CaMKII信号转导通路在慢性痛外周和中枢感受中的作用.pdf

http:/-1-CaMKII 信号转导通路在慢性痛外周和中枢感受中的作用信号转导通路在慢性痛外周和中枢感受中的作用 张楠1，卜祥宁1，方力2*，李俊发1 1.首都医科大学神经生物学系，北京（100069）2.Department of Surgery，The University of Texas Medical Branch，301 University Blvd.，Galveston，USA E-mail： 摘摘 要：要：在外周和中枢神经系统中，疼痛刺激引发的反应主要是通过多条胞内 Ca2+相关信号通路的激活介导的。Ca2+/钙调蛋白(CaM)依赖的蛋白激酶 II(CaMKII)在兴奋性突触传递的调节过程中发挥着重要作用。然而，到目前为止，对 CaMKII 在感觉传导系统疼痛信号处理中的作用还没有详细的论述。近年，人们利用多种急慢性痛实验动物模型，应用电生理学、药理学、行为学，以及分子生物学等多种技术方法获得了大量新的证据。这些证据表明，CaMKII 在外周和中枢感觉神经元伤害感受性信号处理中具有重要的作用。本综述概括了CaMKII 信号通路在外周和中枢敏化过程中作用的研究进展，在慢性痛的治疗中，将 CaMKII参与的胞内级联反应作为靶分子具有潜在的临床价值。关键词关键词：慢性痛，信号转导，钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶 II 学科分类号学科分类号：R339.5 慢性痛可由多种疾病引起，持续的时间较长，且很多药物对其治疗无效而导致病人长期忍受极大的痛苦。因此，人们对慢性痛发生发展机制的了解，将为临床上治疗疼痛提供有效的途径。近年来，利用在体和离体实验，人们鉴别出许多信号转导通路中的靶分子，来阐释伤害性感受的处理机制。神经系统的中枢敏化机制在反应和传导伤害性刺激中的作用引起了人们的广泛关注，且慢性痛神经生理学机制之一可能是细胞内 Ca2+相关级联反应所引起的伤害感受性受体敏化，这一点已经达成了越来越多的共识1;2。本综述将简要讨论 Ca2+/钙调蛋白(CaM)依赖的蛋白激酶 II(CaMKII)的激活和调节对于上述反应发挥的重要作用。另外，将集中阐述实验动物受到伤害性刺激时，CaMKII 在其感觉可塑性的改变过程中发挥的重要作用。CaMKII 是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在外周和中枢神经元的细胞器内都有分布3。在神经系统表达的 CaMKII 主要有两个亚型：CaMKII 和 CaMKII。每一种亚型都包括氨基末端催化结构域(约为 260 个氨基酸)和调节结构域(约为 40 个氨基酸)，其中调节结构域有 90%的同源性。mRNA 的选择性转录在羧基末端形成了长度为 180 到 240 个氨基酸的可变序列。Ca2+/CaM 结合到 CaMK亚单位上，首先触发其作用底物的磷酸化反应，同时促进 CaMK分子内第 286 位苏氨酸的自磷酸化，从而导致 Ca2+/CaM 的解离速率下降并阻止该酶在 CaM 解离后的失活3-5。CaMKII 在 Ca2+敏感的信号通路中起主导作用，它是不同外界刺激引起的神经可塑性改变的基础3-6。引发伤害性感受神经元兴奋的一个关键启动步骤是，Ca2+通过质膜上的配体和电压门控 Ca2+通道内流，以及内质网 Ca2+库的释放，引起胞内复杂的 Ca2+相关信号转导通路，尤其是 CaMKII 参与的细胞信号转导通路的激活。胞内 Ca2+浓度的增加激活 CaM，后者引发 CaMKII 磷酸化激活，随之结合到突触后致密区。这发生在神经元受到刺激，形成长时程增强(LTP)时。然而，抑制 CaMKII 的活性或者 CaMKII 亚单位的遗传缺失，会抑制LTP 中上述反应的发生3;5;6。近来，通过探讨 CaMKII 在 LTP 形成中的作用机制，人们发现 CaMKII 在外周和中枢水平都参与了伤害性刺激的感觉处理过程1;2;7-9。http:/-2-1.外周机制外周机制 目前，已有几个实验小组报导了 CaMKII 在周围神经系统，特别是在初级感觉背根神经节(DRG)神经元中的分布和定位情况8-11。