基因治疗20年.pdf

书书书中国生物工程杂志 ，（）：檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏专稿基因治疗 年毛建平（军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京 ）摘要 年 月 日美国 临床中心首次采用基因治疗成功治愈腺苷脱氨酶（）基因缺陷而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下疾患，至今已整整 年。其发展迅速，从单纯的重组技术导入基因 发展到了涵盖 和 两个干预水平，和基因上调（如基因增补、矫正、置换等）及下调（基因失活）的两大策略。近年来的进展使得基因治疗登入 杂志 年度十大科学进展。我国在基因治疗领域诞生了第一个上市药物，有 多个制剂处于临床前或临床研究阶段。基因治疗在遗传病治疗中具备巨大潜力，已经成为当代生命科学中最有前景的研究方向之一。关键词基因治疗 转染载体反义技术中图分类号 收稿日期：修回日期：国 家 科 技 重 大 专 项（）、国 家 自 然 基 金（）资助项目 电子信箱：年设立诺贝尔奖以来，在生理学和医学奖中涉及基因的科学发现有：年 射线与基因突变，年基因控制生化反应，年发现跳跃基因，年发现原癌基因，年发现断裂基因，年细胞死亡与基因调节，年发现 干扰（）控制基因信息流机制，年对基因的靶向技术，年发现端粒与端粒酶从基因角度诠释了衰老癌变的内因。进入 世纪以来，人类与基因的关系越来越密切，基因一词出现的频率越来越高，人们对基因一词越来越熟悉，基因也越来越受到人们的追捧。从 年发现疾病相关基因 癌基因，到 年实现技术上基因干扰以及 年基因靶向技术，凸显了人类疾病中对疾病基因干预治疗在生物医学领域和临床研究应用的重大意义。年 杂志公布的年度十大科学进展中，基因治疗位列其中，其在遗传病治疗中具备的巨大潜力得到了肯定 。基因治疗已经成为当代生命科学中最有前景的研究方向之一。基因治疗的起源和历史基因治疗，是通过基因水平的改变来治疗疾病的方法。传统上指插入一段功能基因纠正细胞错误功能。基因治疗思路最早见于 年 的描述：“我们可以参与改变染色体和片段，最大限度运用分子生物学方法可以直接控制人染色体核酸序列，与识别、选择和所需基因的整合，只是一个时间问题多核苷酸序列可以用化学方法加载于病毒 ”。年 和 在 约克时报 首次提到基因治疗，年他们在 提出人类遗传疾病的基因治疗（）概念，他们引用了 关于来自外源的“好的”基因替换遗传病人缺陷基因的假说 。年 等首先在无细胞体系中用单链 与 基 因 互 补 结 合 抑 制 基 因 转 录，随 后 和 使用 个核苷酸的单链 反义抑制肉瘤病毒 的复制，开创了干预和抑制基因表达的基因核酸药物研究方向 。年，德克萨斯州休斯敦市 医学院的研 ，（）毛建平：基因治疗 年究人员提出采用基因疗法治疗莱施 奈恩二氏综合症（，次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的遗传缺陷 完全缺失），将编码酶的正常基因注射到细胞中，基因复制后把细胞回注到 综合症患者体内，这些细胞可以纠正这些患者体内存在的遗传缺陷，从而治愈疾病。得益于 重组技术的发展，短短 年第一例转入基因治疗就已经运用 。等运用逆转录病毒将新霉素抗性基因转入来自 个患者的转移淋巴瘤细胞，体外培养增殖以后回输到相应患者，表明安全可行。并引发了相关研究深入进行。基因治疗的首次实施在 年的月 日，在美国国立卫生研究院（）临床中心，一位 岁的小女孩 接受了第一例基因治疗，她因缺少腺苷脱氨酶（）而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下。安德森（）等人收集病人的白细胞，将 编码基因导入，然后再把白细胞重新输送回体内。接受治疗后，其机体产生 的能力有所提高。安德森博士因此被誉为世界“基因治疗之父”，接受治疗的患者健康状况一直良好（如图 ）。至 年全球开展了 多例临床基因治疗，至今为止已有 多例，表 归纳了基因治疗的发展 。