近红外量子点连接的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽段荧光探针对口腔鳞状细胞癌的活体可视化成像.pdf

4 9 8 华西 口腔医学杂志第 3 2卷第 5 期2 0 1 4年 1 0月 W e s t Ch i n a J o u r n a l o f S t o ma t o l o g y Vo 1 3 2 No 5 Oc t 20 1 4 h t t p：wwwh x kq y x z z n e t 【文章编号J 1 0 0 0 1 1 8 2(2 0 1 4)0 5-0 4 9 8 0 6 近红外量子点连接的精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸肽段 荧光探针对 口腔鳞状细胞癌的活体可视化成像 白云龙 黄昊 杨凯 唐洪 重庆医科大学附属第一医院口腔颌面外科，重庆 4 0 0 0 1 6 【摘要l 目的 探索用精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸(RG D)肽段连接的近红外量子点荧光探针对口腔鳞状细胞癌(OS C C)的原位可视化成像情况。方法将含有R G D序列的肽段与发射波长为8 0 0 n m的近红外量子点(Q D8 0 0)偶联，制备Q D 8 0 0 R G D 荧光探针。将人颊鳞状细胞癌B c a C D 8 8 5 细胞植入裸鼠颊部皮下建立O S C C 模型。用Q D 8 0 0-R G D 探针和C D 1 0 5 单克隆抗体对O S C C 冰冻切片行直接免疫荧光双重染色，用激光扫描共聚焦显微镜观察Q D 8 0 0 R G D探针与肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素0【，p 的结合情况。将Q D8 0 0 R GD 探针通过尾静脉注射J L OS C C 模型 动物，在不同时间点通过活体成像观察Q D 8 0 0 R G D 对O S C C 活体原位可视化动态成像情况。在1 2 h 后处死荷瘤鼠取 出肿瘤，检 J QD8 0 0 R GD 在体内与肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素 p 的结合情况。结果 Q D8 0 0 一 R G D探针 在体内和体外均能与o s c c 瘤新生血管内皮细胞表达的整合素，p，特异性靶向结合。静脉注射Q D 8 0 0 R G D 探针后 能对体内O S C C 进行清楚地可视化成像，在注射Q D 8 0 0 R G D 后0 5 6 h 内肿瘤成像最完整，信噪比最高，9 h 时肿瘤 荧光强度显著减低，但在1 2 h 时仍能看到明显的肿瘤成像。结论 以肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素1 3 为靶 点，利用Q D8 0 0 RG D 探针经静脉注射后能对OS C C 进行清晰地可视化成像，在O S C C的诊断和个体化治疗等方面有 巨大的发展前景。I 关键词】口腔鳞状细胞癌；量子点；整合素0【p ；精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸肽段；成像 I 中图分类号】R 7 3 9 8 【文献标志码l A 【d o i l 1 0 7 5 1 8 h x k q 2 0 1 4 0 5 0 1 7 I n s i t u v i s u a l i ma g i n g o f o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma i n mi c e b y u s i n g n e a r-i n f r a r e d q u a n t u m d o t s c o n j u g a t e d w i t h a r g i n i n e-g l y c i n e a s p a r t i c a c i d p e p fi d e fl u o r e s c e n t p r o b e s B a i Y u n l o n g，Hu a n g Ha o，辔K a i，T a n g Ho n g(De p t o f Or a l a n dMa x i l l ofa c i a l S u r g e r y，T h e f A f fil i a t e