细菌标准操作规程3.doc

通辽市医院检验科微生物室作业指导书营养琼脂配制 标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范营养琼脂培养基配制的操作规程，保证培养基质量。2.原理培养基含有氮源、碳源和微量无机盐。适宜细菌生长繁殖。3用途供细菌培养、菌株纯化及传种使用。4.配方营养琼脂干粉28g、蒸馏水1000ml。5.操作步骤将28g营养琼脂干粉溶于1000ml蒸馏水中，混匀至完全溶解，分装，经121灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-17通辽市医院检验科微生物室作业指导书营养琼脂配制 标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 表5-17 配制营养琼脂培养基质控方法及结果试验 方法 结果无菌试验 100块随机取10块，35培养2448h 无细菌生长生长试验 金黄色葡萄球菌ATCC25923，35培养2448h 菌落浅黄色 铜铝假单胞菌ATCC27853,35培养2448h 菌落无色或浅绿色，直径2.5mm平行试验 做质控时，取新旧批号的培养基同时做 9.注意事项倾注时温度不易过高，否则冷凝水过多易污染；若温度过低，琼脂易凝固。 通辽市医院检验科微生物室作业指导书血琼脂培养基配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范血琼脂培养基配制的操作规程，保证培养基质量。2.原理羊血或兔血等是细菌生长繁殖的良好营养物质。在4550的基础培养基中加入血液可疑完好保存血液中某些布耐热的生长因子，同时血细胞不被破坏。若将Nacl浓度提高道0.85%，可使血平皿在35培养1824小时后色泽仍然鲜艳。3用途供一般病原菌的分离培养培养、溶血性鉴别及保存菌种用。4.配方特殊蛋白胨23g、淀粉1g、氯化钠5g.、琼脂10g、无菌脱纤维羊血（或兔血）5%10%,ph 7.17.5。5.操作步骤将上述成分混匀，溶于1000ml蒸馏水中，加热溶化，校正ph,121高压灭菌15分钟。冷却至50加入无菌血液，充分摇匀后竞逐平板，待凝固后冷藏备用。血琼脂层厚4mm。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-18 表5-18 配制血琼脂培养基质控方法及结果试验试验 方法 结果无菌试验 100块随机取10块，35培养1824h 无细菌生长生长试验 化脓性链球菌ATCC 19615,35培养1824h 生长良好，溶血 肺炎链球菌ATCC 6305，35培养1824h 生长良好，溶血 金黄色葡萄球菌ATCC 25923，35培养1824h 生长良好，溶血 大肠埃希菌 ATCC 25922，35培养1824h 生长良好平行试验 做质控时，取新旧批号的培养基同时做平行9.注意事项倾注时温度不易过高，否则血细胞易被破坏而溶血；若温度过低，琼脂易凝固。通辽市医院检验科微生物室作业指导书巧克力培养基配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范巧克力琼脂培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理流感嗜血杆菌生长依赖血液中的X及V因子，当培养基加热至8090时，可使血液中的红细胞破裂释放出X、V因子，以利于嗜血杆菌的生长培养。3用途主要用于嗜血杆菌的分录培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。4.配方牛肉浸出液1000ml、蛋白胨10g、氯化钠5g.、琼脂15g、无菌脱纤维羊血100ml，ph 7.27.4。5.操作步骤将前4项成分混合，加热溶化，校正ph,121高压灭菌15分钟。冷却至8085，以无菌技术加入羊血，摇匀后置至8085水浴中，维持15分钟，使之成巧克力色取出，倾注平板，待凝固后冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-19 表5-19 配制巧克力琼脂培养基质量控制方法及结果试验试验 方法 结果无菌试验 100块随机取10块,35,CO2培养2448h 无细菌生长生长试验 流感嗜血杆菌ATCC 10211,35，CO2培养2448h 生长 淋病奈瑟菌ATCC43069，35，CO2培养2448h 生长平行试验 做质控时,要求新旧批号的培养基同时做平行9. 注意事项水浴温度不宜过高，时间不宜过长，否则X和V因子消耗殆尽；水浴温度也不宜过低，时间也不宜过短，否则X和V因子不能充分释放出来，应控制在8085。