构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型.pdf

中国组织工程研究与临床康复第7 4 誊第1 5 嬲2 0 1 0 0 4 0 9 出版J o u r n a lo fC l i n i c a lR e h a b i l i t a t i v eT i s s u eE n g i n e e r i n gR e s e a r c hA p r i l9，2 0 1 0V o L1 4，N o 1 5构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡I I 型上皮细胞的方法及模型：l：|：郑金旭，黄振杰，汤艳，丁明辎槲目螭赫目目#黼$目黼黼熵m$#踹蛳#械#镕剿 黼黼蛹#m W W 酣$酬 滞 姆$W W N 嘲镕斓鲫 瓣磷*猕I s o l a t i o n，p r i m a r yc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no ft y p e1 1a l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l sf r o mm i c eZ h e n gJ i n-x u，H u a n gZ h e n _ j i e，T a n gY a n，D i n gM i n gA b s t r a c tB A C K G R O U N D：T y p eI Ia l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l s(A E CI I)p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nl u n gd e v e l o p m e n ta n dr e g u l a t i o no f 1 u n gf u n c t i o n 1 ti sc l o s e l yr e l a t e dw i t ht h eg e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fp u l m o n a r yf i b r o s i s 1 u n gc a n c e ra n ds oo n 1 no r d e rt om a k ea n仃v i t r os t u d yo ft h e s ed i s e a s e s as t a b l ea n de f f e c t i v ec e l Im o d e If o ri s o l a t i o n p r i m a r yc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no fA E CI Is h o u l db ee s t a b l i s h e d O B J E C T l V E：T Od e v e l o par e l i a b l em e t h o df o rt h ei s o l a t i o n，p u r i f i c a t i o n，p r i m a r yc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no fA E CI If r O mm i c e，a n dp r o v i d eaf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fp u l m o n a r yf i b r o s i sa n dl u n gc a n c e r M E T H O D S：T h el u n gt i s s u eo fm i c ew a sd i g e s t e dw i t hl o w-c o n c e n t r a t i o nt r y p s i na n dc o l l a g e n a s eI T h a ti s，l u n gt i s s u e so fm i c ew e r ec u ti n t os m a l lp i e c e s，d i g e s t e dw i t ht r y p s i n，a n dt e r m i n a t e dt h ed i g e s t i o nb ya d d i n gD M E Mc o n t a i n i n gf e t a lb o v i n es e r u m T h ec e l l sw e r ed i g e s t e do n c ea g a i nu s i n gt r y p s i n a n da d d i n gc o l l a g e n a s eIa f t e rt e r m i n a t i o n(函A E C1 1w a sp u r i f i e db yd i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o na n di m m u n ea d h e r e n c ef o rp r i