超高效液相色谱_串联质谱法同时测定食品中碱性橙_碱性嫩黄O和碱性桃红T.pdf

收稿日期:2009-03-19 修回日期:2009-04-13基金项目:国家质量监督检验检疫总局自筹经费项目(2007QK160,2007QK161)*通讯联系人:郑小严,男,高级工程师,研究方向:食品安全分析.第 25卷第 4期Vol.25 No.4分 析 科 学 学 报JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE2009 年 8 月Aug.2009文章编号:1006-6144(2009)04-0409-05超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T郑小严*(福建省中心检验所,福建福州 350002)摘 要:本文建立了同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。样品经碱化甲醇提取、二氯甲烷萃取、浓缩、酸化甲醇溶解和甲醇饱和正己烷溶液萃取净化后进行测定。本方法检出限分别为碱性橙 0.6 Lg/kg、碱性嫩黄O 0.3 Lg/kg、碱性桃红 T 0.7 Lg/kg。六种食品样品的回收率为 72.1%91.1%,相对标准偏差(RSD)为 2.4%9.1%(n=6),三种染料在0.010.5 Lg/mL 范围内呈良好的线性关系,线性回归系数 r 均大于 0.9950。关键词:超高效液相色谱-串联质谱法;食品;碱性橙;碱性嫩黄 O;碱性桃红 T中图分类号:O657.63 文献标识码:A碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 均为芳香胺类碱性染料(图 1),用于腈纶、人造纤维、皮革、纸等的染色和棉织品、丝织品的印花,具有致癌、致畸变性 1-4,被严禁作为食品添加剂使用 5。但在中性及偏碱图 1 碱性橙(A)、碱性嫩黄 O(B)和碱性桃红 T(C)的化学结构Fig.1 The chemical structures of chrysoidine(A),auramine O(B)and safranine T(C)性条件下,碱性橙和碱性嫩黄 O 与蛋白质吸附作用较强,不易褪色,一些不法商人将其用于豆制品及黄鱼的染色 6,使消费者健康受到严重威胁;碱性桃红 T 色泽红艳且不易褪色,常被不法商人用于花生、红菇、蜜饯等的染色。此外,桃红色素还能覆盖霉变花生外表的霉斑,而发芽霉变的花生米含有剧毒的黄曲霉毒素,消费者食入这种的花生米将会对人体健康造成严重的影响。目前尚无检测食品中碱性桃红 T 的方法。目前碱性橙的检测方法有高效液相色谱法 7-9、液相色谱-质谱法 10和气相色谱-质联法 11。碱性嫩黄 O 的检测方法有高效液相色谱法 9,12,13。本文建立了碱化甲醇提取、二氯甲烷萃取、酸化甲醇饱和正己烷溶液萃取净化,超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 染料的方法。该方法碱性橙、碱性嫩黄和碱性桃红的检出限分别为 0.6 Lg/kg、0.3 Lg/kg、0.7 Lg/kg,三种染料的线性范围为 0.010.5 Lg/kg,对六种食品样品的回收率为 72.1%91.1%,相对标准偏差(RSD)为 2.4%9.1%(n=6),取得了满意的结果。409第 4 期郑小严:超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T第 25 卷1 实验部分1.1 主要仪器与试剂Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪系统,配 Quattro Premier XE 串联四极杆质谱仪(美国,沃特世公司);高速冷冻离心机(美国,贝克曼公司,Avanti J-E);Mill-i Q 超纯水纯化系统(美国,Millipore 公司);涡旋混合器。碱性橙标准品(99%),碱性嫩黄 O 标准品(98%),碱性桃红 T 标准品(99%)(Acros organics,美国)。混合标准储备液:准确称取 20.0 mg 碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 标准品,用甲醇溶解定容到 100mL,准确移取适量混合标准储备液,用酸化甲醇稀释成 0.01 0.5 Lg/mL 的标准系列;酸化甲醇:500 mL甲醇+10 mL 甲酸;提取剂:500 mL 甲醇+10 mL 氨水。甲醇、乙腈(色谱纯);所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂,水为超纯水。1.2 样品处理方法称取 200 g 样品,破碎均匀,然后称取 5.00 g 置于 50 mL 离心管中,准确加入 20.0 mL 提取剂,超声提取 30 min;于 4 e 以 15 000 r/min 离心 5 min,移取 5.0 mL 提取液于 50 mL 离心管中,再加入 10 mL2%氨水和 2 g NaCl 混匀,用二氯甲烷涡旋萃取 3 次,每次 10 mL;于 4e,15 000 r/min 离心 5 min,吸出下层提取液合并,过无水硫酸钠滤入 250 mL 浓缩瓶中,40e 真空旋转蒸发至约 1 mL,转入 10 mL 试管中,40 e 氮气吹至近干,加入 3 mL 酸化甲醇溶解,用甲醇饱和正己烷萃取净化 3 次,每次 2 mL,吸出正己烷层弃去,40e 氮气吹至 2 mL 以下,用酸化甲醇定容到 2.0 mL,混匀,用 0.2 Lm PT FE 滤膜过滤后检测。1.3 色谱条件色谱柱为 Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱(100 2.1 mm,1.7 Lm);柱温 40e;流动相及梯度:A为 0.4%甲酸水溶液,B 为纯甲醇,0 2 min,75%A y55%A;2 4 min,55%A;4 6 min,75%A;流速0.3 mL/min;进样量 3 LL。1.4 质谱条件电离源:电喷雾正离子模式;毛细管电压 1.00 kV;源温度 100e;脱溶剂气温度 350e;脱溶剂气流量700 L/h;碰撞室压力 0.31 Pa;特征离子见表 1。