通辽市医院检验科微生物室作业指导书M-H培养基配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范M-H培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理M-H培养基用Mueller-Hinton琼脂（水解酪蛋白琼脂）配制，淀粉为保护性胶体，能对抗细菌中的毒性物质，水解酪蛋白含多种氨基酸，牛肉浸膏能提供细菌氮源的主要营养物质。药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小、清晰，因此培养基不含对抗生素及磺胺药物的拮抗剂。3用途用于普通细菌的抗菌药物敏感试验。4.配方成品OXOID M-H 干粉38g、蒸馏水100ml，ph 7.17.5。5.操作步骤将上述成分混合，校正ph,121高压灭菌15分钟。冷却至50左右，无菌定量吸取25ml于直径9cm的无菌平板内，凝固后冷藏备用。琼脂层厚4mm.6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-20. 表5-20 配制M-H培养基质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100块随机取10块,35培养24h在M-H培养基上涂布粪肠球菌 ATCC 29212,，用甲氧苄啶/磺胺甲恶唑纸片进行药敏试验,35培养24h做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长出现一个边缘清楚的抑菌圈，直径应20mm9. 注意事项9.1 倾注琼脂量为25ml，平板深度4mm.若太薄，易产生假敏感。若太厚，平皿中的抗生素往下扩散而使抑菌环变狭窄，产生假耐药性。9.2 pH会影响某些抗生素的活性。试验时不可将平板培养在CO2培养箱中，否则会在琼脂的潮湿表面产生碳酸而降低pH值，将影响各种抗生素的扩散速度、抑菌环大小。 通辽市医院检验科微生物室作业指导书Cary-Blair转运培养基配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范Cary-Blair转运培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理该培养基具有抗氧化、缓冲等作用，能维持病原菌活力，适合标本运输。3用途主要用于标本采集及保存使用。4.配方硫乙醇酸钠1.5g、磷酸氢二钠1.1g、氯化钠5g、氯化钙0.09g、琼脂5.6g、蒸馏水100ml，ph 8.28.6。5.操作步骤将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解。校正ph至, 8.28.6，分装试管，每支5ml，121高压灭菌15分钟凝固后，冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-21 表5-21 配制Cary-Blair转运培养基质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100块随机取10支，,35培养24h，观察有无细菌生长,沙门菌质控菌株，35培养志贺菌质控菌株，35培养做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长3日内存活3日内存活9. 注意事项（略）通辽市医院检验科微生物室作业指导书营养肉汤配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范营养肉汤配制的操作规程，保证培养基质量。2.原理含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，如蛋白胨、牛肉膏、食盐、水等，所以供微生物生长繁殖之用。3用途用于标本及各类细菌的增菌。4.配方蛋白胨10g、牛肉浸液1000ml、氯化钠5g,Ph7.27.4。5.操作步骤将上述成分混合，校正pH，分装试管，每管35ml。经121高压灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-22 表5-22 配制营养肉汤质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100支随机取10支，,35培养1824h，观察有无细菌生长(若有细菌生长，则营养肉汤变浑浊)大肠埃希菌 ATCC 25922,需氧,35, 1824h金黄色葡萄球ATCC 25923,需氧,35, 1824h 做质控时,要求新旧批号的营养肉汤同时做无细菌生长生长生长9. 