改良角膜表面镜片术法建立兔曲霉菌性角膜炎动物模型.pdf

主堡塞堕里型盘查!生!旦筮!鲞箜!塑璺!也墨翌Q 业!堡!：!型!型垫!：!：!：坠：!1 0 l 实验研究改良角膜表面镜片术法建立兔曲霉菌性角膜炎动物模型刘廷徐园园陈豪谢立信【摘要】背景真菌性角膜感染动物模型是研究真菌性角膜炎发病机制的工具，目前的制作方法主要有划痕法、基质注射法和角膜表面镜片术法，但均有其不足之处。目的探讨一种简便、易操作的改良兔曲霉菌性角膜炎动物模型制作方法。方法成年新西兰白兔1 8 只，采用烟曲霉菌孢子附贴滤纸片的改良角膜表面镜片术法制作真菌性角膜炎动物模型。将浸有1 0 8 孢子m l(1 0 8 孢子m l 组，6 只)或1 0 6 孢子m l(1 0 6 孢子m l 组，6 只)真菌混悬液的滤纸贴敷于去上皮的角膜基质并用角膜接触镜覆盖，将浸有生理盐水的滤纸贴敷于另6 只兔眼角膜作为对照组。分别于造模后3、7、1 4d 裂隙灯下观察眼前节症状，参照D o n g 的标准进行症状评分。制备角膜刮片并用质量分数1 0 K O H 和荧光白染色在荧光显微镜下检测真菌菌丝，角膜组织切片分别行苏木精一伊红和过碘酸希夫染色，光学显微镜下观察角膜形态学改变和菌丝生长情况。对感染组织进行真菌培养以验证模型的质量。结果1 0 8 孢子m l 组和1 0 6 孢子m l 组真菌性角膜炎模型成功者分别为6 眼和4 眼，裂隙灯检查表明造模3d 后1 0 8 孢子m l 组眼前节症状明显重于1 0 6 孢子m l 组，且随着时间的延长，炎性损伤逐渐转向增生期。造模后3d 和7d，2 组感染的兔眼症状评分明显高于对照组，差异均有统计学意义(P O 0 1)，1 0 8 孢子m l 组兔眼的症状评分均明显高于1 0 6 孢子m l 组，差异有统计学意义(P O 0 1)，造模后1 4d，1 0 8 孢子m l 组兔眼的症状评分明显高于对照组，差异有统计学意义(P 0 0 5)。造模后3d 和7d，2组兔眼角膜刮片中均可见真菌菌丝。角膜组织病理学检查显示，造模3d 和7d 后1 0 8 孢子m l 组可见炎性细胞浸润和角膜基质细胞坏死，并可见真菌菌丝，造模后1 4d 可见新生血管长入。1 0 6 孢子m l 组炎症轻于1 0 3孢子m l 组。真菌培养结果表明，造模后3d 和7d 时1 0 5 孢子m l 组均见菌丝生长，而1 0 6 孢子m l 组仅在造模3d 时可见菌丝生长。结论改良角膜表面镜片术法可成功制备兔曲霉菌性角膜炎动物模型，是一种简便、易于操作的真菌性角膜炎动物模型制作方法。【关键词】曲霉菌；真菌性角膜炎；动物模型；角膜表面镜中图分类号R7 7 2 2 1R a b b i tm o d e lo fa s p e r g i l l u sk e r a t i t i si n d u c e db ym o d i f i e dc o r n e a ls u r f a c el e n sm e t h o du UT 讯g，X UY u a n y u a n C H E NH a o，X I EL i-x i n S t a t eK e yL a b o r a t o r yC u l t i v a t i o nB a s e，S h a n d o n gP r o v i n c i a lK e yL a b o r a t o r yo fo p h t h a l m o l o g y，S h a n d o n gE y eI n s t i t u t e，Q i n g d a o2 6 6 0 7 1，C h i n aC o r r e s p o n d i n ga u t h o r：X I EL i-x i n，E m a i l：l i x i n x i e p u b l i c q d s d c n【A b s t r a c t】B a c k g r o u n dA n i m a lm o d e lo ff u n g a lk e r a t i t i si sa na v a i l a b l et o o lt ot h ee x p e r i m e n t a ls t u d yo ft h ep a t h o g e n e s i sm e c h a n i s mo ff u n g a lk e r a t i t i s C u r r e n tm o d