dHo s p i t a l ofC h o n g q i n gMe d i c a l U n i v e r s i ty，C h o n g q i n g4 0 0 0 1 6，C h i n a)【Ab s t r a c t】Ob j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e i n s i t u v i s u a l i z a t i o n u s i n g n e a r-i n f r a r e d q u a n t u m d o t s(Q Ds)c o n j u g a t e d w i t h arg i n i n e g l y c i n e-a s p a r t i c a c i d(R G D)p e p t i d e fl u o r e s c e n t p r o b e s i n o r a l s q u a mo u s c e l l c arc i n o ma(os c c)Me t h o d s Q Ds wi t h e mi s s i o n wa v e l e n g t h o f 8 0 0 n l n(Q DS 0 0)w e r e c o n j u g a t e d wi t h R G D p e p t i d e s t o p r o d u c e Q D8 0 0-R G D fl u o r e s c e n t p r o b e s Hu ma n OS CC c e l l 1 i n e Bc a CD8 8 5 wa s i n o c u l a t e d i n n u d e m i c e c h e e k s t o e s t a b l i s h OS CC mo u s e mo d e l s F r o z e n Bc a CD8 8 5 t u mo r s l i c e s w e r e i mmu n o f l u o r e s c e n c e d o u b l e s t a i n e d b y u s i n g QD 8 0 0 R G D and C D1 0 5 mo n o c l o n a l a n t i b o d y a n d we r e o b s e r v e d u s i n g a l a s e r s c ann i n g c o n foc a l mi c r o s c o p e Q D8 0 0-RG D wa s i e c t e d i n t o t h e OS C C mo d e l s t h r o u g h t h e t a i l v e i n s，a n d t h e i n s i tu v i s u a l i z a t i o n wa s a n a l y z e d a t d i f f e r e n t t i me p o i n t s T h e mi c e w e r e s a c r i fi c e d 1 2 h a f t e r i n j e c t i o n t o i s o l a t e tumo r s f o r the e x v i v o a n a l y s i s o f p r o b e l o c a l i z a t i o n i n t h e t u mo r s Re s u l t s Q D8 0 0-R G D s p e c i fi c a l l y t arg e t e d t h e i n t e g r i n a v 13 3 e x p r e s s e d i n t h e e n d o t h e l i a l c e l l s o f t u mo r a n g i o g e n i c v e s s e l s i n v i t r o a n d i n v i v o，p r o d u c i n g c l e a r tumo r flu o r e s c e n c e i ma g e s a f t e r i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n T h e mo s t c o mp l e t e tumo r i ma g e s w i t h ma