注意事项调整pH时，加碱后，必须加热，使pH值得以稳定。通辽市医院检验科微生物室作业指导书碱性蛋白胨水配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范碱性蛋白胨水配制操作规程，保证培养基质量。2.原理在pH8.09.0环境中，霍乱弧菌能较好地生长繁殖，而其他大部分细菌在此环境中生长受抑制，因此霍乱弧菌在此培养基上生长占优势，为进一步分离培养提供有利条件。3用途主要用于霍乱弧菌增菌培养用。4.配方蛋白胨10g、氯化钠20g,蒸馏水1000ml,pH8.48.8。5.操作步骤将上述成分混合加热溶解，调整pH至8.48.8，煮沸，稍冷却，分装试管每支8ml，121高压灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-23 表5-22 配制营养肉汤质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100支随机取10支，,35培养1824h，观察有无细菌生长(若有细菌生长，则变浑浊)非O1群弧菌(质控菌株)，35孵育6h大肠埃希菌 ATCC 25922, 35孵育6h 副溶血弧菌(质控菌株)，35孵育6h做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长良好生长抑制生长良好9. 注意事项蒸馏水配制时，由于蒸馏水pH偏低，故pH要重新测定。通辽市医院检验科微生物室作业指导书牛脑心浸液培养基配制 标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范牛脑心浸液培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理该培养基营养丰富，营养要求较高的细菌在此环境中能较好地生长繁殖，为进一步分离培养提供有利条件。3用途主要培养营养要求较高的细菌。4.配方牛脑浸液培养基12.5g、牛心浸液培养基5g、蛋白胨10g、琼脂粉10g、氯化钠5g,、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000ml,pH7.27.6。5.操作步骤将上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解。调pH至7.27.6，分装，121高压灭菌15分钟。冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-24 表5-22 配制牛脑心浸液培养基质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100支随机取10支，,35培养1824h，观察有无细菌生长(若有细菌生长，则变浑浊)大肠埃希菌 ATCC 25922,需氧,35, 1824h金黄色葡萄球ATCC 25923,需氧,35, 1824h 做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长生长9. 注意事项若再加入酵母提取物5g/1000ml，效果更佳。通辽市医院检验科微生物室作业指导书厌氧血琼脂培养基配制 标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范厌氧血琼脂培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理本培养基含有丰富营养，能提供厌氧菌生长繁殖所需的生长刺激剂、还原剂等，即使营养要求较高的厌氧菌亦能生长良好。3用途用于厌氧菌的分离培养。4.配方成品厌氧琼脂粉46g、蒸馏水1000ml、脱纤维羊血50ml。 5.操作步骤将成品厌氧琼脂粉加入1000ml蒸馏水中，121高压灭菌15分钟，冷至50左右，加入脱纤维羊血50ml。混匀后倾注平板，冷藏备用。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-25 表5-25 配制厌氧血琼脂培养基质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100支随机取10支，,35厌氧培养24h脆弱拟杆菌ATCC25285，厌氧，35，2448h产气荚膜杆菌ATCC13124，厌氧，35，2448h具核梭杆菌ATCC25586，厌氧，35，2448h厌氧消化球菌ATCC27337，厌氧，35，2448h产黑色素普雷沃菌ATCC25845，厌氧，35，2448h做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长生长,溶血生长生长生长新旧批号结果相同9. 