e l i n gm e t h o d so ff u n g a lk e r a t i t i si n c l u d e c o r n e a ls c r a t c h i n g，c o r n e a ls t r o m ai n j e c t i o na n dc o r n e a ls u r f a c el e n sm e t h o d s B u tt h e s em e t h o d ss t i l lh a v et h e i ro w ns h o r t a g e s O b j e c t i v eT h i se x p e r i m e n tw a st oc r e a t eaf u n g a lk e r a t i t i sa n i m a lm o d e lb ym o d i f y i n gc o r u e a ls u r f a c el e n s m e t h o d M e t h o d sM o d i f i e da n i m a lm o d e l so ff u n g a lk e r a t i t i sw e r ec r e a t e db ym o d i f i e dc o r n e a l s u r f a c el e n sm e t h o di n1 2g e n e r a la d u l tN e wZ e a l a n dw h i t er a b b i t s T h ef i l t e rp a p e r ss o a k e d1 0 8s p o r e s m lo rA 1 0 6 s p o r e s m lo fs p e r g i l l u s 丘m i g a t u ss u s p e n s i o nw e r ea t t a c h e do nt h ed e-e p i t h e l i a lc o r n e as u r f a c ea n df i x e dw i t hc o n t a c tl e n sa n dt a r s o r r h a p h yf o r2d a y s，a n dt h ef i l t e rp a p e rw i t hp h y s i o l o g i c a ls a l i n ew a su s e da sc o n t r o lg r o u p T h es y m p t o m so fa n t e r i o rs e g m e n tw e r ee x a m i n e du n d e rt h es l i tl a m pi n3，7a n d1 4d a y sa f t e rs u r g e r ya n ds c o r e db a s e do nt h ec r i t e r i aD O I：1 0 3 7 6 0 c m a j i s s n 2 0 9 5 _ 0 1 6 0 2 0 11 0 2 0 0 2基金项目：国家自然科学基金莺点项目(3 0 6 3 0 0 6 3)作者单位：2 6 6 0 7 l 青岛，山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地通信作者：谢立信，E m a i l：l i x i n x i e p u b l i c q d s d c n万方数据o fD o n g C o r n e a ls c r a p i n gw a ss t a i n e dw i t h1 0 p o t a s s i u mh y d r o x i d ea n dc a l c o f l u o rw h i t es t a i nt oo b s e r v e dm y c e l i u mu n d e rt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e C o r n e a lt i s s u es e c t i o n sw e r ee x a m i n e db yh e m a t o x y l i n e o s i ns t a i n i n ga n dp e r i o d i ca c i dS