m a r yc u l t u r e T h ep n e u m o c y t e ss u s p e n s i o nw a si n c u b a t e di nI g Gc u l t u r ep l a t e，a n dl i q u i dc o n t a i n i n gn o n-a d h e r e n tc e l l sw e r eo n c ea g a i nc u l t u r e di nI g Gc u l t u r ep l a t e，t h e ns u p e r n a t a n tw e r ea b a n d o n e d，a n dt h ec e l l sw e r ec u l t u r e dj nc u l t u r ed i s ha n dc u l t u r ep l a t e T h em o r p h o l o g ya n dg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fp r i m a r i l yc u l t u r e dA E C1 1w e r eo b s e r v e db ya nj n v e r t e dm i c r o s c o p e；t h ey i e l d p u r i t ya n dv i a b i l i t yo fA E C1 1w e r ed e t e r m i n e d A E C1 1w a si d e n t i f i e db yi m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n gs u d a c t a n ta p o p r o t e i nA(S P-A)a n dS P-C，a n dt h es p e c i f i cc e l Is t r u c t u r ew a so b s e r v e du n d e rat r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e R E S U L T SA N DC O N C L U S l O N：B yt h i sm e t h o d。a na m o u n to f(4 8+1 2)x 1 0 5A E C1 1w e r eh a r v e s t e df r o me a c hm o u s ew i t hap u r i t yo f(8 5 土2 4)a n dav i a b i l i t yo f(9 2 2 4)U n d e ra ni n v e r t e dm i c r o s c o p e，A E CI Ii np r i m a r yc u l t u r es h o w e das h a p eo fr o u n do rc u b ea n da ni s l a n d l i k eg r o w t h T h ej m m u n o c y t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a tt h ec y t o p l a s mp r e s e n t e db u f f yS P Aa n dg r e e nS P C T y p i c a If e a t u r e so fA E CI Ii n c l u d i n gI a m e l l a rb o d i e sa n dm i c r o v i l l ic o u l db es e e nu n d e rat r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e T h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t，A E CI ro fg r e a ta m o u n ta n dh i g hp u r i t yc o u l db eo b t a i n e db yt h i sm e t h o d，w h i c hm e e t st h er e q u i r e m e n to fac e l lm o d e le s t a b l i s h i n gf o rf u r t h e r nv i t r os t u d y Z h e n gJ X，H u a n gZ J，T a n gY，D i n gM I s o l a t i o n，p r i m a r yc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no ft y p eI Ia l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l sf r o mm i c e Z h o n g g u oZ u z h iG o n g c h e n gY a n j i uy uL i n c h u a n gK a n g f u 2 0 1 0；1 4(1 5 1：2 7 6 1 2 7 6 4【h t t p：w w w c r t e r c nh t t p：e n z g l c k f c o r n】摘要背景：肺泡I I 型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用，它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系，为了对这些疾病进行体外实验研究，必须对肺泡I I 型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型。