富钙微环境对牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响.pdf

:./.论著富钙微环境对牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响齐芳芳 李雅 郝君玲 张立亚 谷希 马文盛 李颖辉项目来源:河北 省医学 科学研 究 课 题 计 划(编 号:)河北省教育厅高等学校科学研究计划(编号:)作者单位:石家庄市河北医科大学口腔医院牙体牙髓科(齐芳芳、郝君玲、张立亚、谷希)牙周科(李雅)口腔正畸科(马文盛、李颖辉)河北省口腔医学重点实验室(齐芳、李雅、郝君玲、张立亚、谷希、马文盛、李颖辉)通讯作者:李颖辉:.【摘要】目的 探讨含有不同浓度钙离子()的培养基对人牙周膜干细胞()增殖与迁移能力的影响 方法 用含 /、/、/、/钙离子的完全培养基干预第 代 其中 组作为对照组通过 法、法及划痕实验分别于相应时间点检测其克隆形成能力、细胞增殖能力及细胞迁移能力并将各组间结果进行对比 结果在含钙离子培养基中与对照组对比 克隆形成能力、细胞增殖能力、细胞迁移能力均显示不同程度的增加 结果显示 /、/、/钙离子组的克隆形成能力明显优于对照组(.)检测结果显示自第 天开始含钙离子组 的增殖能力优于对照组(.)第 天、天时/、/组的增殖能力优于对照组及/组(.)划痕实验结果显示 /、/钙离子组的迁移能力优于对照组(.)在钙离子浓度增至 /时其迁移能力显著下降低于 /、/、/组(.)结论在体外实验中含一定浓度钙离子培养基可促进 的增殖与迁移能力【关键词】牙周膜干细胞钙离子增殖迁移【中图分类号】.【文献标识码】【文章编号】().【】()./()/./(.).(.)/(.)./(.)/.【】近年来应用间充质干细胞进行组织工程和器官再生的研究越来越受到重视而牙齿来源的干细胞由于来源丰富、采集方便、免疫原性低等优点一直是组织工程和细胞治疗良好的种子细胞 人牙周膜干细胞()由 等于 年首次从健康成年人牙周组织中成功分离其具有与骨髓和牙髓间充质干细胞类似的生物学特性是目前牙周疾病的治疗及牙周组织再生最具潜力的种子细胞在牙体种植、牙周病的治疗及加速正畸牙齿移动等领域有着广泛的应用前景现代组织工程学再生理论认为:种子细胞的来源、数量的多少和生物学特性都会直接影响其应用效果而细胞培养时所处的局部微环境也对其生物学功能的发挥起着重要的调控作用 钙信号作为重要的第二信使可调控细胞内多种重要的生理过程并且在多种疾病的发生发展过程中都发挥重要的作用 另外钙离子通道阻滞剂越来越多地用于治疗高血压然而服用钙通道阻滞剂后会发生牙龈组织增生及牙周改变 本研究通过研究钙离子在 增殖分化过程中的作用为 在组织工程中的应用提供依据河北医药 年 月 第 卷 第 期 材料与方法.主要试剂与仪器 培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗、.胰酶细胞消化液购自美国 公 司、流式抗体购自美国 公司购自美国 公司结晶紫购自上海阿拉丁公司 购自上海碧云天公司智能流式细胞仪购自美国 公司多功能酶标仪购自美国 公司.