使用免疫荧光双标的方法结合立体结构分析得出，大约 41%的 L4 及 L5 层 DRG 神经元中有 CaMKII 的表达，并且主要分布于平均直径约为 27m 的小 DRG 神经元中8。进一步的研究发现，CaMKII 与伤害性感受 DRG 神经元标记物 IB4、CGRP，以及辣椒素受体(TRPV1)共定位。在大鼠后爪注射完全弗氏佐剂(CFA)引发炎症反应后，趾神经 CaMKII 标记的轴突数量在注射 48h 后显著增加，包括无髓鞘和有髓鞘轴突。结扎坐骨神经产生的机械性刺激也可以促使 DRG 神经元中 CaMKII 表达量增加8;11。还有人发现，大鼠 DRG 神经元中，CaMKII 与 阿片受体共定位12。CaMKII 还分布于颅感觉神经节如三叉神经节、颈神经节、颞骨神经节和节状神经节的神经元中，而且与 CGRP 及 VR1 受体共表达10。离体研究同样显示，CaMKII 在培养的 DRG神经元中表达，而且可被伤害性刺激激活7。用增加细胞外 Ca2+浓度的方法刺激培养的小鼠DRG 神经元，可显著增高 CaMKII 第 286 位苏氨酸的磷酸化水平13。CaMKII 的活性还与培养的小鼠 DRG 神经元的放电频率有关，后者可能与 Ca2+相关胞外刺激相偶联。在培养的三叉神经元中，辣椒素可显著增加 CaMKII 第 286 位苏氨酸的自磷酸化水平14;15。CaMKII抑制剂 KN-93 可显著降低辣椒素和 NMDA 诱导的 CGRP 释放15，表明 CaMKII 对于神经肽的释放也有显著的作用。电刺激大鼠 DRG 神经元或坐骨神经可显著增加 L4-6 层 DRG 神经元中 CaMKII 的表达量和磷酸化水平7。用 CaMKII 抑制剂 KN-93 或 KN-62 可以抑制 ATP诱导的 DRG 神经元的快速电流。炎症反应时，初级感觉神经元上的膜神经递质受体也可能是CaMKII作用的靶点7。CaMKII的激活可调节TRPV1的磷酸化、提高DRG神经元中P2X3受体的表达量，而 CaMKII 抑制剂可阻断这些变化16。以上研究结果表明，在超敏伤害性感受动物模型中，CaMKII 及其磷酸化激活机制可能在初级感受神经元或初级传入神经元中起至关重要的作用。同时还表明，在外周炎症感觉神经元中 CaMKII 对于神经肽释放的调节和膜伤害性感受受体(如阿片类受体、辣椒素受体TRPV1 和 P2X3 受体)的调节也起重要的作用7;15;16(图 1)。http:/-3-图 1 外周伤害性刺激引发的外周感觉神经元中 CaMKII 信号转导通路 Fig1:The proposed CaMKII signaling pathways in peripheral sensory neurons in response to painful stimuli.2.中枢机制中枢机制 作为第二信使系统的重要成员之一，CaMKII 大约占据突触后致密区全部蛋白含量的2%。它对于感觉传入在突触后中间神经元的脊髓传输起重要作用。一些早期实验已经证实了 CaMKII 基因在脊髓中的表达，并通过研究部分啮齿类动物急、慢性痛模型，证明 CaMKII参与了伤害性刺激的脊髓传输1;2;17-20。中枢敏化是慢性、持续性痛的重要机制之一。我们课题组使用大鼠后爪辣椒素注射的方法造模发现，CaMKII 广泛参与了脊髓伤害性感受信号的神经传递。通过蛋白印迹(Western blot)研究发现，皮内注射辣椒素诱导伤害性刺激后，大鼠脊髓背角神经元内 CaMKII 蛋白表达量和磷酸化水平增高，免疫组织化学研究也证实了这一结果。我们还应用电生理学方法来分析脊髓神经元对于辣椒素注射的反应，来探讨 CaMKII 在此过程中的作用。结果显示，脊髓局部给予 CaMKII 抑制剂 KN-93 后，增强的脊髓伤害性感受神经元的反应被显著抑制。此外，我们研究了 CaMKII 抑制剂对辣椒素注射引起的大鼠行为学变化产生的影响，证实CaMKII 在中枢敏化的传输机制中有重要作用1。进一步的研究证实，经脊髓给予两种CaMKII 抑制剂 KN-93 或 AIP，可以阻断大鼠脊髓背角神经元 C 纤维诱发的场电位 LTP21。这些研究提示，CaMKII 在中枢敏化发生中的作用机制与其处理神经元 LTP 时的作用机制相似(图 2)。在结扎大鼠坐骨神经诱发慢性痛的模型中，研究者发现，从第三天开始脊髓浅层出现CaMKII 免疫反应阳性增高。