目的：建立一套可靠的小鼠肺泡I I 型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法，为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础。方法：用低浓度胰酶联合I 型胶原酶消化法，分离小鼠肺组织细胞成分。取出小鼠肺组织，剪成小块，加入胰蛋白酶，移出细胞悬液，加入含胎牛血清的D M E M 中止消化；同法用胰蛋白酶再消化1 次中止消化后加入I 型胶原酶，再中止消化。经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡I I 型上皮细胞，进行原代培养。将肺细胞悬液接种入包被小鼠I g G 的培养皿中培养，吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠I g G 的培养皿中培养，吸出未黏附细胞，去上清，重悬沉淀，将细胞接种于培养皿和培养板中培养。倒置显微镜观察细胞形态及生长特点，测定肺泡I I 型上皮细胞产量、纯度及活力，免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A 和肺泡表面活性蛋白C 的表达，透射电镜鉴定肺泡I I 型上皮细胞特异性细胞结构。结果与结论：用此方法，每只小鼠获得肺泡I I 型上皮细胞(4 8+1 2)1 0 5，纯度达至U(8 5 0+2 4)，细胞活力为(9 2 0+2 4)，倒置显微镜下原代肺泡I I 型上皮细胞呈圆形或立方形，细胞质内有大量反差明显的细小颗粒，细胞为岛状生长方式；免疫细胞化学鉴定，肺泡表面活性蛋白A 呈棕黄色，肺泡表面活性蛋白C 呈绿色，均定位表达于细胞浆；透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛。证实利用胰酶联合胶原酶消化，差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的A E CI I，能满足一般的体外实验要求。关键词：小鼠；肺泡I I 型上皮细胞；原代培养；分离；鉴定：心肺组织工程d o i：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 3-8 2 2 5 2 0 1 0 1 5 0 2 4郑金旭，黄振杰，汤艳，丁明构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡i I 型上皮细胞的方法及模型 J】中国组织工程研究与临床康复，2 0 1 0，1 4(1 5)：2 7 6 1-2 7 6 4 h t t p：w w w c r t e r o r gh t t p：c n z g l c k f c o r n 0 引言肺泡是肺脏进行气体交换的基本单位，其表面被覆的单层肺泡上皮主要由肺泡I 型和I I|S s N16 7 3-8 2 2 5C N2 1 15 3 9，Rc o D E N：z L K H A H型上皮细胞构成。肺泡I I 型上皮细胞(t y p eI Ia l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l，A E CI I)仅衬附肺泡壁表面积的5 1 0 但却构成肺泡细胞群的6 0，它又被称为“颗粒性肺泡细胞”和“分泌细胞”，是一种多功能细胞，对维持肺泡结D e p a r t m e n to fR e s p i r a t o r yM e d i c i n eA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fJ a n g s uU n i v e r s i t y，Z h e n j i a n g2 12 0 0 1 J i a n g s uP r o v i n c e，C h i n aZ h e n gJ i n-x u D o c t o r,P r o f e s s o r,D o c t o r a Is u p e r v i s o r,C h i e fp h y s i c i a n D e p a r t m e n to fR e s p i r a t o r yM e d i c i n e，A f f i l i a t e dH o s p i t a lo fJ a n g s uU n i v e r s i t y Z h e n j i a n g2 1 2 0 0 1，J i a n g s uP r o v i n c e，C h i n aj x u z h l 3 5 1 6 3c o mS u p p o r t e db y：t h eS c i e n c eR e s e a r c hF o u n d a t i o no fM i n i s t r yo fH e a l t h，N ow k j 2 0 0 6-0-0 2 6*。