注意事项温度应适宜，若温度过高，冷凝水过多易致污染；若温度过低，部分琼脂凝固，平板表面高低不平。高压灭菌后加入脱纤维羊血时的温度不能太高，否则会引起溶血。通辽市医院检验科微生物室作业指导书罗氏培养基配制标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范罗氏培养基配制操作规程，保证培养基质量。2.原理本培养基含有丰富营养，能满足分枝杆菌生长所需的碳源和氮源、磷酸盐为缓冲剂，维持培养基的pH值；孔雀绿可抑制杂菌生长。3用途用于分枝杆菌的分离培养。4.配方天门冬酰胺0.72g、磷酸二氢钾0.96g、枸橼酸镁0.6g、硫酸镁0.048g、中性甘油2.4ml、蒸馏水120ml、马铃薯粉6g、新鲜鸡蛋液200ml、1%孔雀绿溶液8ml。5.操作步骤将天门冬酰胺、磷酸二氢钾、枸橼酸镁及甘油加水后，置于沸水浴中加热溶解。再加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热30分钟，不断搅拌，使成均匀糊状。待冷却至65时，加入新鲜全蛋液200ml及1%孔雀绿溶液8ml，充分摇匀后，用双层纱布过滤。然后分装于大试管中，每管10ml，永橡皮塞塞紧，置成斜面。85流动蒸汽灭菌150分钟即成。6.储存条件28冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1 质控频度 每次新配制时做质控。8.2 质控方法及结果见表5-26 表5-26 配制罗氏培养基质量控制方法及结果试验试验方法结果无菌试验生长试验平行试验平行100块随机取10支，,35培养，观察有无细菌生长结合分枝杆菌H37RaATCC 25177, ,35,CO2堪萨斯分枝杆菌 1群ATCC 12478瘰疬分枝杆菌2群 ATCC19981胞内分枝杆菌3群 ATCC13950偶发分枝杆菌4群 ATCC6841大肠埃希菌 ATCC 25922做质控时,要求新旧批号的培养基同时做无细菌生长21日生长21日生长21日生长-可能被选择性培养基抑制21日生长-可能被选择性培养基抑制1824小时)或生长不良、凝固酶活性低的菌株往往出现假阴性。8.临床意义金黄色葡萄糖菌凝固酶试验为阳性，而表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌凝固酶试验为阴性，故此试验对鉴别葡萄球菌有重要价值。通辽市医院检验科微生物室作业指导书DNA酶试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范DNA酶试验标准操作规程。2.原理某些细菌可产生细胞外DNA酶。DNA酶可水解DNA长链，形成数个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸则可溶于酸，当在菌落平板上加入酸后，若在菌落周围出现透明环，表示该菌具有DNA酶。3.试剂3.1 DNA琼脂成分DNA(脱氧核糖核酸) 2.0g 胰蛋白胨 15g大豆胨 5.0g 氯化钠 5.0g琼脂 20g 蒸馏水1000ml。PH 7.27.43.2 制备 将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，分装三角烧瓶，经115灭菌15分钟，倾注于灭菌平皿，冷藏备用。4.质控黏质沙雷菌 ATCC14041 为阳性，大肠埃希菌 ATCC 25922 为阴性。5.操作步骤将待检菌点状接终于DNA琼脂平板上，35培养1824小时，在细菌生长物上加一层1 mol/L盐酸（使菌落浸没）6.结果判断菌落周围出现透明环为阳性、无透明环为阴性。7.注意事项培养基表面凝固水需烘干，以免细菌呈蔓延状生长。也可在营养琼脂的基础上增加0.2%DNA。8.临床意义肠杆菌科中的沙雷菌和变形杆菌可产生DNA酶，革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，因此可用于鉴别。通辽市医院检验科微生物室作业指导书CAMP试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1. 目的规范CAMP试验标准操作规程。2. 原理B群链球菌具有“CAMP”因子，能促进葡萄球菌溶血素的活性，使两种细菌在划线处呈现箭头形透明溶血区。3. 试剂金黄色葡萄球菌 ATCC25923,血琼脂平板。4. 质控无乳链球菌 ATCC13813 阳性，化脓性链球菌 ATCC19615 阴性。