x i ma l s i g n a l-t o n o i s e r a t i o s w e r e o b s e r v e d 0 5 h t o 6 h a f t e r i n j e c t i o n o f t h e p r o b e a n d s i gni fi c ant l y r e d u c e d 9 h a f t e r t h e i n j e c t i o n H o w e v e r，t h e tumo r i ma g e wa s s t i l l c l e a r l y v i s i b l e a t 1 2 h Co n c l u s i o n Us i n g i n t r a v e n o u s l y i n j e c t e d Q D8 0 0-R G D g e n e r a t e s h i g h q u a l i t y O S C C i ma g e s w h e n i n t e g r i n a v 13 3，w h i c h i s e x p r e s s e d i n t h e e n d o t h e l i a l c e l l s o f t u mo r ang i o g e n i c v e s s e l s，i s u s e d a s t h e t a r g e t T h e t e c h n i q u e o f f e r s g r e a t p o t e n t i a l i n 【收稿 日期【基金项 目 【作者简介【通讯作者 2 0 1 3 1 2-2 5；l 修回日期】2 0 1 4-0 4 2 1 国家自然科学基金资助项目(8 1 1 7 2 2 0 5)白云龙，硕士，E ma i l：2 7 5 0 4 3 5 7 8 q q c o rn 杨凯，教授，博士，E ma i l：c q f y y k a l i y u n c o m t h e d i a g n o s i s a n d i n d i v i d u a l t r e a t me n t o f OS CC【Ke y w o r d s】o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma；q u a n tum d o t s；i n t e g r i n p 3；ar g i n i n e-g l y c i n e a s p a r t i c a c i d p e p t i d e；i ma g i n g 华西口腔医学杂志第3 2 卷第5 期2 0 1 4 年 1 0 月 We s t C h i n a J o u rna l o f S t o ma t o l o g y Vo 1 3 2 No 5 Oc t 2 0 1 4 h t t p：w ww h x k q y x z z n e t 4 9 9 外科手术是治疗口 腔鳞状细胞癌(o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma，OS C C)的主要方法，对肿瘤“量 体裁衣”不多不少地切除是提高患者生存率和保存 功能的关键。由于 目前在手术 中尚不能实时可视化 看到肿瘤 边界，临床 医生对肿瘤 的切 除是 以术 前 C T、磁共振(ma g n e t i c r e s o n a n c e i ma g i n g，MR I)等影像为参考，结合术中触摸癌组织质地的改变来 确定切除边界；有时根据个人经验，术 中对局部估 计有残存癌灶的边缘组织进行冰冻病理检查。目前 这些方法使医生在术中不能准确评估是否对肿瘤真 正达到 了“量体裁衣”切除的 目的，因此，探索对 体内肿瘤进行实时可视化的成像方法，使临床医生 在手术 中能实时可视化看到肿瘤边界，对病变进行 准确切除是提高患者生存率和生存质量的关键技术 之一。近年来，基于纳米技术发展起来的近红外量 子点(q u a n t u m d o t s，QDs)的荧光具有较强的组织 穿透力，在对癌症实时可视化成像方面显示出独特 的优势 1 _ 5 。Q Ds 是一种 由 族元素或 V族元素组成 的直径为1 l 0 n m的半导体纳米微晶体，与传统的 有机荧光染料和荧光蛋白相比，Q D s 具有独特的光 学特性3 _】：Q D s 荧光强度大，光稳定性好，不易发 生光漂白，尤其是发射波长在7 0 0 9 0 0 n m 范围内的 近红 I Q Ds，其荧光不仅具有较强 的组织 穿透性，而且活体组织对此光谱范围内的荧光吸收也最小，可 以避免组织 自发荧光的干扰，特别适合长时间的 生物成像研究 1-3。