3 3 3”P r o j e c to fJ i a n g s uP r o v i n c e，N o2 0 0 7 1 6-0 9*R e c e i v e d：2 0 0 9-1 0-1 6A c c e p t e d：2 0 0 9-1 2-1 9江苏大学附属医院呼吸科，江苏省镇江市2 1 2 0 0 1郑金旭，男，1 9 6 1 年生，江苏省宜兴市人，1 9 9 4 年上海医科大学(现复旦大学上海医学院)毕业，博士，教授，博士生导师，主任医师，主要从事肺间质病与肺癌的研究。j x u z h l3 5 1 6 3 c o m中图分类号：R 3 1 8文献标识码：B文章编号：16 7 3 8 2 2 5(2 0 1 0)1 5-0 2 7 6 1 0 4收稿日期：2 0 0 9*1 0-1 6修回日期：2 0 0 9-1 2-1 9(2 0 0 9 0 9 1 6 0 1 7 州Z)2 7 6 1万方数据郑金瞧等。构建露代分离培养与鉴定小鼠酶泡型r-麦细匏的方法及模蛩构和功能有重要意义。其主要功能有：增殖功能：它是I 型、I I 型上皮细胞的祖细胞，在正常细胞更新和损伤修复过程中，A E CI I 可以分化为I 型细胞，也可通过有丝分裂补充自身的数量，因此被认为是肺泡上皮的干细膨1-2 ；它的损伤缺乏、异常增生分化与肺纤维化疾病和肺癌的发生发展密切相关。合成和分泌分泌肺泡表面活性物质(p u l m o n a r ys u r f a c t a n t，P S)，降低肺泡表面张力，稳定肺泡形态。具有强大的液体转运能力，对肺泡内液体的产生和青除有重要意义，维持肺泡内外液体平衡，它的缺乏与急性肺损伤后肺水肿关系密切。(A E C I I 具有免疫调节的作用，直接合成多种免疫调节物质，调节肺泡巨噬细胞的各种功能，增加对微生物的吞噬作用。因此，从复杂的肺成份中得到高纯度高产量的A E CI I 并建立体外细胞模型对研究A E CI I 的功能、肺发育、肺损伤有重要意义，为研究肺纤维化及肺癌等疾病的发生发展奠定实验基础和提供技术手段。1 材料和方法设计：单一样本观察。时间及地点：实验于2 0 0 9-0 5 0 7 在江苏大学附属医院中心实验室(生物安全的防护水平B S L 2)完成。材料：清洁级健康昆明种小鼠6 只，购自江苏大学医学院实验动物中心(许可证号：S Y X K(苏)2 0 0 8 0 0 2 4)雌雄各3 只，体质量1 8-2 2g。实验过程中对动物处置符合2 0 0 6 年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见p J。试剂及仪器：试剂及仪器来源D M E M 培养基、1 0 0U，m L 青霉素、1 0 0U m L链霉素、D n a s eI、胰蛋白酶、l 型胶原酶胎牛血清小鼠I g G兔抗鼠S P-A 抗、S P-C-抗、多聚赖氨酸羊抗兔I g G、S A B C 试剂盒、D A B 显色试剂高速台式离心机体积分数为5 的C 0 2 培养箱(型号H F l 6 0 W)倒置显微镜(型号X S Z-D 2)透射电镜(日立H 一7 6 5 0)G l B C oH y c l o n eS o l a r b i oS i g m aB o s t e r上海飞鸽牌上海力申科学仪器有限公司重庆光学仪器厂南京农业大学提供实验方法：小鼠I g G 包被培养皿：1g L 4、鼠l g G 溶液(P B S 液配制，p H 9 3)按0 1 5-0 2m g c m 2 培养皿铺板，轻晃使溶液完全覆盖培养皿底，3 7 孵育三四小时，倒出小鼠I g G 溶液，10m LP B S 轻轻冲洗培养皿2 次，备用。小鼠肺泡I I 型上皮细胞的分离：昆明种小鼠脱颈处死后，置于体积分数为7 5 的乙醇中浸泡5m i n，取出后在超净台中尽快完整取下肺组织，在预冷的P B S 液(含2 7 6 2D n a s e10 0 1g L)中尽量去除气管、支气管、血管组织，P B S 液冲洗至洗液清亮后将肺组织剪成1m m 1m m 1 m m 小块；移入1 0m L 离心管，按2m L 只小鼠加入1g L 胰蛋白酶(含D n a s e10 0 1g L)，吸管吹打混匀后3 7 孵育5m i n，移出消化好的细胞悬液，加入与消化液等量的含体积分数为1 0 胎牛血清的D M E M 中止消化；同法继续用1g L 胰蛋白酶消化肺组织次，时问5m i n，移出消化好的细胞悬液并中止消化；在剩余肺组织中按2m U 只小鼠加入l g LI 型胶原酶(含D n a s eIO 0 1g L)，吸管吹打混匀后3 7 孵育1 5m i n，移出细胞悬液，加入与消化液等量的含体积分数为1 0 胎牛血清的D M E M 中止消化；合并细胞悬液，用吸管充分吹打混匀，2 0 0 目筛网过滤，8 0 0r，m i n 离心5m i n2 次，去上清，用含体积分数为1 0 胎牛血清的D M E M1 0m L 重悬沉淀。