培养 取得患者及家长同意选择临床上 岁因正畸需要拔除的牙体牙周均健康的第一或第二前磨牙作为 的来源牙齿拔出后立即保 存 于 含 倍 双 抗(/的 和/的)的 培养基中置于冰盒内尽快带回实验室 用含 倍双抗的 溶液自根尖向冠部反复冲洗直至牙根表面不再有肉眼可见的颗粒用无菌锋利的手术刀片于冠根位置单向刮取根中三分之一的牙周膜组织接种于 培养瓶中加入完全培养基(含、谷氨酰胺的 培养液)在、饱和湿度条件下培养 原代培养至细胞汇合达 时胰酶消化、离心培养基重悬细胞并计数调整细胞密度为 个/以 /孔的用量种于 孔板倒置显微镜下挑选只有单细胞的孔标记补加液 后收集呈克隆生长的细胞扩增培养标记为 代细胞.鉴定取第 代 生长至 时进行消化离心、重悬计数并调整细胞密度为 个/孔采用流式细胞术检测 的免疫表型包含 个阳性标记物:、和 以及、个阴性标记物.含钙离子培养液的制备 在含、胎牛血清的 培养基中加入不同浓度 调整钙离子终浓度为 /、/、/、/.克隆形成率()检测第 代 在含钙离子终浓度为 /、/、/、/的培养基中调整至细胞密度 /吹打混匀 接种于 培养皿 内不换液不观察防止影响细胞贴壁之后每 天换液待克隆长至 时 冲洗 次中性甲醛固定结晶紫染色倒置显微镜下观察 细胞数 个的集落记为 个克隆 培养皿扫描后人工计数克隆数重复 次取均值计数以形成的克隆个数计算克隆形成率 克隆形成率(克隆数/接种细胞数).细胞增殖能力的检测 取第 代 进行消化、计数以/的密度接种于 孔板中每孔 依实验设计分别用含钙离子终浓度为/、/、/、/的培养液培养 每组设 个重复孔 培养结束后每孔加入 溶液、体积分数为 条件下继续孵育 弃上清后再向各孔加入 二甲基亚砜振荡 采用酶联免疫监测仪在 波长处测定各孔吸光度值.细胞迁移能力检测取第 代 以每孔的细胞量接种至 组 孔板每孔加入 完全培养基置于、培养箱中培养组均每 天换液 次 待细胞长满后加入无血清 饥饿 用 枪头做一划痕去除原培养基加入 含钙离子终浓度为 /、/、/、/的培养液培养 后倒置显微镜下观察划痕愈合情况 将所得图像采用迁移面积法进行分析迁移面积(空白面积 空白面积)/空白面积进行比较不同浓度钙离子与阴性对照组迁移面积的大小 结果.原代细胞的分离、培养和鉴定 采用组织块法成功培养出牙周膜原代细胞镜下观察细胞呈长梭形胞核居中细胞生长到一定密度时呈漩涡状成团生长符合 的形态学及增殖特征 通过流式细胞术进行检测培养获得细胞的间充质干细胞表面标记物(.)、(.)、(.)、(.)阳性表达造血干细胞标记物(.)、(.)阴性表达符合 的免疫表型 见图 图 表面标记物流式细胞术检测结果河北医药 年 月 第 卷 第 期 .克隆形成率检测克隆培养 后可见明显的细胞集落形成(细胞数)培养初期细胞增殖较为缓慢倍增时间较长细胞聚集后增殖速度明显加快第 天时克隆形成率为.(/组).(/组)/范围内随着钙离子浓度增加其克隆形成率呈降低趋势但组间比较结果显示 /、/、/组克隆形成率明显高于 /组(.)见表 图 表 组 克隆形成率比较 类别克隆形成率/./././.注:与 /比较图 克隆形成实验大体观察.)第 天时含钙离子组的吸光度值均高于对照组(.)提示钙离子组的细胞增殖速度加快培养第 天、天时/、/组的吸光度值高于 /和 /(.)见表 表 检测 组 增殖情况 类别 /./././.注:与 /比较.与 /比较.与 /比较.细胞迁移能力检测划痕实验结果显示经过 培养含钙离子组细胞迁移能力与增殖能力表现趋势相似/、/组的划痕愈合面积明显高于 /组差异有统计学意义(.)钙离子浓度增加至 /时其迁移能力明显降低与 /、/、/组比较差异有统计学意义(.)