图 首例基因治疗（引自参考文献 ，源于 ）表 基因治疗历史事件时间治疗对象治疗方案治疗疾病国家 人 基因直接注射腺苷脱氨酶（）缺乏而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下美国，造血干细胞同上意大利，米兰 小鼠镰刀型细胞 人儿童严重联合免疫缺陷病（，）法国 纳米的脂质分子，携带治疗性 通过核膜 新型基因疗法修复缺陷基因 治疗地中海贫血症、囊性纤维症及部分癌症 干扰亨廷顿舞蹈症 聚乙二醇（）包被的脂质体将基因送入脑部跨越血 脑屏障治疗帕金森病美国 重组人 腺病毒注射液“今又生”，第一个获得国家批准的基因治疗抗癌药物上市应用治疗头颈癌，肺癌中国 豚鼠腺病毒为载体将 基因导入耳蜗的毛细胞恢复 听力 人治愈骨髓系统疾病，如急性髓细胞性白血病（，）骨髓异常 小鼠注射免疫细胞 调节抑制免疫系统排斥导入的治疗基因意大利米兰 重组 淋巴细胞晚期转移性黑素瘤细胞治疗癌症美国 人慢病毒载体导入 外膜基因反义核酸 治疗 ，人 阳性 细胞升高，人对 抗原和其他病原免疫升高美国 小鼠脂质纳米微粒（）作为药物载体运送两个肿瘤抑制基因肺部肿瘤缩小美国德州大学 狗恢复了一群先天失明的小狗的视力英国人（岁）遗传性视网膜利伯先天性黑朦病（，）重组腺病毒（）携带 基因，治疗后视力改善，且未见副作用。英国 人（岁）眼视力疾病改善了先天失明患者 的视力英国 人重度联合免疫缺陷病人长期跟踪多年后痊愈。“基因治疗实现了愿望”中国生物工程杂志 续表 时间治疗对象治疗方案治疗疾病国家 人慢病毒载体将一个具有功能的 基因拷贝导入到这些细胞之中以纠正其基因上的缺陷，治疗 连锁性肾上腺脑白质营养不良症（）年后 蛋白仍可在病人血细胞中查到。神经学症状得到了改善，而该治疗对疾病的缓解与骨髓移植疗法效果相似德国 人莱贝尔先天黑内障人重新获得视力，无需辅助器材美国 人帕金森氏病人转入 个基因提高多巴胺分泌效果很好法国 猴“探色”蛋白质基因注入先天红绿色盲猴眼内看到红色和绿色美国 人肾上腺脑白质营养不良，慢病毒载体导入正常基因成功终止了致命性的脑病（连锁肾上腺脑白质营养不良）法国基因疗法在 年取的了杰出成绩，杂志以及 时代 周刊评选出的十大科学突破和十大科学发现都分别把基因疗法纳入其中。基因治疗出现的问题基因治疗面临许多问题和挑战。其存在的主要问题是有效性和安全性。主要表现为基因导入系统缺乏靶向性，病毒载体的安全性问题，特别是遗传病基因治疗的载体要求更高，因而发展可控性、安全性与有效性于一体的新型载体系统是当今及未来的研究方向。基因治疗在临床应用中曾出现过问题，导致公众质疑，被中止临床应用。美国亚利桑那州在对严重联合免疫缺陷病患者进行基因疗法临床试验当中，发生了严重的免疫反应，导致有遗传性肝病的患者 于 年死亡，这起事故宣判了整个基因疗法研究领域的死刑。从此以后，基因疗法研究在美国再也没有繁荣起来，但是在英国和法国等国家依旧照常开展。年法国 名 患者受试者的病情从基因转导治疗中获得改善，但其中 名患者最终患上了 细胞性白血病。有 例是由于研究人员将病毒载体整合入 基因或该基因的邻近片段意外激活原癌基因 导致的。伦敦大学儿童健康研究所对 型重症联合免疫缺陷受试者进行逆转录病毒转导的自体造血干细胞治疗，名受试者中 位患上 细胞性白血病。年 月美国马里兰州一位 岁的患有关节炎的妇女在一项基因疗法临床实验中死亡，从而引发了全国上下对所有采用腺相关病毒所进行的临床实验的安全性重新审查。基因输入人体引发免疫反应，以及可能与其他原有基因或细胞相互作用仍是需要关注的问题。目前从延长患者生命，被社会接受程度等来衡量对症治疗的疗效和成功率仍然较低。另外大多需要终生治疗，输血过程中存在感染 或发生其它感染的风险，反复输血会带来高铁体质等副作用，以及治疗费用较高。基因治疗的策略与技术基因治疗旨在基因水平的改变，方法上包括上调和下调两个思路，有 和 两个水平 ，产生的技术如表 。