这种增高可持续 14 天，且在疼痛刺激后的第二天开始就有CaMKII 磷酸化水平的增高。神经损伤之前，鞘内注射 CaMKII 抑制剂 KN-93 可明显降低福尔马林实验第 II 阶段的伤害性行为，同时也降低热痛敏和机械性痛敏的发展18。另有实验http:/-4-研究了CaMKII第286位苏氨酸磷酸化位点突变的转基因小鼠对于伤害性刺激的反应。发现，将 CaMKII的第 286 位苏氨酸点突变为丙氨酸后，显著降低了福尔马林注射实验第 II 阶段的进行性痛觉行为，并伴随福尔马林诱导的脊髓 c-Fos 蛋白水平的降低。有趣的是，这种突变并不能改变福尔马林诱导的 24h 内热刺激潜伏期缩短的现象17。另一项研究报道，在急性温热刺激的大鼠模型上，KN-93 不能阻断温热刺激导致的行为学改变22，提示 CaMKII可能不参与脊髓敏化。经过热刺激后，脊髓内 CaMKII 磷酸化水平不发生变化的实验结果进一步证实了上述结论22。但是在慢性神经性疼痛的其它模型上，经过慢性神经性疼痛刺激后，CaMKII 抑制剂 KN-93 可以减弱大鼠或小鼠的热痛敏18;23。这些不同的结果可能证明了CaMKII 在慢性神经性疼痛中起了重要作用，而且 CaMKII 可能是以一种很复杂的机制参与了伤害性信息的中枢处理。此外，人们还发现了 CaMKII 在脊髓调节伤害性感受的膜受体，如 NMDA 受体和 AMPA受体，它们都是 CaMKII 等蛋白激酶的作用底物1-3;24。我们最近的实验结果表明，辣椒素注射后，AMPA 受体的 Glu-R1 亚单位的两个磷酸化位点(第 831 和 845 位丝氨酸)可以被磷酸化1;24;25。Glu-R1 亚单位的第 831 和 845 位丝氨酸可被很多激酶磷酸化激活，如 CaMKII、蛋白激酶 A(PKA)和蛋白激酶 C(PKC)23-26。鞘内给予 CaMKII 抑制剂 KN-93 可以明显阻断Glu-R1 受体第 831 和 845 位丝氨酸的磷酸化水平1;26。CaMKII 首先与突触后致密区结合，Ca2+内流增加可使其自磷酸化激活。CaMKII 对于伤害性刺激引起的长时程改变的一个重要影响是，第 286 位苏氨酸自磷酸化后，其活性不再依赖于 Ca2+和 CaM。这就使得尽管在 Ca2+水平恢复到基线后，CaMKII 对于其它胞内或膜相关信号仍有持续的反应性3;5。其它研究也表明，CaMKII 参与了伤害性感受信号的转导过程。免疫沉淀结果证明，神经性疼痛刺激可以增加脊髓内磷酸化CaMKII与NMDA受体NB2A/B亚单位，以及其它突触后致密区(PSD)膜信号蛋白的结合。PSD95 在慢性痛过程中起连接该分子信号的作用23。另有研究发现，在小鼠结肠内注射辣椒素，脊髓内 CaMKII发生快速磷酸化，且伴随 AMPA 受体 Glu-R1亚单位在质膜成分内的蓄积。脊髓局部提前给予 CaMKII 抑制剂 KN-93 可显著降低质膜内Glu-R1 的蓄积，同时阻止胞浆内 Glu-R1 蛋白的分解24。这些结果证明，CaMKII 的活性在痛觉刺激引起的谷氨酸受体突触传递的调控中起重要作用。慢性或持续性刺激激活细胞内细胞信号通路，将信号由质膜传导至细胞核，从而改变基因的表达。CaMKII 信号通路在脊髓伤害性感受神经元可诱导一些重要转录因子的激活，比如 c-Fos 和 cAMP 反应元件结合蛋白(CREB)2;27-29。我们在研究大鼠体内注射辣椒素后，CaMKII 在调节 CREB 磷酸化中的作用时，首先发现辣椒素注射可在脊髓内引起 CREB 磷酸化水平的显著增加29;30，而鞘内给予 CaMKII 抑制剂 KN93，可显著降低增加的 CREB 磷酸化水平31。这些刺激诱导的转录因子的激活同样是在大鼠慢性痛模型中发现的，它们的激活需要 CaMKII 的参与。Miletic 研究小组利用大鼠坐骨神经结扎模拟慢性神经性痛，发现应用另一种 CaMKII 抑制剂 AIP 后，坐骨神经损伤引起的脊髓背角神经元内 CREB 磷酸化水平可显著降低28。这些结果证明，CaMKII 激活后引发级联反应，激活转录因子，使 CREB发生磷酸化，参与了急慢性疼痛刺激引起的中枢敏化机制(图 2)。http:/-5-图 2 外周伤害性刺激引发的脊髓感觉神经元中 CaMKII 信号转导通路 Fig2:The proposed CaMK signaling pathways in spinal sensory neurons in response to peripheral noxious stimuli.3.