表 1 碱性橙、碱性桃红 T、碱性嫩黄 O的主要特征离子Table 1 The characteristic ions for chrysoidine,safranine T and auramine OAnalyteRetention time(min)Parent ion(m/z)Fragment ion(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)Chrysoidine2.04213.4*77.23535120.23535Safranine T2.68315.0*299.07535238.07535Auramine O2.91268.5*147.23535252.43535 *Quantitative ion.2 结果与讨论2.1 前处理条件的优化实验发现在水溶液中碱性染料极易被吸附,因此,本方法试验了酸化甲醇 13和碱化甲醇两种提取剂。实验比较了聚酰胺小柱和 SCX 固相萃取小柱对样品的净化效果。结果表明,聚酰胺小柱对碱性桃红 T的吸附和净化效果良好,但对碱性橙、碱性嫩黄 O 的回收率较低。SCX 固相萃取小柱对低盐样品净化及回收率较好,但对含盐量较高的样品回收率偏低,因此样品采用液液萃取法净化。由于腐竹等样品的酸化甲醇提取液在调为碱性后会产生大量的沉淀,影响后面的提取步骤,因此采用碱化甲醇为提取溶液。碱化410第 4 期分 析 科 学 学 报第 25 卷图 2 空白样品与空白加标的总离子流图Fig.2 TIC chromatography of blank sample(a)and spikedsample(b)甲醇对碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 均有良好的溶解性,并且能有效排除油脂、胶质和蛋白质的干扰。实验还发现碱性橙、碱性嫩黄 O和碱性桃红 T 在碱性水溶液中能被二氯甲烷萃取,因此将提取液加入 2%氨水,在碱性条件下用二氯甲烷萃取染料,二氯甲烷萃取液浓缩后用酸化甲醇溶解,再用甲醇饱和正己烷萃取去除非极性杂质。经过该方法净化后,样品提取溶液颜色明显变浅,杂质大大减少,能有效延长色谱柱的使用寿命,并有利于减小样品的离子抑制干扰,提高了检测的准确度。空白样品与加标的色谱图见图 2。2.2 质谱条件的选择配制 5 Lg/mL 碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 的酸化甲醇溶液,由注射泵直接进样。首先做一级全扫描,扫描结果在 ESI(+)模式下,三种染料均有很强的分子离子峰,三种染料母离子分别为 m/z213.4、m/z 315.0 和 m/z268.5,并优化了质谱参数,获得较高的灵敏度。再对以上母离子进行子离子扫描,通过优化碰撞能量等参数得到图 3 中三种染料的子离子扫描质谱图。三种染料的定量和定性子离子及相应的质谱参数如表 1。图 3 碱性桃红 T(a)、碱性嫩黄 O(b)和碱性橙(c)碰撞质谱图Fig.3 The(+)-ESI-MS/MS spectrum for safranine T(a),auramine O(b)and chrysoidine(c)2.3 色谱条件的优化在考虑色谱柱的耐酸性能基础上,本文试验了纯水、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸和 0.4%甲酸作为流动相的分离效果。实验发现,降低 pH 有利于改善碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 的峰形,提高色谱柱对三种染料的保留性能,同时在流动相中加入甲酸也有利于提高样品的离子化效率,实验最终确定流动相为 0.4%甲酸水溶液(pH 约 2.0)/甲醇。本方法采用了最新的超高效液相色谱技术和 1.7 Lm 粒径的色谱柱,具有极高的分离效率,三种染料在 4 min 内即完全分离(图 4),碱性橙和碱性嫩黄 O 的保留411第 4 期郑小严:超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T第 25 卷图 4 标准品总离子流图Fig.4 TIC for pure analytes1.chrysoidine;2.safranine T;3.auramine O.时间分别为 2.01、2.88 min。碱性桃红 T 具有 4 种同分异构体,其保留时间分别为 2.43、2.66、2.77、3.03 min,其中 2.66min 色谱峰灵敏度最高,作为定性定量峰。2.4 标准曲线与检出限配制不同浓度的标准溶液,分别绘制碱性橙、碱性嫩黄 O和碱性桃红 T 的标准曲线,分别得到碱性橙的线性方程为:y=58.5x+707.6,r=0.9985;碱性嫩黄 O 的线性方程为:y=455.7x+10180.1,r=0.9983;碱性桃红 T 的线性方程为:y=258.3x+11529.9,r=0.9966;三种染料的线性范围为0.01 0.5 Lg/mL。按信噪比为 3 计算,本方法中碱性橙、碱性桃红 T 和碱性嫩黄 O 的检出限分别为 0.6 Lg/kg、0.7 Lg/kg 和 0.3 Lg/kg。2.5 回收率和精密度试验选取蜜饯橄榄、黄瓜鱼、虾皮、花生米、腐竹、番茄调味粉 6 种样品进行加入回收试验,所选样品经检测均不含上述分析物。结果见表 2。表 2 不同食品中三种染料的加标回收率和精密度(n=6)Table 2 The recovery and precision in different food sample(n=6)DyeAdded(Lg/mL)Preserved olive fruitPond smeltDried small shrimpsRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Chrysoidine0.2675.78.986.06.882.74.50.6576.39.089.07.072.74.6Auramine O0.2776.39.174.79.181.18.60.6678.36.478.29.074.27.4Safranine T0.2679.57.782.36.278.74.60.6683.56.283.55.975.14.6DyeAdded(Lg/mL)Peanut kernelYubaTomato powdered flavouringRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Chrysoidine0.2687.94.281.75.675.07.70.6572.12.472.77.473.58.5Auramine O0.2784.56.474.16.387.86.00.6672.78.075.25.974.76.2Safranine T0.2679.63.277.44.591.16.50.6672.55.578.35.787.55.33 结论本文建立了食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 含量的超高效液相色谱-串联质谱联用检测方法。