目前有研究6 _7 1证明，癌症的发生发展必需依赖 肿瘤新生血管生成。由于整合素呸，p 高表达于所有肿 瘤新生血管内皮细胞，而在正常静止的血 管内皮细 胞低表达【s-，同时，整合素，p 能够特异性地与含有 精氨酸一 甘氨酸 天冬氨酸(a r g i n i n e g l y c i n e a s p a r t i c a c i d，R G D)序列的肽段结合【J o”，因而，理论上 只需将Q D s 连接R G D 后制备Q D s R G D 探针就可对体 内肿瘤进行可视化成像。本研究将人颊鳞状细胞癌 细胞株B c a C D 8 8 5 植入裸鼠颊部皮下建立OS C C 模型，用发射波长为8 0 0 n i n 的近红 b Q Ds 与R G D 肽段偶联，制备Q D8 0 0 RG D探针，通过尾静脉注入O S C C 模 型 体内，观察Q D 8 0 0 R G D 探针对OS C C 原位活体可视 化成像情况，为探索基于整合素，p 为靶点的近红外 Q D s J 于O S C C 的个体化诊断和治疗提供依据。1 材料和方法 I 1材料 1 1 1 主要试剂和仪器Q D 8 0 0 抗体偶联试剂盒(I n v i t r o g e n 公司，美国)；人颊鳞状细胞癌细胞株 B c a C D8 8 5(四川大学 口腔疾病研究 国家重点实验室 提供)；C D 1 0 5 单克隆抗体(B io l e g lm d 公司，美国)，R G D 肽段(吉尔生化上海有限公司)；冷冻离心机(Z 2 3 3 MK 2 型，H E R ML E 公 司，德 国)，激光扫 描共聚焦显微镜(1 a s e r s c a n n i n g c o n f o c a l mi c r o s c o p e，L S C M)(T C S S P 5 型，L e i c a 公司，德国)，活体 成像系统(Ma e s t r oE XI V I S，C r i 公 司，美国)。1 1 2 实验动物S P F 级雄 B AL B C n u n u 裸 鼠1 5 只，鼠龄6 8 周，质量2 O 2 5 g，购 自重庆医科大学 实验动物中心。恒温恒湿条件下饲养裸 鼠，垫料、饲料和饮水均经灭菌处理。所有实验操作程序均经 过重庆医科大学实验动物研究所实验动物使用管理 委员会批准。1 2 实验方法 1 2 1 Q D 8 0 0 R G D的制备根据Q D 8 0 0 抗体偶联试 剂盒实验手册提供的实验步骤进行制备，分为4 步。1)QD s 的活化和洗脱：浓度为 1 0 mmo l L 的双功能 琥珀酰亚胺 4 一(N 甲基马来酰胺)1 碳酸I s u c c i n i mi d y 1-4 一(N-ma l e i mi d o-me t h y 1)c y c l o h e x a n e 一 1-c a r b o x y-l a t e，S MC C 溶液预热1 5 mi n(3 7 o C)后取出1 4“L 加入1 5 m L 离心管内，然后加人浓度为4 g mo l-L 的 QD8 0 0 液 1 2 5 p L，均匀混合，在室温下活化反应1 h 后用 脱盐柱洗脱 反应样本，收集有 色 的洗脱 液约 5 0 0 u L。2)R GD的还原和分离：环状RG D肽段粉 剂溶于3 0 0 u L、p H 值为7 2 7 4 的P B S 中，调整到质 量浓度为1 g L ，然后把6 1 g L 浓度为1 too l L。的二 硫苏糖醇液加入R G D 溶液中，混合均匀，室温下还 原反应3 0 min 后加入2 0 u L 染料指示标记液，用脱盐 柱分离反应样本，从洗脱 出的第l 滴着色样本开始收 集，共收集 5 0 0 g L。3)偶联和灭 活：将通过上述 步骤收集的两种洗脱液混合均匀，室温下偶联反应 1 h，然后加人浓度为1 0 mmo l L 的2 巯基乙醇3 ，均匀混合后室温下灭活反应3 0 mi n。4)浓缩和纯化：将1 mL 偶联灭活后 的样本加入2 个超滤离心装置管 中，每管0 5 m L，超速离心1 5 m in(7 0 0 0 r m i n-)，收集各超滤离心膜内 lJ 2 0 的偶联样本溶液，然后 用P i e r c e 柱行色谱分离，得到纯化的QD8 0 0 一 R GD。