表 基因治疗策略总揽两个思路基因治疗技术目标靶分子描述上调低表达基因基因置换（）用正常的基因，将细胞内疾（致）病基因进行原位替换基因矫正（）将变异基因的突变碱基从核苷酸序列上予以纠正，原来正常基因予以保留基因增补（）将正常的目的基因导入细胞，其表达产物能修饰缺陷的细胞功能，使得原有的功能加强，但仍保留了原缺陷细胞免疫基因治疗（）抗体、抗原和细胞因子的基因导入人体，改变免疫状态，达到预防、治疗效果自杀基因治疗（）导入新基因使得无毒性前药变成毒性杀死肿瘤细胞，或增加肿瘤细胞对放射治疗、化疗的敏感性下调高表达基因基因失活（）敲除（）也称基因打靶，在细胞分裂过程通过重组载体和靶定基因的基因交换摧毁靶基因三链（）人工合成单链通过正反式 型氢键与 之一条链相互作用而形成，阻止解旋、启动子结合和转录 ，（）毛建平：基因治疗 年续表 两个思路基因治疗技术目标靶分子描述诱骗序列（）诱骗序列同 序列竞争结合胞内转录因子，减弱或消除依赖于此转录因子的某些基因的转录对 的诱骗序列 干扰结合或拐骗蛋白稳定元件离开，使基因 分子变得不稳定而降解反义核酸（）导入反向互补寡核苷酸和 形成 碱基配对，双链阻止 不被转录或使 被核酸酶 切割销毁反义核酶（）导入 其结合臂和 形成 碱基配对，其水解核心切割 而致销毁反义 酶（）导入 其结合臂和 形成 碱基配对，其水解核心切割 而致销毁干扰 （）外源 导入引起内源性序列同源 有效、特异的降解，消除基因表达根据治疗的靶向分子 和 ，国际上也称：反 策略和反 策略。基因治疗包含 个技术关键（表 ），包括：选择疾病基因、提高导入效率、治疗目标细胞和技术要点等方面。表 基因治疗技术总揽选择基因导入技术作用目标细胞技术要点选择癌基因、抑癌基因、凋亡抑制基因、生长因子及其受体信号转导系统基因、细胞周期调控和酶类基因等，以及外源致病微生物如 ，的结构基因；最好选择单基因突变导致的疾病。导入抑癌基因、免疫基因、自杀基因、抗肿瘤血管形成基因、耐药基因。例如人类 以上的肿瘤与抑癌基因 的变异有关，因此重组人 腺病毒注射液的成功之处在于治疗基因的选择上具有优势。向靶细胞有效转移目的基因的载体系统：显微注射 电子打孔 磷酸钙转染 融合法 生物载体逆转录病毒（）载体腺病毒（）载体腺相关病毒（）载体嵌合型病毒载体单纯疱疹病毒人工脂质球纳米分子新载体分子 生殖 细 胞 基 因 治 疗（）和体细胞基因治疗（）。体细胞基因治疗不会造成遗传改变、且具有较好的可操作性是基因治疗主流。治疗患者已 余例，体细胞治疗靶细胞：造血细胞和干细胞、成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、角化细胞、上皮细胞等。考量依据：疾病累及的主要部位；靶细胞来源的难易程度；体外培养的成活率和存活时间；接受正常基因的能力；新的正常基因在靶细胞中能否正常表达和持续时间等。使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的。导向性：特异的受体与目的基因相连，可以介导目的基因在表达 受体的细胞特异性转导。调控性：对目的基因的修饰，能在局部选择性的攻击肿瘤细胞，即通过构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因定向地仅表达于肿瘤细胞。我国基因治疗的进展我国基因治疗自 年起步，紧跟国际发展水平。年立为重大项目，本着“有所为、有所不为”的原则，将研究的重点放在基因治疗尚未解决的技术关键上，同时有选择地进入临床试验，对血友病 、人恶性脑胶质瘤等个基因治疗方案和 余种产品或方案进行临床试验。如上海市肿瘤研究所创建受体介导非病毒载体靶向技术，并将胸苷激酶基因导入脑恶性胶质瘤进行临床治疗；中国医科大学研制疱疹病毒载体从嗅神经导入到病变中枢神经元细胞；预防医科院病毒所构建腺相关病毒载体技术并运用到血友病 治疗；复旦大学采用转凝血因子 成纤维细胞治疗 型血友病；北京大学医学部将血管内皮生长因子 表达质粒直接栓塞血管周围组织治疗栓塞；上海三维生物公司研制 工程腺病毒抗癌注射液等等，取得了显著成绩（表 ）。年有 个品种进行临床前研究，个进入临床，多个产品处于临床前研究阶段 。基因治疗的现状与展望基因治疗具有理论基础和良好前景。