c h i f fs t a i n i n gu n d e rt h el i g h tm i c r o s c o p e T h eu s eo fa n i m a lf o l l o w e dt h eS t a n d a r do fA s s o c i a t i o nf o rR e s e a r c hi nV i s i o na n dO p h t h a l m o l o g y R e s u l t sF u n g a lk e r a t i t i sm o d e l sw e r es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e di n6e y e sa n d4e y e si n1 0 8s p o r e s m lg r o u p(6 6)a n d1 0 6s p o r e s m lg r o u pr e s p e c t i v e l y T h es y m p t o mw a sm o r es e v e r e ra n ds c o r ew a sh i g h e ri nt h ee y e so f1 0 5s p o r e s m lg r o u pt h a nt h a t i n1 0 6s p o r e s m lg r o u p A t3a n d7d a y sa f t e rs u r g e r y。t h es y m p t o ms c o r e so ff u n g a lk e r a t i t i sm o d e l sw e r eh i g h e rt h a nt h o s eo fc o n t r o lg r o u pf r o m3t h r o u g h7d a y sw i t ht h es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P 0 0 1)a n dt h es y m p t o ms c o r e so f10 8s p o r e s m lg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo f1 0 6s p o r e s m lg r o u p(P 0 0 1)A t1 4d a y sa f t e rs u r g e r y，t h es y m p t o ms c o r e so f1 0 8s p o r e s m lg r o u pw e r es t i l lh i g h e rt h a nt h o s eo fc o n t r o lg r o u p(P 0 0 5)F u n g a lh y p h a ew a gs e e ni nt h ec o r n e a ls c r a p e si n1 0 5s p o r e s m lg r o u pa n d1 0 6s p o r e s m lg r o u pr e s p e c t i v e l yf r o m3t h r o u g h7d a y sa f t e rs u r g e r y I n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o n，s t r o m ac e l l sn e c r o s i sa n df u n g a lh y p h a ew e r ep r e s e n t e di n1 0 8s p o r e s m lg r o u p。a n dt h ec o r n e a ln e o v a s c u l a r i z a t i o nc o u l db eo b s e r v e di n1 0 3s p o r e s m lg r o u p1 4d a y sl a t e r F u n g a lc u l t u r er e v e a l e dt h ep o s i t i v eo u t c o m ei nb o t h3a n d7d a y sa f t e rs u r g e r yi n1 0 8s p o r e s m lg r o u p，b u ti