该方法可有效满足检验部门、食品卫生质量检验部门对食品中碱性橙、碱性嫩黄 O 和碱性桃红 T 的快速灵敏检测,为严格质量管理监控提供必要的技术支持,提高产品质量,保障人民身体健康,有利于预防、应对和攻克国际贸易的技术壁垒问题,以增强我国产品的国际竞争力,促进经济健康发展。参考文献:1 IARC.Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans,Supplement 7:Overall Evaluations of Carcino-genicity:an Updating of IARC Monographs R.International Agency for Research on Cancer,Lyon,France,1987,1-42:118.2 IARC.M onographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Man R.International Agency for Researchon Cancer,Lyon,France,1972,1:69.3 Kirsch P,Fleig I,Frentze-l Beyme R,Gembardt C,Steinborn J,Thiess A M,Seibert W,Wellenreuther G,Zeller H.Ar-beitsmed.Sozialmed.PrventivmedJ,1978,13:1.412第 4 期分 析 科 学 学 报第 25 卷 4 Searle C E,Teale J.T he Lancet J,1982,1(8271):564.5 GB2760-2007.Hygienic Standards for Uses of Food Additives(中华人民共和国食品添加剂卫生标准)S.2007.6 FENG J-i fu(冯济富),HUANG Ming(黄 明).Chinese Journal of Health Laboratory Technology(中国卫生监督杂志)J,2003,10(6):351.7 TIE Xiao-wei(铁小威),HUANG Ba-i fen(黄百芬),REN Y-i ping(任一平).Chinese Journal of Health LaboratoryTechnology(中国卫生检验杂志)J,2004,14(1):59.8 GU Yan(谷 岩),CUI Song-lin(崔松林),ZHOU Yu(周 宇),SUN Rui(孙 蕊),CHONG Ting(种 婷).Analysisand Testing Technology and Instruments,(分析测试技术与仪器)J,2006,12(4):202.9 LIN Qin(林 钦).Chinese Journal of Chromatography(色谱)J,2007,25(5):776.10 REN Y-i ping(任一平),HUANG Ba-i fen(黄百芬),T IE Xiao-wei(铁小威),SHOU Lin-fei(寿林飞).Proceedings ofthe 15th Symposium on Chromatography(第十五次全国色谱学术报告会论文集)C.2005,741.11 Wang X,Song G,Wu W,Zhao J,Hu Y.ChromatographiaJ,2008,68(7-8),659.12 LUO Me-i zhong(罗美中),LI B-i fang(李碧芳),HE Xiao-qing(何小青).Science and Technology of Food Industry(食品工业科技)J,2005,08:166.13 GAO Jie(高 洁),YIN Feng(尹 峰),HE Guo-liang(何国亮),XU Zh-i qiang(许志强).Chinese Journal of AnalysisLaboratory(分析实验室)J,2008,5:230.Simultaneous Determination of Chrysoidine,Auramine Oand Safranine T in Foods by Ultra Performance LiquidChromatography-Tandem Mass SpectrometryZHENG Xiao-yan*(Fuj ian Provincial Central Inspection Institute,Fuz hou 350002)Abstract:A method for simultaneous determination of chrysoidine,auramine O and safranine T in foodsby ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry has been developed.T he foodsamples were extracted by basified methanol followed by extraction with CH2Cl2and concentration.T heconcentrated mixtures were re-dissolved in acidified methanol and cleaned up with hexane.Ultraperformance liquid chromatography-tradem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was used to quantifythree dyes.The linear range were 0.01 0.5 Lg/mL(r 0.995).The recoveries ranged from 74.3%to91.1%,and the relative standard deviations were 2.4%9.4%(n=6).The detection limits were 0.6,0.3 and 0.7 Lg/kg for chrysoidine,auramine O and safranine T,respectively.Keywords:Ultra performance liquid chromatography-trandem mass spectrometry;Foods;Chrysoidine;Auramine O;Safranine T413