根据产品说 明书提供 的消光系数和测量波长两个参 数，求出最后纯化的Q D 8 0 0 R G D 浓度，其计算公式 为：A=e c l，其中 为吸光度值，s 为消光系数，c 为 浓度，为光程。1 2 2 体外免疫荧光双重染色检 IJ Q D8 0 0 R GD与整 合素 p 的连接取对数生长期的B c a C D 8 8 5 细胞，0 2 5 胰蛋白酶消化，4。(=下8 0 0 r mi n-离心4 mi n，然 后将细胞重悬于无菌P B S 中。将含有2 x 1 0 6 J B c a C D 8 8 5 华西 口腔 医学杂 志第 3 2卷第 5期2 0 1 4年 1 O月 5 0 0 We s t C h i n a J o u rna l o f S t o ma t o l o g y Vo 1 3 2 No 5 Oc t 2 0 1 4 h t t p：w wwh x k q y x z z n e t 细胞的P B S 悬液0 2 mL 注射于裸 鼠右侧颊部皮下，共注射6 只，建立O S C C 模型。3 周后断颈处死实验 动物，解剖取出肿瘤，用冰冻切片包埋剂包埋并速 冻，低温(2 0 c C)下切割为7 u m厚的冰冻组织切 片，冷丙酮固定1 0 mi n，P B S 清洗3 次后用1：1 0 山羊 血清在室温下封闭1 5 mi n。实验分为3 组。实验组：在切片上滴加浓度为1 0 0 n m o l L。的Q D 8 0 0 R G D 液 1 0 0 ，4过夜，P B S 洗3 次后滴加稀释度为1：2 0 0 的大鼠抗小鼠C D1 0 5 单克隆抗体，孵育3 0 m i n，P B S 冲洗3 次，然后滴加 1：l 0 0 的兔抗大 鼠异硫氰酸荧 光素(fl u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e，F I T C)荧光二抗，室温下避光孵育3 0 mi n，P BS 冲洗3 次后滴加4 ，6 一 二 脒基 2 一 苯基吲哚(4 ，6 d i a mi d i n o 一 2 一 p h e n y l i n d o l e，D A P I)，甘油封片。对照组 I：在切片上滴 J I Q D8 0 0 替代Q D 8 0 0 R G D，其余步骤与实验组相同。对照组 I I：先加入质量浓度为2 g mL 的R GD 溶液2 0 0 L 封闭整合素c c、p ，2 h 后用P B S 冲洗3 次，然后滴加 Q D8 0 0 一 R G D，其余步骤与实验组相同。在L S C M(激发光和发射光波长分别为4 0 5 n l 1 和7 5 0-8 0 0 n n 1)下观察各组的QD8 0 0 RG D与整合素0【，p 的靶 向结合 情况。1 2-3 肿瘤活体可视化成像观察按1 2 2 描述的方 法建立O S C C 裸鼠模型，共9 只，每日观察肿瘤生长 情况，待9 只裸鼠全部成瘤，3 周时肿瘤直径达0 8 1 2 c；m时开始实验。实验分为3 组，每组3 只。实验 前用2 戊巴比妥(4 0 mg k g )行腹腔注射麻醉。实验组：通过尾静脉注射 1 0 0t L 含1 5 0 p mo l QD8 0 0 的QD8 0 0 一 R G D。对照组 I：通过尾静脉注射 1 0 0 QD8 0 0(含量为 1 5 0 p mo 1)。对照组 I I：通过尾静 脉先注射2 5 0 Ix L 质量浓度为2 g L 的R G D，2 h 后再 尾静脉注射1 0 0“L 含 1 5 0 p mo l QD 8 0 0 的Q D 8 0 0-R G D。静脉注射Q DS 0 0 R G D或Q DS 0 0 后0 5、l、3、6、9、1 2 h 后分别用活体成像系统Ma e s t r o E X I V I S(激发 光、发射光波长分别为6 5 5、8 0 0 n m)进行活体成像 检测。曝光时间5 0 m s，采集时间3 0 S，像素1 0 2 4 x 1 0 2 4。图像采集后用Ma e s tr o E XI S 提供的Ma e s t r o 2 1 0 0 软件进行图像处理和数据分析，分别显示自发 荧光和目 标荧光信号，然后测量其荧光值，计算荧 光信噪比值(肿瘤荧光强度与背景 自发荧光强度之 比)。将每种信号添加伪色彩，本研究将 自发荧光 设置为绿色，目标荧光信号设置为红色，最后将两 种色彩叠加。