所有疾病的发生都与一定的遗传因素相关，一些家庭成员接连几代人都会罹患诸如肠癌、躁狂抑郁、阿茨海默氏病、心脏病、糖尿病等疾病，而这些患者的某一个或多个基因上存在着共同的遗传异常。以目前的医疗水平，有多达 多种遗传性疾病依靠传统医学不能获得有效的治疗，大多数发生在肝脏和造血器官（如骨髓）。因此，基因治疗能从根本上真正精准的治愈这些常规疗法所不能解决的疾病。世界各国越来越多的设立了专中国生物工程杂志 门基金以支持该研究。表 年我国基因治疗临床研究产品品种临床状态研制单位重组腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因制剂 期完成，期初步结果好华中科技大学同济医学院特异性溶瘤重组腺病毒注射液 期完成，准备 期华中科技大学同济医学院重组人内皮抑素腺病毒 期完成，安全有效四川大学重组腺病毒肝细胞生长因子注射液（）治疗缺血性心脏病，期军事医学科学院放射与辐射医学研究所 肌肉注射液型血友病，期复旦大学基因溶瘤腺病毒注射液（）晚期非小细胞肺癌，期第四军医大学 重组人 单纯疱疹病毒注射液多种恶性肿瘤，期首都儿科所结合基因诊断技术，未来可以先评价个人患病风险，利用基因技术提早进行预防和治疗，找到每个个体不同的致病靶点，采用不同治疗，使疾病治疗向个性化方向发展。基因治疗目前关注的焦点主要在 ，基因上调和下调两种技术思路中主要以转入野生型基因治疗，而从 水平下调基因的技术如基因剔除、基因定点突变还仅限于实验室，三螺旋形成寡核苷酸（）和针对启动子区序列的诱骗（）序列寡核苷酸虽然可以阻止转录因子结合启动子，但会导致同启动子下的一类基因改变，从 下调表达技术无法做到基因特异抑制，因此以基因组 为药物靶标基因失活治疗离应用尚有较大差距。然而，从 水平上进行的基因治疗发展更为快速。在控制疾病基因表达的策略上，针对 的反义技术飞速发展。反义核酸是最广泛应用的核酸药物，采用 或 片段用载体导入或者胞内表达。年第一个反义核酸药物 上市，年治疗老年人视网膜黄斑退化症的第二个眼科用反义药物 上市，接着有 多个反义核酸药物上市，如 （艾滋病治疗药）、（治疗慢性淋巴细胞白血病）、（治疗多发性硬化症）、（治疗重症肌无力）、（治疗家族性遗传性哮喘）和 （治疗神经胶质细胞瘤胰腺癌与黑色素瘤等）等。以美德为主的西方发达国家所开发并已进入临床的反义新药约有 种，处在实验室研究阶段的达上百种。同时，针对 、和 基因 的 也都进入了临床治疗，治疗着色性的视网膜炎（），增生性视网膜透明症（），抵抗 （）治疗 疾病，及对 、治疗肿瘤等均取得快速进展。技术是一项非常有效、高度特异的 水平上的转录后基因沉默技术。尽管进入 期临床的 的治疗效果低于对照药物而终止，其研究仍在快速发展。目前，干预能更有效地抑制疾病基因表达，成为关注焦点之一。转录组研究表明人类 以上的基因的 都是通过 可变剪接产生，基于 进行的基因治疗也已经成为新的研究重点。人类基因组计划于 年启动，年工作草图绘制完毕，今年是人类基因组工作草图问世 周年，是基因治疗的 周年。过去的 年基因治疗积累了丰富的理论和实践经验，过去的 年更是生命科学激动人心的 年，人类在对自身和疾病的认识上都发生了飞跃性的变化。根据 统计，年在美国就有 项基因治疗正在试行，远超出此前 年全球的 项；共有 家公司研发基因治疗技术，而在 年只有 家。除了我国“今又生”的应用外，基因治疗在美国严谨而慎重地进行，尚未在医学上应用，其技术成熟的一天将是人类幸福的开始。预计全球基于基因治疗产业带来的产值在 年将达到 亿美元。我们有理由期望在未来一个婴儿出生时就能预知其疾病，建立其个性化治疗方案和治疗时程。未来 年，基因治疗有望全面实现，它必将为促进人类健康带来巨大贡献。参考文献 ：；，（）：，；，（）毛建平：基因治疗 年 ，；：癌症基因治疗生命奥秘，（）：，（）：，；（）：，；（）：，；（）：，；（）：毛建平，毛秉智基因药物研究现状和对策中国生物化学与分子生物学报，（）：，（）：，；（）：重大疾病的生物治疗 基因治疗 中国生物技术发展报告，北京，科学出版社，：，（，），（）（），（），