小鼠肺泡I I 型上皮细胞的纯化与培养：将肺细胞悬液接种入包被小鼠I g G 的培养皿中，置3 7、体积分数为5 C 0 2 培养箱内孵育4 0m i n，吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠I g G 的培养皿中，同法继续在包被小鼠l g G 的培养皿中3 7 孵育4 0m i n，连续2 次，最后吸出未黏附细胞，8 0 0r，m i n 离心5m i n2 次去上清，用含体积分数1 0 胎牛血清的D M E M 重悬沉淀，调整细胞浓度为1 1 0 9L-1，并按4 1 0。个c m 2 密度接种于9 0c m 2一次性培养皿和6 孔培养板中，3 7、体积分数为5 c o，培养箱内培养，培养2 4h 后换液，此时贴壁的即为肺泡I I 型上皮细胞，此后两三天换液1 次。每天用倒置显微镜观察细胞形态特征及生长的基本情况。小鼠l g G 包被的培养皿中未黏附的肺泡I I 型上皮细胞被转移后，向培养皿中添加含体积分数1 0 胎牛血清的D M E M，3 7、体积分数5 C 0 2 培养箱内继续培养免疫黏附的细胞，作为肺泡I I 型上皮细胞的对照。小鼠肺泡I I 型上皮细胞的鉴定：免疫细胞化学鉴定：盖玻片置于6 孔培养板内，用稀释1：10 的多聚赖氨酸浸泡2h，吸出多聚赖氨酸，置于超净台下彻底吹干。纯化的肺细胞悬液调节细胞浓度至1 1 0 9L-1 接种于盖玻片，4 8h 后取出盖玻片用4 0g L多聚甲醛固定1h，分别加入S P A 一抗(滴度1：1 0 0)及S P C 一抗(滴度1：1o o)，按S A B C 法进行免疫细胞化学操作，倒置显微镜下观察S P A、S P-C 在A E CI I 中的表达，并分析纯度。透射电子显微镜鉴定：取长满培养皿皿底的A E CI I，弃培养液，P B S 液漂洗，2 5g L 戊二醛固定2h，用细胞刮子将细胞刮下，移入离心管，25 0 0r，m i n 离心10m i n 使细胞沉淀成块，丙酮脱水，10g，L 四氧锇酸后固定，常规包埋、切片，透射电镜观察。锥虫蓝检测细胞活力：将纯化的肺细胞悬液以浓度1 1 0 9L-1 接种于9 6：L 培养板中，每孔1 8 0p L，培养2 4h后每孔加入4g L 锥虫蓝2 0u L，用血球计数板在光学显P。O B o x1 2 0 0,S h e n y a n g 0 0 0 4c n z g l c k f,c o m万方数据郑参瞧等构建啄代分离培养与攀定小鼠蝻泡1 I 蛩|。受组跑的奇法硬挺壁7 易2 w c R 职。r g微镜下计算活细胞数，计数5 0 0 个细胞，拒染的即为活细胞，算出活细胞的百分比。主要观察指标：从小鼠肺组织中分离肺泡I I 型上皮细胞，进行纯化和培养并观察其生长情况。通过免疫细胞化学方法观察肺泡I I 型上皮细胞特异性标志物S P-A、S P C 的表达。肺泡I I 型上皮细胞在透射电镜下的形态特征。设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第二、三作者，评估为第四作者，均经过正规培训，采用盲法评估。统计学分析：由第一作者采用S P S S16 O 软件完成统计学处理。2 结果2 1小鼠A E C I I 的产量及纯度、活力每只小鼠肺组织经酶消化分离、纯化、培养7 2h 后平均收获A E C1 1(4 3+1 2)10 6(n=6)，纯度达到(8 5 0+2 4)(门=6)，细胞活力为(9 2 0 2 4)(门=6)。2 2 倒置显微镜下原代培养的小鼠A E CI I 细胞形态学特征及变化见图1。|S S N16 7 3 8 2 2 5C N2 1 15 3 9，Rc o D E N：z L K H A H免疫黏附纯化后的小鼠A E C I I 在接种后1 2-1 8h开始伸展贴壁，形态呈圆形或立方形，细胞质内有大量反差明显的细小颗粒，胞核明显，细胞为岛状生长方式。培养2 4h A，逐渐融合，3 6-4 8h 细胞平展呈多边形，相互连接成细胞单层。培养7 2h 后，细胞内颗粒逐渐减少，六七天明显减少，无法辨认I I 型细胞形态。对照组(免疫黏附的细胞)培养4 8h 后大量成纤维细胞贴壁生长呈梭形或不规则三角形，相互连接成网状，还可见到I 型肺泡上皮细胞和巨噬细胞等。生长方式及形态完全不同。2 3 免疫细胞化学鉴定小鼠A E C 的S P-A、S P C 表达见图2。免疫细胞化学可见S P A 呈棕黄色颗粒，定位表达于A E C1 1 细胞浆，细胞核在苏木青复染后呈蓝色。S P C呈绿色颗粒，定位表达于A E CI I 细胞浆，细胞核在碘化丙啶复染后呈红色。2 4 透射电镜下小鼠A E CI I 的细胞形态见图3。电镜下观察肺泡I I 型上皮细胞呈圆形或立方形，可见粗面内质网、高尔基体等细胞器，胞质内含吞饮小泡，含特征性板层小体，大小不一，呈同心圆或平行排列，细胞游离面见大量微绒毛。2 7 6 3万方数据零死2w M c R 脚o r g部金瞧等i 构建幕代分离培养s 鉴定小馥肺泡1 1 墅上皮细瞧的方法及模型3 讨论目前从肺组织中分离出A E CI I 常用的方法为酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胶原酶等。弹性蛋白酶对细胞形态、生物学功能、超微结构、代谓十及细胞活力等方面几无影响，但价格昂贵，不易获得。本实验为了降低胰蛋白酶对肺泡上皮细胞的损伤而又能获得相当数量的肺泡I I 型上皮细胞，降低了胰蛋白酶的消化浓度及时间，并联合使用I 型胶原酶。