1 2 4 体内免疫荧光检 I Q D 8 0 0 R G D 与整合素 p 的连接实验组和对照组裸鼠分别在1 2 h 活体成像完 毕后断颈处死，立即解剖取出肿瘤，切分为2 块，其 中一块行常规石蜡包埋，另一块用冰冻切 片包埋剂 包埋并速冻，在 2 0下切割为7 g u n 厚的组织切片，然后用大 鼠抗小 鼠CD1 0 5 单克隆抗体在室温下孵育 3 0 mi n，P BS 冲洗3 次后滴加兔抗大 鼠F I T C 荧光二抗(1：1 0 0)，室温下孵育3 0 mi n，P BS 冲洗3 次，然 后使用D A P I 染细胞核5 min，P B S 冲洗3 次，再将细 胞核蓝染和肿瘤新生血管绿染后的肿瘤组织切 片置 于L S c M(激发光和发射光的波长分别为4 0 5 a m和 7 5 0 8 0 0 n m)下观察Q D8 0 0 与肿瘤新生血管 的靶向 结合情况。1-3 统计学分析 采用S P S S 1 3 O 统计学软件对实验数据进行 分 析，多均数 间比较采用方差分析，检验水准为双侧 a=0 05 2 结 果 2 1 Q D8 0 0 一 R G D的制备 收集最终纯化的Q D8 0 0 一 R GD，然后根据产 品 说明书提供 的5 5 0 n m下的消光系数，证明本实验获 得的QD8 0 0 一 R GD 浓度为1 2 m0 l L 。2 2 Q D 8 0 0 一 R G D 与肿瘤新生血管表达的整合素，p 在 体外特异性结合 实验组和对照组肿瘤切片在L S C M下可清晰看 见蓝染的肿瘤细胞核和呈管状或条索状绿染的肿瘤 新生血管(图1)。实验组绿染的肿瘤新生血管内皮 处可见明显 的Q D8 0 0 色荧光，而对照组 I 和对照 组 中均未观察 IJ Q D8 0 0 荧光(图1)。从该结果可以看出，Q D8 0 0 不能与肿瘤新生血管 结合，而QD 8 0 0 RG D虽能与肿瘤新生血管结合，但 不能与被R G D 封闭整合素0【、p 后的肿瘤新生血管结 合；这证明R G D 肽段与Q D 8 0 0 连接后，R G D 肽段仍 能特异性识别肿瘤新生血管 内皮细胞表达 的整合素 0【、p，从而使QD8 0 0 结合 到肿瘤新生血管内皮细胞 表面。2 3 Q D 8 0 0 一 R G D 对体内肿瘤活体可视化成像 实验组动物静脉注射Q D 8 0 0 R G D 0 5 h 后，肿 瘤部位可检测到明显的荧光信号，0 5 6 h 期间肿瘤 的荧光信号最完整(图2)，与肿瘤大小相对应。注 射后不同时间可视化成像的荧光信噪比见图3：荧光 信噪比在1 h 时最高，但0 5、1、3、6 h 4 个时间点之 间荧光信噪比值的差异无统计学意义(P 0 0 5)(图 3)。9 h 时肿瘤的荧光信号明显减弱，荧光信噪比 值也显著低于1 h 时(P 0 0 5)；1 2 h 时荧光信号进 一步减弱，但仍能观察到明显的肿瘤荧光成像(图 2)。对照组 I 和 在0 5 1 2 h 均未检测到明显的肿 瘤荧光信号。华西 口腔 医学 杂志第 3 2卷第 5 期2 0 l 4年 1 0月 We s t C h i n a J o u r n a l o f S t o ma t o l o g y V o 1 3 2 No 5 Oc t 2 0 1 4 h t t p：www h x k q y x z z n e t 5 0 1 左：实验组；中：对照组 I；右：对 照组。红 色荧光为QD 8 0 0；蓝染者 为肿瘤细胞核；绿染者 为肿瘤新生血管。冈 l Q O 8 0 0 R G D 探针和C D1 0 5 单克隆抗体对B c a C D 8 8 5 1J 瘤冰冻切片的免疫荧光双重染色成像L S C M 2 0 0 F i g l I mmu n o fl u o r e s c e n c e d o u b l e s t a i n i n g i ma g e s o f B c a C D8 8 5 t u mo r f r o z e n s l i c e s s t a i n e d wit h QD8 0 0 一 R GD a n d C D1 0 5 mo n o c l o n a l a n t i b o d y LS CM X 2 0 0 上：实验组；中：对照组 I；下：对照组；从左到右依次 为注射后O 5、1、3、6、9、1 2 h。