n1 0 6s p o r e s m l g r o u p，t h ep o s i t i v er e s u l tw a so n l yi nt h e3 r dd a y C o n c l u s i o nM o d i f i e dc o r n e a ls u r f a c el e n sm e t h o di sm o r ef e a s i b l ea n ds a m p l ei nt h em o d e lo fA s p e r g i l l u sk e r a t i t i s T h i sa n i m a lm o d e lo fA s p e r g i U u sk e r a t i t i si sp r a c t i c a lf o rt h ef u r t h e rs t u d yo ff u n g a lk e r a t i t i s K e yw o r d s】A s p e r g i l l u s；F u n s a lk e r a t i t i s；A n i m a lm o d e l；C o r n e a ls u r f a c el e n s真菌性角膜炎是一种严重的致盲性眼病，在中国感染性眼病中占据重要地位。在世界范围内，真菌性角膜炎的发病机制是感染性眼病研究的热点之一，而简便且易于操作的动物模型是研究真菌性角膜炎发病机制必不可少的工具。目前真菌性角膜炎的制作方法主要有划痕法、基质注射法和角膜表面镜片术法o。角膜表面镜片术法可模拟真菌性角膜炎自然感染方式，是研究真菌性角膜炎感染机制较为公认的方法。本研究采用改良角膜表面镜片术法成功制作兔曲霉菌性角膜炎模型，并获得较好的效果，报道如下。1 材料与方法1 1材料1 1 1实验动物普通级成年新西兰白兔1 8 只(山东省农科院动物中心提供)，体质量2 0 2 5k g，雌雄兼用。动物使用遵守A R V O 有关眼科实验动物要求。1 1 2 主要试剂及仪器定性滤纸(杭州新华造纸厂)；荧光白染色液(美国S i g m a 公司)；烟曲霉菌孢子(编号：3 0 7 7 2)(中国科学院微生物研究所菌种保存中心)；日抛型角膜接触镜(中国强生视力健商贸有限公司)；1 5 0 角膜穿刺刀及7 0m m 环钻(苏州市协和医疗器械厂)；盐酸氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)；盐酸氯丙嗪注射液(上海禾丰制药有限公司)；质量分数0 5 盐酸丙美卡因滴眼液 爱尔康(中国)眼科产品有限公司；氧氟沙星眼膏(沈阳兴齐制药厂)；质量分数0 3 氧氟沙星滴眼液(山东博士伦福瑞达制药有限公司)；E 8 0 0 型荧光显微镜(日本N i k o n 公司)。1 2 方法1 2 1动物模型的制作使用环钻钻取直径7 0m m滤纸片，灭菌后滴加1 0 斗l 不同浓度的真菌孢子混悬液备用。新西兰白兔采用肌内注射麻醉(盐酸氯胺酮2 5m g k g、盐酸氯丙嗪1 0m s k g)和0 5 盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，开睑器开睑，7 0m m 环钻于实验眼角膜中央压痕，1 5。角膜穿刺刀刮除切割范围内的全层角膜上皮，将滤纸片贴附于角膜基质表面，其上覆盖角膜接触镜，并将角膜与角膜接触镜之间空隙处的气泡挤出。结膜囊涂氧氟沙星眼膏，3-0 丝线间断缝合眼睑2 针使眼睑闭合，术后2d 拆除眼睑缝线，去除角膜接触镜和滤纸片，给予0 3 氧氟沙星滴眼液每日4次点眼。1 2 2 动物分组将1 8 只兔采用随机数字表法分成3 组，每组6 只，均使用单眼造模。A 组滤纸片中预先吸取1 0 一含烟曲霉菌1 0 8 孢子m l 混悬液，1 0 6 孢子m l 组手术方法同1 0 8 孢子m l 组，滤纸片中预先吸取1 0I L l 含烟曲霉菌1 0 6 孢子m l 混悬液。对照组不含烟曲霉菌混悬液，滤纸片中预先吸取1 0 山生理盐水。1 2 3 感染程度评分术后每日观察各组兔角膜感染情况，分别在菌株接种后的第3、7、1 4 天行裂隙灯显微镜检查并照相。兔眼感染程度评分标准参照D o n g等1 的方法：(1)角膜混浊面积评分。角膜混浊面积 7 5 评为4 分。(2)角膜透明程度评分。角膜轻度混浊，虹膜和瞳孔较清晰可见为1 分；角膜混浊，虹膜和瞳孑L 尚可见为2 分；角膜混浊，但尚未完全万方数据不透明评为3 分；完全不透明评为4 分。