结语结语 综上所述，CaMKII 在伤害性刺激所引起的外周和中枢感觉系统可塑性改变中起着重要的作用。对于调控 CaMKII 信号转导通路的复杂机制，以及 CaMKII 对细胞膜表面伤害性感受器和核内转录水平的调节作用，还有待于更深层次的研究和探讨。在研究慢性痛发病机理的细胞信号转导分子机制中，CaMKII 显然是一个关键的信号蛋白分子(图 1，图 2)。因此，对于抑制 CaMKII 信号通路的药物和技术方法的应用，可能为将来临床上慢性疼痛的治疗提供新策略。参考文献 参考文献 1 Fang L,Wu J,Lin Q,et al.Calcium-calmodulin-dependent protein kinase II contributes to spinal cord central sensitization J.J Neurosci 2002;22(10):4196-4204.2 Kawasaki Y,Kohno T,Zhuang ZY,et 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Neuroscience and Cell Biology，The University of Texas Medical Branch，Galveston，USA Abstract The signaling and transmission of painful stimulus-evoked events in peripheral and central sensory system is mediated primarily through the activation of multiple intracellular calcium-related signaling pathways.Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII)was proposed to play a prominent role in regulation of excitatory synaptic transmission.However,its functional role in processing pain signals was not implicated in sensory transmission systems in particular until recently.New evidence obtained using multiple approaches such as electrophysiological recordings,pharmacological,behavioral experiments as well as molecular biology techniques strongly supports the emerging role of CaMKII in peripheral and central sensory neurons in processing nociceptive transmission in a variety of experimental animal models of acute and chronic pain.This review summarizes recent advances in the identification of the role of CaMKII signaling pathway in peripheral and central hypersensitivity and the value of CaMKII cascade-related cellular events as molecular targets for potential therapeutic properties of chronic pain.Keywords：chronic pain，signal transduction，CaMKII.