红 色荧 光为肿瘤 成像；绿 色为 自发背景荧光 图 2 QD8 0 0 一 R GD静脉注射后不同时间 口腔鳞状细胞癌的可视化成像 F i g 2，7 v i v o v i s i b l e i ma g e s o f o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma t u mo r b e a r i n g mi c e a t d i f f e r e n t t ime s a f t e r i n j e c t i o n o f QD8 0 0 一 R GD 地 图 3 不同时间 L I 腔鳞状细胞癌可视化成像 的荧光信 噪比 F i g 3 Th e c h an g e s o f t h e s i g n a l-t o -n o i s e r a t i o a t diffe r e n t t i me p o i n t s t b r in v iv o ima g i n g o f o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n oma 2 4 Q D 8 0 0 R G D 在体内与肿瘤新生血管表达的整合 素13 13的靶向结合 实验组和对照组分别静脉 注射QD8 0 0 R GD和 QD8 0 0 1 2 h 后肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色见图4。实验组和对照组肿瘤 的冰冻切 片在L S C M下可清 晰 看到蓝染的肿瘤 细胞核和呈管状或条索状绿染的肿 瘤新生血管(图4)。实验组瘤体切 片中绿染 的肿 瘤新生血管处可见有明显 的Q D8 0 0 I色荧光 而在 对照组 I 和对照组 的瘤体切片中均未见有QD8 0 0 红色荧光(图4)，与体外实验结果相同。该结果证 明，Q D8 0 0 一 R GD在体 内对肿瘤新生血管 内皮细胞表 达的整合素0【1 3 具有 良好的特异性靶 向结合能力。5 0 2 毕西 口腔医学 杂志第 3 2卷第 5期2 0 1 4年 l O月 W e s t Ch i n a J o u rn a l o fS t o m a t ol o g y Vo 1 3 2 No 5 Oc t 2 01 4 h t t p：www h x k q y x z z n e t 左：实验组；中：对照组 I；右：对照组。红色和黄色点状荧光为Q D 8 0 0(实验组中)；蓝染者为肿瘤细胞核；绿染者为肿瘤新生血管。图 4 静脉注射Q D 8 0 0 一 R G D 或Q D S 0 0 1 2 h 后肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色成像L S C M 2 0 0 F i g 4 l mmu n o fl u o r e s c e n c e s t a i n i n g i ma g e s o f ff o z e n t u mo r s l ic e s 1 2 h o u r s a ft e r i n t r a v e n o u s l y i n j e c t i o n o f QD 8 0 0 一 R GD o r QD8 0 0 L S CM x 2 0 0 3 讨 论 目前 利用Q Ds 进行肿瘤体内成像的常用方法是 利用癌细胞表面高表达或特异性表达 的抗 原或受体 等分子为靶点，将Q D s 与相应的抗体和配体连接，利 用抗 原和抗体或受体和配体能特异性结合的原理实 现癌症的活体成像【I，。S h i 等 11】将Q D s 与前列腺癌 细胞特异性膜抗原抗体(p r o s t a t e s p e c i fi c me mb r a n e a n t i g e n，P S MA)偶联，制备Q D P S MA探针，经静 脉注入荷前列腺癌 的小鼠体内以获得肿瘤的可视化 成像。T a d a 等 1 3】将近红外ODs 与抗人类表皮生长因 子受体2(h u ma n e p i d e r ma l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 2 H E R 2)单克隆抗体连接，制备靶向性近 P b QDs 荧 光探 针，对高表 达HE R2 的乳 腺癌 进行 可视 化成 像。本课题组在前期研究 中，根据人OS CC 细胞株 Bc a CD8 8 5 高表达表 皮生长 因子受体(e p i d e r ma l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r，E G F R)的特性，用近红P Q D s 与表皮生长因子(e p i d e rm a l g r o w t h f a c t o r，E GF)单 克隆抗体连接，制备近红外O D8 0 0 一 E G F R mAb 探针，静脉注入OS C C b鼠体 内，获得 了清楚的肿瘤可视 化成像f 】。