胶原酶仅对细胞基质有消化作用，对上皮细胞影响不大。在细胞分离过程中，由于酶对细胞的损伤，细胞释放出D N A，与细胞外基质形成D N A 蛋白复合物，网罗聚集细胞。为防止细胞聚集成团，常用脱氧核糖核酸酶。因此，本实验在整个分离过程都加入脱氧核糖核酸酶。此外，缩短细胞分离的时I n ，维持低温条件也是提高细胞活性的必要条件。肺组织中有4 0 多种不同的细胞，经酶消化后得到的细胞悬液中，除A E CI【细胞外，还含有成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等，需纯化才能使A E C I I 细胞达到研究要求。A E C I I 纯化方法很多，如密度梯度离心法、免疫黏附选择、贴壁选择、单克隆抗体技术、流式细胞仪筛选等，每个方法均有其特点，但有些方法操作繁琐，而且细胞含量低，容易受损伤。采用差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化A E CI I，细胞纯度达(8 5 0+2 4)，细胞活力达(9 2 0+2 4)。差速离心是利用A E C I I 和成纤维细胞之问的比重差异，当转速在8 0 0 10 0 0r，m i n 时，可使部分成纤维细胞无法沉淀，从而除去少量的成纤维细胞；而差速贴壁是根据成纤维细胞贴壁时间短(培养3 0-4 0m i n 就能贴壁)的特点，将细胞悬液反复贴壁，使A E CI I 进一步纯化【4-圳。免疫黏附法是利用I g G 可与含I g G F c 受体的成纤维细胞、肺泡巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞牢固结合，因此绝大多数杂细胞均被黏附清除。而A E CI I 不能与被覆I g G 的培养介质结合，洗脱收集后可得到纯度较高的A E CI I。郝嘉掣叫使用I g G 后细胞纯度提高10，产量提高12。但此方法清除肺泡I 型上皮细胞和支气管上皮细胞仍较困难。培养2 4h 后换液，可去除红细胞、淋巴细胞及其他未贴壁的杂细胞，此时皿底生长的细胞即为纯度较高的A E CI I。肺泡I I 型上皮细胞的鉴定主要靠其自身的形态及其特异性表达标志物。肺泡I I 型上皮细胞特异表达的物质较多，如S P A，S P B、S P C、S P D、A K P、A P N等【，J，完全分化的肺泡l l 型上皮细胞最有特征的表型足表达表面活性蛋白。肺泡I I 型上皮细胞中S P A 含量最多，易于检出，特异性敏感性高删，是免疫细胞化学鉴定的一种新方法。S P-C，它是仅在肺泡I I 型上皮细胞表达的惟一活性蛋白，故可以用它来鉴定肺泡I I 型上皮细胞州。实验取培养4 8h 的A E CI I，同时使用S P A 不H S P C 作免疫2 7 6 4细胞化学鉴定，互相取长补短，增强了鉴定的可靠性，一般2 0h A 可完成，相对电镜而言明显缩短了鉴定时问。然而电镜鉴定A E CI I 仍然是目前最权威的鉴定方法，但准备工作繁琐，需要的细胞量多，耗时长，般2-4 周。电镜下清楚观察到A E CI I 胞质内的特征性板层小体、丰富的细胞器及细胞游离面的大量微绒毛。在细胞核周围分布的板层小体，是一种分泌颗粒，含有丰富的磷脂质、粘多糖和蛋白质。体外培养的A E CI I 在形态学上经历3 个阶段：细胞贴壁生长期、生长高峰期和退化期，整个过程持续1 0d左右。本实验观察到A E CI I 在原代培养第2 4-7 2h 内处于最佳生长状态，此时适合用于做体外研究实验。此后转变为肺泡I 型上皮细胞或逐渐脱落失去培养，可能与细胞失去了体内环境无法增殖传代有关。这种特殊的生物学特性决定了A E CI I 不能形成细胞株，只适合短期培养不适合做长期的体外研究。本实验利用胰酶联合胶原酶消化，差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法获得了高产量高纯度的A E C【I，通过双免疫细胞化学法可快速准确地进行鉴定，在较短时间内建立一个合格的细胞模型。一些刺激A E CI I 生长的细胞因子可以迸一步提高细胞产量，有研究结果显示，E G F、T G F 一能明显刺激成年大鼠A E CI I 增生，细胞数量增多，T G F 一1 3 1 则抑制A E CI I 增生。通过发现A E CI I 表面有特异性的标志物，利用免疫学技术也许还可进一步提高A E CI I 的纯度和活力。4 参考文献 1】K i n n a r dW，T u d e rR，P a p s tP e ta 1 R e g u l a t i o no fa l v e o l a rt y p eI Ic e l Id i f f e r e n t i a t i o na n dp r o l i f e r a t i o ni na d u l tr a tl u n ge x p l a n t s A mJR e s p i rC e l l M o l B i o I 1 9 9 4；1 1(4)：4 1 6-4 2 5【2】H o l mB，M a t a I o nS，F i n k e l s t e i nJ，e ta 1 m y p eI Ip n e u m o c y f ec h a n g e sd u r i n gh