见图 表 图 划痕 后愈合情况表 划痕 后愈合结果 类别划痕愈合/./././.注:与 /比较.与 /比较.与 /比较.讨论 牙周炎不但会造成牙周膜的破坏及牙槽骨的丧失长时间的牙周炎症也会直接或间接危害全身健康 牙周炎的理想治疗结果为获得牙周支持组织包括牙槽骨、牙周膜和牙龈组织的再生 是从牙周组织中分离培养而形成的成体干细胞具有多向分化潜能 基于其高度的组织同源性被认为是牙周组织再生修复的重要种子细胞 临床获得的 主要来自于拔除的第三磨牙及正畸牙前期研究发现 在增殖、分化的过程中受到多种因 素 例 如 细 胞 因 子、生 长 因 子 信 号 通 路 的 调控细胞的生长状态将直接影响其应用效果 钙离子对于维持细胞膜两侧生理电位、细胞膜内外的离子交换以及细胞间的信号转导等方面发挥重要作用 细胞内的钙离子约 存储于内质网与线粒体胞质内引起胞外钙的内流或细胞内钙库的钙释放使胞质内钙离子浓度急剧升高此时细胞质膜及钙库膜上的钙泵将立即启动将多余的钙离子运送至内质网或细胞外并产生响应信号影响细胞代谢过程从而影响细胞生理状态 本实验结果显示含钙培养基中 克隆形成数量显著增加在钙离子浓度为 /时克隆形成数量最大/、/组克隆形成数量虽有下降趋势但与 /组对比无统计学差异河北医药 年 月 第 卷 第 期 提示钙离子对 的增殖有一定促进作用 细胞增殖能力检测结果与迁移能力测试结果均显示其影响趋势与 结果相似在培养基钙离子浓度为/时对细胞的促进作用最为明显之后随钙离子浓度的增加其促进作用逐渐降低 等的研究结果显示当接收到正确的信号时 细胞就会开启外膜通道促进钙离子涌入细胞激活蛋白 的表达作为一种特殊的转录因子 能够开启基因表达特殊类型的钙离子流入操纵性钙内流()能够控制 蛋白的激活以及其开启控制葡萄糖摄取和破碎的能力增强细胞的能量代谢从而增加细胞增殖能力 另一项的研究提示线粒体可主动或被动地开启线粒体内膜的钙离子单向转运通道以摄取钙离子此过程是维持细胞正常供能的必要过程 以上研究都显示在维持细胞的正常代谢及增殖分化过程中胞质内及细胞器内的钙离子都是一个不可或缺的重要角色 在钙离子作用下 的增殖与迁移能力都有显著提高并且在一定范围内随着钙离子浓度增加其增殖与迁移能力相应增加这由于细胞外钙离子浓度增加后触动细胞膜的钙离子转运通道钙内流使得胞内钙离子浓度增加并进一步启动相关酶与蛋白增强相应细胞器功能使细胞激活从而加速其增殖与分化能力 但是本实验结果亦显示随着钙离子浓度增加至临界浓度时其增强细胞的增殖、迁移能力开始减弱提示其对于细胞的促进有一个最适浓度高于或低于最适浓度都将影响细胞功能的发挥 综上所述在细胞培养过程中根据实验目的在培养基内添加各种组分以提高细胞活性可达到更好的实验目的在 的临床应用及组织工程的研究中在培养基内适当添加钙离子有助于提高细胞的增殖及迁移能力参考文献 .:.():.():.():.?.:.:.:.:.:.:.肖云萍 解宇浩 张嘉琪等.基于钙激活氯离子通道检测胞质内第二信使.解剖学报():./().():.():.:.():.:.():.李晓钰 王红 谷秀格等.年龄因素对牙周膜干细胞多向分化能力的影响.口腔生物医学():.张淑香 陈彦田 齐念民.葡萄糖和谷氨酰胺浓度对人脐带间充质干细胞体外培养的影响.组织工程与重建外科杂志():.():.:.():.:.:.:.:.().():.:?.():.():.:.():./.():.(收稿日期:)河北医药 年 月 第 卷 第 期