这种可视化成像虽然可 以获得肿瘤组织 清晰的图像，但也存在缺点。一方面，由于不同癌 细胞高表达或特异性表达的抗原或受体类型差异很 大，因此不同癌症需要制备不同的靶向一 Q Ds 探针；另一方面，同一肿瘤细胞也具有异质性，常会降低 标记率。目前研究r6 _ 7 1 证明，癌症的发生发展必需依 赖肿瘤新生血管生成。因为整合素C t、p 高表达于所 有肿瘤新生血管内皮细胞，而在正常静止的血管内 皮细胞则为低表达或不表达 s 】，同时整合素0【p 能 够特异性地与含有RG D的肽段结合 i o _ 1 l】1，所以理论 上只需要制备Q D s 连接R GD的一种探针(Q D R G D)就可对不同癌症进行可视化成像。本研究以肿瘤新生血管内皮细胞特异性高表达 的整合素c【p 为靶点，采用临床常用的静脉途径将 Q D 8 0 0 一 R G D 注入O S C C 裸鼠模型体内，经肿瘤活体 成像和肿瘤切片染色检查，结果表明，Q D 8 0 0 一 R G D 在体内外均能对肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合 素0【、，p 进行靶向结合，通过X Q D 8 0 0 荧光的检测从而 获得清晰的体内肿瘤的可视化成像。本研究发现，注射QD 8 0 0 一 R GD 3 0 mi n 后能清晰看到完整的肿瘤成 像，成像的大小和荧光强度从0 5 6 h 无明显变化，9 h 时肿瘤成像开始变小，荧光强度显著减低，提示 静脉注射QD 8 0 0 R G D对口腔鳞状细胞癌成像检测的 最佳时间为注射后0 5 6 h 的这一时间段内，但在1 2 h 时仍能看到明显的肿瘤成像。随着时间推移，肿瘤 的荧光强度逐渐减低，可能是由于体内溶酶体酶对 Q D s 探针表面配体及涂层的逐渐降解，导致结合能 力逐渐下降以及Q Ds 荧光 的逐 渐淬灭所致。本研究 未发现实验动物有任何急性毒性反应和异常的行为 表现。本研究是在有皮肤屏障的存在下获得了对体内 肿瘤清晰的可视化成像，如果在实际手术中 由于 肿瘤暴露在开放的手术创面下，有可能会获得更加 清楚的成像。由于本研究是基于对os cc n 瘤新生 血管成像以达到对肿瘤的可视化成像 目的，还需要 进一步从细胞水平验证以肿瘤新生血管成像为指导 对肿瘤完整切除的具体精确性。I 参考文献l 1 Y a n g K，C a o Y A，S h i C，e t a 1 Q u a n t u m d o t b a s e d v i s u a l i n v i v o i ma g i n g f o r o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma i n mi c e O r a l O n c o l，2 0 1 0，4 6(1 2)：8 6 4 8 6 8 2 C a o Y，Y a n g K，L i Z，e t a 1 Ne ar-i n f r a r e d q u a n t u m-d o t b a s e d n o n i n v a s i v e i n v i v o i ma g i n g o f s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma 华西 口腔 医学杂 志第 3 2 卷第 5 期2 0 1 4年 1 0月 We s t C h i n a J o u r n a l o f S t o ma t o l o g y Vo 1 3 2 No 5 Oc t 2 0 1 4 h t t p：wwwh x k q y x z z n e t 5 0 3 U1 4 J Na n o t e c h n o l o g y，2 0 1 0，2 1(4 7)：4 7 5 1 0 4 Z r a z h e v s k i yP，Ga oX Mu l t i f u n c t i o n a l q u a n t u m d o t sf o rp e r-s o n a l i z e d me d i c i n e J Na n o T o d a y，2 0 0 9，4(5)：4 1 4 4 2 8 Wa l l i n g MA，No v a k J A，S h e p a r d 瓜 Qu a n t u m d o t s f o r l i v e c e l l a n d i n v i v o i