DNA真菌分类.pdf

应用!#分子进行真菌分类的原理及方法谢艺贤郑服丛（中国热带农业科学院植物保护研究所海南儋州57l737）摘要系统介绍现代分子生物技术 RFLPS，PCR，RAPDS，ALFPS 和 SAPS 技术在真菌分类上的价值以及在某些方面已取得的成就，并详细介绍其分类原理和操作方法。关键词DNA 分子真菌分类原理和方法真菌的亲缘关系或系统性的研究是建立生物资源预期价值信息存取系统不可缺少的内容。真菌分类学也是进行真菌遗传学、种群学以及流行病学研究的基础。近两个世纪以来，真菌分类一直是以形态学为主，主要分类依据：（l）性征（或交配型）；（2）性器官的形态，包括性器官的大小、形状、壁的厚度；（3）无性世代的形态，包括分生孢子的形态、孢子梗的长度、乳突、菌丝的肿大体等；（4）致病性，不同的种类侵染的对象和部位不一样，侵染方式不同。近几年来，随着生理生化特性遗传变异特点、血清学反应、酶学、分子生物学技术以及计算机技术等新的分类依据不断地被引入微生物学分类当中，真菌分类技术又增添了新的内容，分类依据也有所扩充：（l）血清学。血清学的方法已被广泛应用于真菌的研究l。其中，免疫荧光法是近几十年来发展起来的一门较先进的技术，它具有免疫学特异性和敏感性，又能在显微镜下清晰地看到染色体对象的形体特征，从而显著地提高了结果判断的可靠性。（2）菌丝可溶性蛋白质凝胶电泳。蛋白质电泳对解决疑难种的鉴定、异名的处理等分类学问题是较为简单易行的方法，在解决什么是种内形态变异和什么是种间性状交叉问题时成为一个很重要的依据2。（3）同功酶。同功酶作为一类蛋白质，其结构是由基因决定的。同功酶结构反映了生物间的亲缘关系，因此酶谱分析可应用于种和种下的分类3。随着分子生物学的发展，新的分子生物学技术的应用更新了系统学的研究。核酸分析可用来区分物种和评价亲缘系统发生的关系。DNA 作为遗传物质要比表型特征更为真实地反应真菌的系统发育。核酸分析是在真菌学的系统发育和群体研究方面迅速发展起来的新技术。核酸的碱基组成（GC 值）已经成为细菌分类学有价值的工具，并已列为分类群的属性。真菌的 GC 值有一个与细菌相似的范围。从 GC值来看，真菌的进化是由 GC 值递增表现出来的4。另外 DNA 的含量也存在差异。用分子杂交的方法可以找到 DNA 的同源序列。两种生物之间的亲缘关系越近，它第 6 卷 第 l 期华 南 热 带 农 业 大 学 学 报2000 年 3 月Vol.6 No.lJOURNAL OF SOUTH CHINA UNIVERSITY OF TROPICAL AGRICULTUREMar.2000们之间所共有的多核苷酸的相同序列就越多，即同源百分率越高。DNA 同源序列用于区分一般形态学方法不易鉴定的真菌种类是有价值的。不但能区分不同的种类，还可以进一步找出其亲缘关系5。DNA-RNA 杂交的研究与 DNA-DNA 重组相比较，给基因组中已知类群 RNA 的顺反子计算提供了可能，这样的研究也为分类学和系统发育的分析提供了一个很好的工具4。生物的遗传与变异推动了生物的进化。作为遗传物质的 DNA 的序列直接决定了生物的种类。因此，用 DNA 分子对真菌进行分类能更准确更直接地反映真菌的系统发育。目前常用的 DNA 分子进行真菌分类的方法有：RFLP、PCR、RAPD、AFLP、SAP 等几种方法。下面就对其原理和方法作简要阐述。1RFLPs-（restriction fragment lengthpolymorphisms）DNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）研究是在种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段6。其基本原理是不同种、种内以及种群的DNA 序列在进化过程中发生突变，造成限制性切点间的插入缺失重排或点突变。因此，当用某一限制性内切酶消化 DNA 时将产生不同长度的 DNA 片段。但由于通过电泳无法直接观察到结果，因此需寻找一个合适的探针（用同位素标记，或生物素、地高辛标记）来进行杂交，然后才可以观察到结果。其基本操作方法见图 l：样品提取基因组!DNA!用限制性酶酶解琼脂糖凝胶电泳DNA!变性将 DNA#转移到固相支撑物预杂交杂交洗膜放射自显影$用32P 标记 DNA 探针图 1RFLP 分析流程图通过借助计算机处理大量的数据材料可以对 DNA 样品进行有效的分析，从而对样品的分类提供直接的依据。2PCR 和 RAPDs-（polymerase chainreaction，random amplified polymorplisms）多聚酶链式反应（PCR）的出现为真菌DNA 的扩增提供了更为方便和准确的方法。通过 PCR 扩增具有种间特异性的 DNA片段从而决定种间的不同，已在真菌分类研究中 得 到 部 分 应 用7。PCR 的 出 现 为mRNA 的研究提供了方便，同时 PCR 扩增产物的限制性分析 RAPDS 免去了 Southern 印迹或放射自显影的麻烦。RAPDS-随机引物扩增多态性 DNA。这种方法是建立在 PCR 基础之上的又一新的技术，这一技术为真菌分类提供了新的快速的方法。该方法适用于种以下水平的分类学研究并在真菌分类中已得到了部分应用。Bichard 等8用 RAPD 鉴定了禾顶囊壳63华 南 热 带 农 业 大 学 学 报第 6 卷（Gaeumannomyces graminis）的亚种，发现欧洲亚种同北美亚种具有相同的遗传图谱，从而证实了北美亚种是由欧洲引入北美大陆的。A.JOHANSON 等9使用该技术很容易地把香蕉上的 Mycosphaereiia 近似种区分开来。RAPD 也可用于依靠形态分类类群间的遗传亲和性研究10。其基本原理见图 2。图 2PCR 扩增反应流程图如图 2 所示，随机引物可以同 DNA 分子上不同的地方配对（随机引物为 10p），通过 PCR 反应后可以直接电泳后看到结果。由于不同的样品 DNA 与引物（primer）结合的位点不同，其扩增产物也不同，因此可根据其扩增产物的差异来对真菌进行分类。其基本操作方法如下：待分析样品 DNA 的提取随机引物 PCR 扩增PCR!反应条件!