免疫组化的图象分析.pdf

免疫组化的图象分析 我这里说的免疫组化图片，是这样的一类图片：染上的颜色是黄色，如果染得浓，就呈现棕黄色。（制作样品的过程可别问我。我不知道）要比较 不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要用尽可能完全一致的方法来处理。最近看到一个新技术挺不错，就是把各个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后进行免疫组化反应及染色处理。这样在一个载玻片上就有了数百个小切片，不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。切片当然首先得拍成照片才能进行分析。拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下几个要点：1.所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍 摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。保持各张切片的拍摄条件一致更 重要。2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！3.免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在 230-240 之间。如果 呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下面两张照片中左边一张 是合适的曝光，右边那张不好。打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。点开 intensity calibration 窗口后，选 std option density，并点 option 按纽，在弹出的窗口里点 insident 旁边的 image 按纽。弹出第三个窗口后，将鼠标移到图片的空白处点一下，就可 以看到 current value 的值会显示出点击部位的灰度值。白色的背景能达到 250 左右，而拍得较暗的照片或者背景偏蓝的照片则只有 200 甚至更低。一张照片的背景强度不会是完全一样的。所以要在照片各个不同的空白处都点一下，看看它们的值差别大不大。许多相机拍的显微镜照片是中间稍亮，四周暗。所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。较正背景的值会在曲线的 X 轴端中表现出来。光密度校正窗口可以放在屏幕上随时检查，有时候在切换了图片后其光密度校正值会有变化。现在可以调出 count/size 窗口，先选择测量项目，前面说过 density mean 是不合适的测量参数，IOD 也有点误差，不过这是系统误差，对半定量分析的影响不大。所以可以选用 IOD 与 area 两个测量项目。当然把选中区域转换成灰度图片再测量更好。另外对 option 也要适当设置一下。然后要保存 count/size 窗口的设置，点 count/size 窗口的 file-save settings，将当前的测量设置文件保存，最好与图片文件存在同一个文件夹里，免得以后找不到。文件扩展名是.env。保存这个文件的目的是为了制作宏操作用的。下面就可以选择颜色了，点 select colors,取 HSI 颜色系统，S 与 I 都选 0 到 255，H 选 0 到 30 左右。这基本上包括了黄色区域。然后也要保存颜色设置文件。下面就可以测量光密度值了，点 count，然后到 statistics 窗口中查看测量值。IOD SUM 与 area SUM 是有意义的测量值。IOD SUM 是图片中黄色区域的累积光密度，area SUM 则是选中的黄色区域的面积。如果想要测准一点，就需要把选中区域复制下来，再转换成灰度图片后再测量光密度。作法如下：1.选好颜色区域后，在 preview 中选 transparent on white，这时图片中未被选中的区域都被填上了白色。再点 create preview image 按纽，就生成了一张新图片，再用 edit-convert-grey scale 8 把这张图片转换成八位灰度图片。2.重新校正光密度，依然把 insistent level 定为 250。这实际上就是扣背景了。3.对灰度图片，select color 按纽变成了 select range。点出的选色窗口只有一个强度范围，要选择 0 到 255。整个照片都选上，当然，选 0 到 250 也行，没选上的都是白色区域，测量没有影响。4.回去点 count 按纽，到 statistics 窗口里察看测量值。IOD 的确与上面所作的不同。area 也稍有差异，当属复制图片引入的误差。下面就是统计问题了。现在我们测量的是整张照片中黄色区域的总光密度值。图片与图片之间是否就是比较它们之间的 IOD 值呢？未必。最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时 IOD 值就能反映出这两张图片染色程度的不同。实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是 IOD 除以图片的整个面积。实际上比较的就是整个视野的平均光密度。另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为 IOD/（照片面积-空白区域面积）照片面积就是照片的象素，一张 480*720 象素的照片面积是 345600。空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在 250-255 之间，H 选 30-255，再 count 一下就能测出了。不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。这只要在面积测量中设一个大一点 的过滤值就行，比如只计算面积大于 200 象素的区域。还可以看 measurement date,找那个最大的几个object 的面积。如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit-filled 把它们填上白色。再进行测量。还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。一句话，测量的 IOD 是分子的值，一般情况下都相似，选择的 area 这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。制作宏的操作：一、准备工作：1。进行光密度较正。命名保存，如 system。2。在 count/size 窗口中设置：measurement:area(10-10000000),IOD(0-100000000)option:outline:none,label style:none.clean border:none 然后点 file-save setting，保存该设置为一个文件 date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里 3。在 select color 里选 HIS:H 0-30,S,I0-255，然后点下面的 file 按纽，save color 到一个rgb24.rge 文件,也存到图片文件夹目录中。二、录制宏：打开图片，点开 count/size 窗口，先随便测个数据，这样可以打开 view-statistics 窗口，可以随时察看测量数据。再打开 intensity calibration 窗口。现在桌面上有光密度较正窗口、count 窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运行宏的开始。点宏-录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。然后开始录制。注意以下的所有操作都只能用鼠标点，不能动任何键。1。在 intensity calibration 窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是不是正确，特别是 X 轴交点位置是不是刚才较正过的值（如 200 或 240 之类）2。点 count/size 中的 file-load setting，调出刚才保存的 date.evn 文件。3。点 select color，在调出的窗口中点 HSI，再点 load file,调出 rgb24.rge 文件。4。仍然在 segmentation 窗口中下方的 preview 中选择 all class 和 transparent on white.此时图片上应显示被选中的部分仍是黄色，其他部分被填上了白色。点 create preview image 复制下这张 preview 图片。5。在新图片上点一下，再点程序菜单上的 edit-convert to-gray scale8。又生成一张新图片，这是黑白图片了。点录制宏小窗口的 stop 结束。把这张黑白图片保存。关闭其他的图片，打开 Excel,然后开始录制另一个宏：1。开始录制后依然先点一下 intensity calibration 的那个校正。2。调出 count 窗口的 setting 文件。3。点 select range。将 range 范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时得到的值，如 200或 240 之类）4。回到 count 中点 count 按纽。5。到 statistics 窗口中点 file DDE to Excel.6。结束宏的录制。说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。只好分成两步作宏操作。宏操作录制完后，处理图象时的操作：1。打开一个图片，运行第一个宏。得到一张灰度图片。2。对灰度图片执行第二个宏操作。3。在 excel 中把数据转移或抄下来。4。先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。（桌面上不能一张图片也没有）5。开始处理下一张图片。图片测量数据的处理：测量指标要根据图片的情况来选择。各有不同的选取。可以：仅比较整张图片的 IOD。比较阳性区域的 density mean=IOD(sum)/area(sum)(这里的 area 是黄色部分的 area)有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。这就需要另外测量样品区域的 area(sample sum),然后比较 IOD（sum）/(sample sum area)单个细胞可以比较每个细胞的 IOD 或者是 单个细胞 IOD/单个细胞 area.这些其他的情况都需要重新制作宏。