显，临床易漏诊症状体征不典型或不明显，临床易漏诊 疑似结核标本（痰、尿、脓肿、淋巴结穿刺 吸取物等）革蓝染色镜下特点：疑似结核标本（痰、尿、脓肿、淋巴结穿刺 吸取物等）革蓝染色镜下特点：1、背景、背景“脏脏”：陈旧性坏死灶：陈旧性坏死灶2、标本合格，细胞数目少，单个核细胞常见、标本合格，细胞数目少，单个核细胞常见3、未见细菌、真菌，或仅见少量正常菌群、未见细菌、真菌，或仅见少量正常菌群4、部分标本可见折光性强、不着色、部分标本可见折光性强、不着色“杆状物杆状物”革兰染片中的革兰染片中的“杆状物杆状物”就是抗酸菌就是抗酸菌 例：患者XXX，女性，50余岁，因尿路刺激症状就诊 于本市一家三甲医院，行尿常规检查及培养，常规示 WBC+，培养未生长细菌。临床予罗红霉素口服，剂 量不详，数日症状无缓解，临床怀疑“L”型菌，推荐患 者至我院检查 分析：1、经询问患者曾有反复尿路感染病史，标本留 取规范，且常规亦为中段尿检测结果，因此尿RT示 WBC+说明尿路感染成立；2、L型菌不可能；3、可能 为其他病原体感染 建议：再次留取清洁中段尿：1、普通培养；2、支原体 培养、衣原体检测；3、尿沉渣涂片革蓝染色、抗酸染 色；4、经验用药可先口服喹诺酮类抗生素。结果：解脲脲原体培养阳性！中段尿沉渣抗酸染色中段尿沉渣抗酸染色中段尿沉渣抗酸染色中段尿沉渣抗酸染色 适用于无菌部位的体液标本如中段尿、脑脊液、胸腹水、关节腔积液、深部脓液等适用于无菌部位的体液标本如中段尿、脑脊液、胸腹水、关节腔积液、深部脓液等 适用于可疑生长细菌的血培养适用于可疑生长细菌的血培养 药敏结果仅供参考，不可取代正式报告药敏结果仅供参考，不可取代正式报告（四）指导快速药敏（四）指导快速药敏液体标本5ml（胸腹水、脑脊液等）液体标本5ml（胸腹水、脑脊液等）血培养瓶，取2.5ml,加等 量无菌蒸馏水，混匀血培养瓶，取2.5ml,加等 量无菌蒸馏水，混匀弃上清，留约0.5ml沉渣涂 片染色镜检弃上清，留约0.5ml沉渣涂 片染色镜检K-B法药敏K-B法药敏脓液3000rpm 离心直接涂片染色镜检镜检：1、标本合格；2、镜下细菌形态单一，且数量大，大于100cfu/OP脓痰标本直接药敏脓痰标本直接药敏脓痰标本直接药敏脓痰标本直接药敏四、标本直接涂片的局限四、标本直接涂片的局限四、标本直接涂片的局限四、标本直接涂片的局限 敏感性低敏感性低 不可取代培养鉴定及药敏不可取代培养鉴定及药敏 技术难度相对大，感性认识要求高技术难度相对大，感性认识要求高 初学者需循序渐进，充分积累感性认识经验初学者需循序渐进，充分积累感性认识经验谢谢谢 谢 谢！谢！谢！谢！