扩增产物电泳分析94 C 1 min36 C 1 min72 C 2 min35 45 Cycies这一方法具有用量少、鉴定迅速、可重复性等特点。3AFLPs（amplifiedfregmentlengthpolymorphisms）扩增片段长度多态性11此方法是结合限制性片段长度多态性（RFLP）和 随 机 引 物 扩 增 多 态 性 DNA（RAPD）两项技术而形成的另一新的更有效的 DNA 指纹图谱的技术。此技术是 1993年由荷兰 Kcygene 公司科学家 Zabeau Marc和 Vos Pieter 发明创建的一种 DNA 分子标记新技术，它的特点是多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，而且还具有带纹丰富，用样量少，灵敏度高，快速高73第 1 期谢艺贤等：应用 DNA 分子进行真菌分类的原理及方法效等特殊优点。目前，不仅在小麦、水稻、玉米、大豆和棉花等主要农作物上得以应用，而且在蔬菜（番茄、马铃薯）、林木 垂枝桦（Betula pendula）、辐射松（Pinulradiata）以及植物基因组研究的模式植物拟南芥上广泛应用l2。其基本原理是基于对植物基因组总DNA 双酶切经 PCR 扩增后的限制性片段进行克隆ll。具体是植物基因组 DNA 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的接头（adapter）连接在这些 DNA 片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和 PCR 引物 3末端的识别，特异性片段经变性，退火延伸周期性循环而扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分子筛的作用，将这些特异的限制性片段分离开来（图 3）。图 3AFLP 操作原理其操作流程包括模板准备（DNA 的提取）、片段扩增和凝胶分析三个主要步骤l3。各步骤具体的过程有：（l）提取样品DNA 经浓度和质量检测后，针对植物基因83华 南 热 带 农 业 大 学 学 报第 6 卷组富含 AT 的特点选择6 个碱基识别位点的限制性内切酶，通常是 EOORI 或 PSII 或 SSeI，和 4 个碱基识别位点的限制性内切酶，通常是 MSeI 或 SSeI 在适宜的缓冲系统中进行酶切。（2）酶切后的限制性片段在 T4 连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。（3）利用磁珠（粉）在STEX 盐溶液中反复洗脱 2 3 次，选择带有特定接头的限制性片段。（4）PCR 前扩增。（5）利用同位素标定 PCR 引物。（6）在TagDNA聚合酶的作用下，完成 94 C变性30S 65 C退火 30S72 C延伸 60S PCR 扩增 36 个循环。（7）PCR 产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。（8）将电泳后的凝胶转移吸到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。（9）在 X 光片上感光，数日后洗胶并进行结果分析。这一技术将更直接真实，更全面地反映基因组 DNA 的情况，更有利于提高真菌分类的准确性。但这一技术目前还很少在真菌分类上应用。4SAP技 术（SpecificAmplifiedPolymorphisim）专一引物扩增这一技术的基本原理：生物在进化过程中，DNA 的进化往往涉及到内含子的插入，不同的品种其插入的内含子序列和大小不同，而其两侧的 DNA 序列往往变化很少 保守区。因此，根据其两侧保守区序列设计引物，经 PCR 可以扩增出内含子片段，然后经过比较其大小和序列可以对生物进行分类，从而推测其进化关系和亲缘关系。其基本操作方法：（l）样品 DNA 的提取。（2）根据已知序列设计引物。（3）PCR反应及 PCR 扩增产物电泳分析。（4）PCR产物酶切电泳分析。（5）扩增产物序列分析（见图 4）。根据分析的结果可以弄清某一真菌的进化关系和亲缘关系。图 4SAP 技术原理及流程图93第 1 期谢艺贤等：应用 DNA 分子进行真菌分类的原理及方法随着生物技术的发展，将有越来越多的新的技术应用到真菌分类上，鉴定形态上难于区分的种，研究真菌的亲缘关系以及真菌的遗传、变异、分布等，真菌的分类将渐渐走向分子水平，并正走向多学科的综合。参考文献1Hamamoto M，Sugiyama F，Komagata K.J GenAppI MicroboI，1997，32：215 2232马国忠，余永年.凝胶电泳与腐霉属的分类.真菌学报，1991，10（3）：217 2223Hanson L C，Characterization of three TremeIIaspecies by isozyme anaIysis.MycoIogia，1991，83：446 4544周与良，邢来君.真菌的系统发育和进化方面的研究进展.微生物学通报，1982，9（5）：216 2215Fusson G B，Phaff H L.Int J Syst BacterioI，1987，37：371 3796Kohn L M.DeveIoping new characters for fungaIsystematics：AnexperimentaIapproachfordetermining the rank of resoIution.MycoIogia，1992，84（2）：139 1537Gargas A，TayIor J W.PoIymerase chain reaction（PCR）primers for ampIifying and seguencingnucIear 18S rDNA from Iichenized fungi.MycoIogia，1992，84（4）：589 5928HameIin C R，OueIIette G B，Bernier L.AppIEnviro 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