(3)角膜表面评分。角膜表面不光滑为1 分；角膜表面粗糙伴水肿为2 分；角膜明显水肿伴溃疡或后弹力膜膨出为3分；角膜穿孔或前葡萄肿为4 分。正常角膜按照以上3 种评分均设定为0 分。在动物模型制作的0、3、7、1 4d 进行角膜评分，角膜3 项评分相加作为综合临床评分。1 2 4 刮片检查在造模后的第3、7、1 4 天，各组均使用尖刀片刮取角膜溃疡区域边缘角膜组织，加入等份的质量分数1 0 K O H 和荧光白染色液各1 0“l，封片后在荧光显微镜下进行观察，透射光和紫外光下寻找菌丝。1 2 5 组织病理学检查及真菌培养在造模后的第3、7、1 4 天，用空气栓塞法各组分别处死1 只兔，沿角膜缘切取角膜，角膜中央切开后，使用体积分数4 甲醛固定每个角膜样本的I 2，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片后进行苏木精一伊红染色和过碘酸希夫染色，光学显微镜下观察角膜形态学改变和菌丝生长情况，每个样本的另外1 2 角膜进行真菌培养，在2 8 条件下于S a b o u r o u d培养基中培养2 3d 后观察结果。1 3 统计学方法膜明显充血，角膜表面粗糙，可见直径约7m m 轻度隆起的灰白色溃疡灶，角膜基质混浊水肿，虹膜纹理窥不清。造模后第7 天角膜水肿减轻，可隐约窥见虹膜和瞳孔，角膜中央仍可见明显的溃疡灶并有苔垢样坏死组织附着，溃疡边缘稍隆起、毛糙、不齐，部分兔眼溃疡边缘可见卫星灶，内皮面有内皮斑，角膜缘可见明显新生血管。造模后第1 4 天角膜溃疡灶愈合，可见大量的角膜新生血管长入，溃疡灶周边可见毛刷状毛细血管，灰白色的角膜瘢痕形成。1 0 6 孢子m l 组造模后第3 天结膜囊内可见少量黄白色脓性分泌物，结膜充血，角膜水肿明显，可见浅表的角膜溃疡灶，虹膜纹理窥不清。造模后第7 天角膜表面残留少量浅表溃疡，虹膜纹理清晰可见。造模后第1 4 天角膜上皮完全愈合，残留浅表角膜云翳。对照组造模术后第3 天角膜轻度水肿，虹膜纹理及浅表的上皮缺损灶可见，造模后第7 天时，角膜上皮基本愈合，造模后第1 4 天角膜完全恢复透明(图2)。计分毳?霖溯箬萎薯蔷君黼暗萋毳鬻篇徽荠尘x+s 表示。各组样本均数经L e v e n e 检验盖软性角膜接触镜c：术后2d 眼睑缝线拆线后可见接触镜及滤纸片在位，角膜水肿明P 0 0 5。采用完全随机单因素3 水平显，病灶周边町见白色脓苔设计，对3 个组兔眼角膜感染评分差异的总体比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用S N K q 检验。P 0 0 5为差异有统计学意义。2 结果2 1动物模型制备的成功率直径7m m 滤纸片中加入1 0 8 孢子m l 混悬液1 0 斗l 后，在暗视野显微镜下可见大量烟曲霉菌孢子附着于滤纸纤维上(图1 A)。采用接触镜内置孢子滤纸片的方法(图1 B)，1 0 8 孢子m l 组6只兔均成功诱导出真菌性角膜炎(图1 c)，1 0 6 孢子m l 组6 只兔中有4 只兔诱导出真菌性角膜炎。2 2感染眼的症状观察图2 兔曲霉菌性角膜炎动物模型的表现A c：分别显示l o s 孢子。1 组模型制1 0 8 孢子m l 组造模后第3 天可见作后3、7、1 4d 裂隙灯下兔角膜表现D F：分别显示1 0 6 孢子m l 组模型制作后3、7、结膜囊内大量黄白色脓性分泌物，球结1 48 裂隙灯下兔角膜表现G _ 1：分别显示对照组3、7、1 44 裂隙灯下兔角膜表现万方数据生堡塞验堕壁盘查!生!旦蔓望鲞笙!塑曼!也!曼翌Q e!尘!竺!：!型!型!：!：!：塑!：12 3 兔眼感染程度评分比较造模后3d 各组症状评分的总体比较差异有统计学意义(F=6 0 9 6，P=0 0 0)，1 0 5 孢子m l 组、1 0 6 孢子m l 组感染的兔眼症状评分明显高于对照组，差异均有统计学意义(q=1 1 2 6，P 0 0 1；q=3 6 7，P 0 0 5)，1 0 8 孢子m l 组兔眼的症状评分明显高于1 0 6 孢子m l 组，差异有统计学意义(q=6 0 6，P 0 0 1)。造模后7d 各组症状评分的总体比较差异有统计学意义(F=6 3 4 3，P=0 0 0)，1 0 8 孢子m l 组、1 0 6 孢子m l 组感染的兔眼症状评分明显高于对照组，差异均有统计学意义(q=8 5 7，P 0 0 1；q=3 6 7，P 0 0 5)，1 0 8 孢子m l 组兔眼症状评分明显高于1 0 6 孢子m l 组，差异有统计学意义(q=4 9 0，P 0 0 1)。