5. 操作步骤先用产溶血素的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上划一横线，再取待检的链球菌与前一划线作垂直划线接种，两者相距0.51cm。置35孵育1824小时，观察结果。6. 结果判断在两种细菌划线的交界处，出现箭头形透明溶血区为阳性。7. 注意事项被检菌与金黄色葡萄球菌划线之间留出0.51cm距离，不得相接。8. 临床意义主要用于鉴定B群链球菌（阳性），其他链球菌本试验阴性。通辽市医院检验科微生物室作业指导书Optochin敏感试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1. 目的规范Optochin敏感试验标准操作规程。2. 原理Optochin （ethylhydrocupreine,乙基氢化去甲奎宁的商品名）可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对其敏感，而其他链球菌对其耐药。3. 试剂血琼脂平板，Optochin纸片（含药5ug）。4. 质控肺炎链球菌 ATCC 49619阳性，粪链球菌ATCC 9790 阴性。5. 操作步骤将待检的溶血的链球菌均匀地涂布在血琼脂平板上，贴放Optochin纸片（含药5ug），35孵育1824小时，观察抑菌圈的大小。6. 结果判断抑菌圈10mm为肺炎链球菌。7. 注意事项7.1 做Optochin敏感试验的平板不能在CO2环境下培养，因其可使抑菌圈缩小。7.2 同一血琼脂平板可同时测定几株菌株，但不要超过4株被测菌。7.3 Optochin纸片可保存于冰箱中，一般可保存9个月。但如永已知敏感的肺炎链球菌检测为耐药时，纸片应废弃。8. 临床意义用于肺炎链球菌与其他链球菌之鉴别。肺炎链球菌对Optochin敏感，而其他链球菌则耐药。通辽市医院检验科微生物室作业指导书七叶苷试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1. 目的规范七叶苷分解试验标准操作规程。2. 原理粪肠球菌能分解七叶苷，其代谢产物与铁离子结合产生黑色沉淀，使培养基变黑。3. 试剂3.1 七叶苷琼脂成分蛋白胨 5g 磷酸氢二钾 1g牛肉膏 3g 七叶苷 1g枸橼酸铁0.5g 蒸馏水 1000mlpH 7.23.2 制备 上述各成分混合溶解后，调pH至7.2，分装试管，高压灭菌，冷藏备用。4. 质控粪肠球菌ATCC29219 阳性，肺炎链球菌ATCC49619 阴性。5. 操作步骤将试验菌接终于七叶苷琼脂斜面上，经35孵育1824小时后取出，观察结果。6. 结果判断培养基变黑色，为阳性。7. 注意事项7.1 若接种七叶苷液体培养基，阳性者经35孵育36小时，培养基即可变黑。7.2 其他链球菌亦能在此培养基上生长，但不变黑；肺炎链球菌不生长。8. 临床意义主要用于鉴别D群链球菌与其他非D群链球菌。 通辽市医院检验科微生物室作业指导书卫星试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1.目的规范卫星试验标准操作规程。2.原理金黄色葡萄球菌会产生一种扩散性蛋白CAMP因子(合成脱氢酶)，并渗入培养基中，刺激流感嗜血杆菌生长。3.试剂血琼脂平板，金黄色葡萄球菌。4.质控流感嗜血杆菌ATCC10211 阳性，卡他莫拉菌 ATCC49226 阴性。5.操作步骤挑取可疑菌落，接种于血琼脂平板上，作浓密连续划线后，再将金黄色葡萄球菌点种其上(24处)，于37 培养24小时后观察结果。6.结果判断 如见葡萄球菌菌落邻近处的菌落较大，而远离金黄色葡萄球菌菌落处的菌落小，即为“卫星现象”阳性。可初步鉴定为流感嗜血杆菌。7.注意事项若产生大的新月形或箭头形溶血，则为CAMP 阳性，即B型链球菌，而小区溶血及不溶血为阴性反应。8.临床意义用于流感嗜血杆菌与其他细菌的鉴别。通辽市医院检验科微生物室作业指导书糖（醇 苷）类发酵试验标准操作规程文件编号：XX-JY-CZ-XJ-XXX版本生效日期：共 页 第 页 1. 目的规范糖（醇、苷）类发酵试验标准操作规程。2. 原理不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖的能力各不相同，产生的代谢产物也随细菌种类而异。观察细菌能否分解各类单糖（葡萄糖等），双糖（乳糖等）、多糖（淀粉等）和醇类（甘露醇）、糖苷（水杨苷等），是否产酸或产气。3. 试剂3.1 成分蛋白胨 10g 牛肉膏 3g氯化钠 5g 溴甲酚紫指示剂 10ml 蒸馏水 1000ml3.2 制备将上述成分混合后，加热使其溶解。校正pH至7.17.2，用滤