y p e r o x i cl u n gi n j u r ya n dr e c o v e r y A p p lP h y s i 0 1 19 8 8；6 5：2 6 7 3-2 6 7 8 f 3】T h eM i n i s t r yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo ft h eP e o p l e sR e p u b l i cO fC h i n a G u i d a n c eS u g g e s t i o n sf o rt h eC a r ea n dU s eo fL a b o r a t o r yA n i m a l s 2 0 0 6 0 9 3 0 中华人民共和国科学技术部关于善待实验动物的指导性意见2 0 0 6 0 9 3 0【4 T h o m eU H，D a v i sl C，N g u y e nS V e ta 1 M o d u l a t i o no fs o d i u mt r a n s p o r ti nf e t a la l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l sb yo x y g e na n dc e r l J c o s t e r o n e A mJP h y s i o lL u n gC e l IM o IP h y s i 0 1 2 0 0 3；2 8 4(2)：3 7 6-3 8 5 5 1B u c k l e yS，D r i s c o l IB。S h iW，e ta I M i g r a t i o na n dg e l a t i n a s e si nc u l t u r e df e t a l，a d u l t，a n dh y p e r o x i ca l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l sA mJP h y s i o lL u n gC e l lM o IP h y s i 0 1 2 0 0 1；2 8 1 f 2)：4 2 7 4 3 4 f 6 1H a oJ，L iY v v，X i a oY B D i s a nJ u n y iD a x u eX u e b a o 2 0 0 0；2 2(5)：5 0 0 5 0 1 郝嘉，李永旺，肖颖彬大鼠肺泡I【型上皮细胞体外培养和鉴赳J】第三军医大学学报，2 0 0 0 2 2(5)：5 0 0-5 0 1【7】B a l l a r dP L H o r r n o n a Ir e g u l a t i o no fp u l m o n ar ys u f f a c t a n t E n d o c rR e v 1 9 8 9；1 0：1 6 5 1 8 1【8 IG o l d m a n nT K i h l e rD。S c h u l t zH o l g e r，e ta 1 O nt h es i g n i f i c a n c eo fS u r f a c t a n tP r o t e i n-A w i t h i nt h eh u m a nl u n g s D i a g nP a t h 0 1 2 0 0 9；4：8 9】H a m v a sA，C o l eF S，N o g e eL M G e n e t i cd i s o r d e r so fs u r f a c t a n tp r o t e i n s N e o n a t o l o g y 2 0 0 7；9 1 f 4)：3 1 1 3 1 7 来自本文课题的更多信息一基金资动：课题受卫生部科研项目(w 岣2 0 0 6-2-0 2 6)，江苏省“3 3 3 工程”资助项目(苏人才办2 0 0 7 1 6-0 9)资助。利崧坤多毫无其他利益冲突。户0 B o x1 2 0&S h e n y a n g1 1 0 0 0 4c nz g l c k f,c o m万方数据构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡型上皮细胞的方法及模构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡型上皮细胞的方法及模型型作者：郑金旭，黄振杰，汤艳，丁明作者单位：江苏大学附属医院呼吸科,江苏省镇江市,212001刊名：中国组织工程研究与临床康复英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH年，卷(期)：2010,14(15)被引用次数：1次 参考文献(9条)参考文献(9条)1.Kinnard W;Tuder R;Papst P Regulation of alveolar type cell differentiation and proliferation inadult rat lung explants 1994(04)2.Holm B;MataIon S;Finkelstein J Type pneumocyte changes during hyperoxic lung