造模后第1 4 天各组症状评分的总体比较差异有统计学意义(F=2 9 2 5，P=0 0 0)，1 0 8 孢子m l 组兔眼症状评分明显高于1 0 6 孢子m l 组和对照组，差异有统计学意义(q=3 5 4，P 0 0 5；g=3 2 4，P 0 0 5)(表1)。表1动物模型感染眼症状评分比较(i 蛳)注：与各自的对照组比较，6 P 0 0 5；与各自的1 0 6 孢子m l 组比较，。P 0 0 5(单因素方差分析，S N K q 检验)2 4 角膜刮片1 0 8 孢子m l 组造模后3d 时6 只眼角膜刮片中均可见到大量呈团状分布的真菌菌丝，术后7d 时1 0 8 孢子m l 组5只眼角膜刮片中仍可见菌丝散在分布于组织碎片中，呈鹿角样或树枝状(图3，4)。1 0 6 孢子m l 组造模后3d 时6 只眼角膜刮片中4 只眼真菌菌丝阳性，造模后7d 时5 只眼角膜刮片中2 只眼可见真菌菌丝。术后1 4d 时1 0 8 孢子m l 组和1 0 6 孢子m l 组角膜刮片中均未见到菌丝或孢子。对照组角膜刮片未见菌丝。2 5 组织病理学观察苏木精一伊红染色结果显示，1 0 8 孢子m l 组造模后3d 可见兔角膜基质细胞肿胀，较多炎性细胞浸润。造模后7d 可见兔角膜基质细胞变性坏死，角膜基质内炎性细胞明显减少。造模后1 4d 见角膜上皮小面形成，胶原纤维排列紊乱，基质层炎性细胞浸润减少，较多新生血管长入。1 0 8 孢子m l 组造模后3d 病理切片过碘酸希夫染色可见较多红染的斜行及垂直菌丝侵犯角膜基质深层；造模后7d，角膜溃疡表面可见少量菌丝，但基质深层未见菌丝；造模后1 4d，角膜基质内未见菌丝，可见纤维瘢痕形成(图5)。1 0 6 孢子m l 组角膜切片中组织破坏及炎性细胞浸润程度均明显少于1 0 8 孢子m l 组。对照组仅可见少量炎性细胞浸润及上皮增生。2 6 真菌培养1 0 8 孢子m l 组造模术后3d 和7d 兔角膜标本培养3d 后可见烟曲霉菌菌落生长，荧光白染色可见典型的烟曲霉菌菌丝和分生孢子(图6)。1 0 6 孢子m l 组造模后3d 时兔角膜标本接种，3d 后可见真菌菌丝生长，造模后7d 兔角膜标本经培养未见真菌生长。造模后1 4d，1 0 8 孢子m l 组和1 0 6 孢子m l 组兔角膜组织培养均未见真菌生长。3 讨论真菌性角膜炎动物模型对于研究疾病的发生发展机制有重要意义，动物模型的优劣明显影响实验的客观性和准确性，因此如何建立规范和可重复性好的动物模型一直是研究的重点，也是真菌性角膜炎发病机制研究的重要基础。图3 造模后3d 时，1 0 8 孢子m-组兔角膜刮片用1 0 K O H 湿片法结合荧光白染色观察菌丝(x 4 0 0)A：湿片在透射光下直接观察隐约可见分隔菌丝B：荧光显微镜下可见蓝染明亮的丛状分布的菌丝c：透射光与荧光叠加显示的菌丝图4 造模后7d 时，1 0 8 孢子m I 组角膜刮片用1 0 K O H 湿片法结合荧光白染色观察菌丝(x 4 0 0)A：湿片在透射光下直接观察，角膜组织刮片碎屑中隐约可见分隔菌丝B：荧光显微镜下可见蓝染明亮的树枝状菌丝C：透射光与荧光叠加显示菌丝万方数据主堡塞堕竖塾盘查!堡!旦筮丝鲞箜!塑曼!也!曼翌Q P!尘!竺!：!婴!型垫!：!：!：塑!：!1 0 5 图5 病理切片观察角膜组织真菌感染情况(P A Sx 4 0 0)A：1 0 8 孢子m l 组造模后3d 可见大甚炎性细胞浸润及较多红染的斜行及垂直菌丝侵犯角膜基质深层(箭头)B：1 0 8 孢子m l 组造模术后7d，角膜溃疡表面可见少量菌丝(箭头)，摹质深层未见菌丝，角膜基质层内炎性细胞明显减少C：1 0 8 孢子m l 组造模术后1 4d，角膜上皮修复。基质层内未见菌丝，可见纤维缀痕形成图6造模后7d 时，1 0 8 孢子m l 组角膜组织块真菌培养荧光白染色观察(4 0 0)A：角膜组织块周围形成烟曲霉菌菌落生长B：菌落刮片荧光白染色可见典型的烟曲霉菌分隔菌丝c：菌落刮片荧光白染色可见典型的烟曲霉菌球形分生孢子3 1 角膜表面镜片术法建立浅表真菌性角膜炎感染动物模型的优势目前真菌性角膜炎动物模型的制作方法中，国内外常用基质注射法建立深层真菌性角膜炎感染模型，此种方法真菌感染成功率高，但可破坏角膜板层结构，无法模拟浅表真菌性角膜炎感染早期的病变过程。而单纯的角膜表面划痕，结膜囊接种真菌孢子，因泪液的稀释和冲刷，以及泪液中可能存在的抗菌成分，导致模型成功率较低，一些研究者给予外源性糖皮质激素以提高模型的成功率，但会影响真菌对角膜的毒力，与自然病程有一定偏差，因此亦非最佳的浅表真菌性角膜炎动物模型制作方法。经典的角膜表面镜片术法是刮除角膜上皮后，角膜表面缝合外源性供体角膜片，在角膜植片和植床间接种真菌孢子悬液，此方法避免了菌液与泪液的接触，消除了泪液稀释和抗菌成分的干扰，动物模型感染成功率高，在4 8h 内可形成典型的浅表真菌性角膜炎动物模型，可模拟人的自然病程，便于观察浅表真菌性角膜炎的自然发展过程及症状特征变化，目前为最佳的浅表真菌性角膜炎动物模型，得到广泛的应用“。但经典的角膜表面镜片术对实验者手术操作要求较高，接种的真菌孢子处于液相载体的混悬液状态，需防止菌液漏出的问题。3 2 浅表真菌性角膜炎感染动物模型中角膜表面镜片术法的改良应用针对真菌孢子是处于液相载体这一问题，杜蕊等 1 采用了兔供体植片角膜接触镜内皮面划痕的方法，使曲霉菌孢子更易附着于供体植片的内表面，然后将供体植片再缝合于眼表，取得了较好的效果。S u n 等【8 1 将镰刀菌孢子预先培养种植于经特殊处理的角膜接触镜内表面，待菌丝生长后再覆盖在预先去上皮的小鼠角膜表面，也明显提高了感染成功率。这些方法的原理均为将真菌菌丝或孢子以固相载体滞留在眼表，模拟临床病程进行真菌感染。但这些方法中真菌种植需借助特殊处理植片或接触镜内表面，存在操作繁琐的缺点。本研究参考在碱烧伤动物模型中采用滤纸片吸附N a O H 的方法。将真菌孢子液滴加于滤纸片中，使真菌孢子附着于固相载体而不易被泪液稀释和冲刷，利用含真菌孢子的滤纸片作为角膜表面镜片，然后滤纸外表面覆盖软性角膜接触镜，不仅大大提高了真菌造模的成功率，而且操作简便，直接将不同浓度的孢子液滴加于滤纸上即可，并且可以在滤纸中定量接种真菌孢子，在一定程度上提高了实验中真菌感染严重程度的同一性。3 3 角膜表面镜片术法的菌液浓度应用我们先前的角膜表面镜片术中应用1 0 8 孢子m l液态曲霉菌液5 0 斗l 可成功制作兔曲霉菌动物模型。杜蕊等o 采用兔角膜植片内皮面划痕的改良角膜表面镜片术后，应用1 0 6 孢子m l 曲霉菌液1 0 0 l 即可成功制备兔曲霉菌感染动物模型。本研究初步探讨了本实验模型中菌液孢子的合适浓度，由于应用了灭菌滤纸片作为固相载体，因此明显减少了接种孢子的液体量，研究中加入两种浓度的孢子各1 0 斗l 进行实验，发现1 0 8 孢子m l 浓度制作真菌性角膜炎的成功率和病变的严重程度均明显高于1 0 6 孢子m l 浓度组，表明在角膜表面接种足够数量的真菌孢子也是本模型成功的重要条件。此外本研究中应用的荧光白染料可结合于真菌菌丝和孢子的细胞壁，紫外光下可清晰地观察到菌丝和孢子，在临床角膜炎刮片诊断中有助于提高诊断的阳性率一。10 1。在动物模型角膜刮片中还发现荧光白染料可帮助在组织碎屑中发现微量的菌丝和孢子。本研究采用改良的角膜表面镜片术法制作兔烟曲霉菌性角膜炎的方法目前尚未见报道，这种改良方法也可应用于其他感染性角膜疾病动物模型，例如接种万方数据1 0 6 特定数量的细菌或病毒、制作相应的感染性角膜病动物模型，此种模型制作方法值得眼科领域的科研工作者尝试和应用。参考文献：1 X i eL，Z h o n gW，S h iW。e ta 1 S p e c t m mo ff u n g a lk e r a t i t i si nn o r t hC h i n a J O p h t h a l m o l o g y。2 0 0 6，1 1 3：1 9 4 3 1 9 4 8 2 刘敬，谢立信，史伟云主要致病真菌在角膜中生长方式的研究 J 眼科研究，2 0 0 8，2 6：2 6 2 8 3 D o n gx，S h iW。Z e n gO，e ta 1 R o l e so fa d h e r e n c ea n dm a t r i xm e t a l l o p m t e i n a s e si ng r o w t hp a t t e r n so f f u n g a lp a t h o g e n si nc o r n e a J C u r tE y eR e s，2 0 0 5，3 0：6 1 3 6 2 0 4 张波，谢立信真菌性角膜炎的动物模型 J 国外医学：眼科学分册，2 0 0 5，2 9：1 6 7 1 7 0 5 H uJ，W a n gY，X i eL P o t e n t i a lr o l eo fm a e r o p h a g e si ne x p e r i m e n t a lk e r a t o m y e o s i s J I n v e s tO p h t h a l m o lV i sS e i。2 0 0 8，5 0：2 0 8 7 2 0 9 4 6 银红梅，钟文贤，谢立信真菌性小鼠角膜炎中炎性因子的表达 J 中华眼科杂志2 0 1 0，4 6：8 2 1 8 2 8 7 杜蕊，吴洁，马吉献，等兔曲霉菌性角膜炎动物模型建立及角膜共焦显微镜检查 J 第四军医大学学报，2 0 0 6，2 7：1 9 2 5 1 9 2 8 f 8 1S u nY C h a n d r aJ，M u k h e q e eP，e ta 1 Am u f i n em o d e lo fc o n t a c tl e n s a s s o c i a t e df u s a r i u mk e r a t i t i s【J I n v e s tO p h t h a l m dV i sS e i，2 0 1 0，5 1：1 5 l l 一1 5 1 6 9 J o s e p hJ，S r i d h a rM S，M u r t h ys，e ta 1 C l i n i c a la n dm i c r o b i o l o g i c a lp r o f i l eo fm i c r o s p o r i d i a lk e m t o c o n j u n c t i v i t i si ns o u t h e r nI n d i a J O p h t h a l m o l o g y。2 0 0 6 1 1 3：5 3 1 5 3 7 1 0 S h a r m aS，K u n i m o t oD Y。G o p i n a t h a nU，e ta 1 E v a l u a t i o no fc o r n e a ls c r a p i n gs m e a re x a m i n a t i o nm e t h o d si nt h ed i a g n o s i so fb a c t e r i a la n dl u n g s|k e r a t i t i s：as u r v e yo fe i s h ty e a r so fl a b o r a t o r ye x p e r i e n c e【】C o r n e a 2 0 0 2。2 l：6 4 3 6 4 7(收稿日期：2 0 1 0 1 2-0 1 修回日期：2 0 1 0-1 2-3 0)(本文编辑：尹卫靖)第1 2 届全国视觉生理学术会议全国视觉电生理继续医学教育学习班通知，鸯垂由中华医学会眼科学分会视觉生理学组主办、温州医学院附属眼视光医院承办的“第1 2 届全国视觉生理学术会议暨全国视觉电生理继续医学教育学习班”将于2 0 1 1 年6 月9-1 2 日在浙江省温州市召开。6 月91 3 报到，6 月1 0 一1 2 日上午为会议交流，6 月1 2 日下午撤离。参会者将获得国家级继续教育学分证书。诚邀国内外眼科专家与同道及眼科企业界人士踊跃参会。1特色：在全面诠释视觉电生理基本概念、基本技能的基础上，突出视觉电生理在视网膜疾病诊治中的应用；同时将安排实验操作(W O R KS H O P)时间，让参会者切实体验视觉电生理的规范化操作与检查结果的正确解读。2 投稿方式：投稿请通过E m a i l 信箱：2 0 1 1 C V P C m a i l e y e a c c n 递交您的论文摘要(6 0 0 字左右)，摘要应包括目的、方法、结果、结论四要素。投稿主题请注明“第1 2 届全国视觉生理学术会议征文”，邮件正文中请注明作者姓名、职称、单位名称和地址、邮编、手机号码及电子邮件地址。征文截止日期为2 0 1 1 年3 月3 1 日，欢迎踊跃投稿。会务组通讯地址：浙江省温州市学院西路2 7 0 号温州医学院附属眼视光医院眼底内科邮政编码：3 2 5 0 2 7，联系人：刘晓玲，李英姿。电话(传真)：0 5 7 7 8 8 0 6 8 8 5 6，E m a i l：l y z m a i l e y e 北c n。第1 2