猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探_唐历波.pdf

基因组学与应用生物学，2010 年，第 29 卷，第 2 期，第 293-297 页Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.2,293-297研究报告A Letter猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探唐历波*姬可平王燕陈锦永遵义医学院珠海校区生化教研室,珠海,519041*通讯作者,摘要为了进一步分析猪笼草瓶状体内消化液中蛋白质的性质，本研究在不同的温度和 pH 条件下测定消化液中蛋白酶的活性，并且比较了 3 种不同沉淀方法对消化液蛋白进行的浓缩，通过 SDS-聚丙烯酰胺电泳对消化液蛋白作了初步分离。结果表明，猪笼草消化液中蛋白酶的最适酶活温度为 50，且稳定性最高；当 pH 为 5 时，该蛋白酶活性出现峰值，采用氯仿-正丁醇法(5:1)沉淀浓缩猪笼草消化液蛋白样品效果最佳。聚丙烯酰胺电泳结果表明，消化液至少包括三种蛋白组分，分子量分别为 24.3 kD、35.1 kD 和 61.4 kD，且35.1 kD 条带具有抗胰蛋白酶消化活性。本研究为综合开发利用猪笼草野生资源提供理论依据。关键词猪笼草,蛋白酶活性,温度,pH,SDS-PAGEPreliminary Study on the Activities of Protease in Digestive Juice of PitcherPlantTang Libo*Ji KepingWang YanChen JingyongDepartment of Biochemistry ZhuhaiCampus Zunyi Medical College,Zhuhai,519041*Corresponding author,DOI:10.3969/gab.029.000293AbstractIn order to analyze the character of the protein of the digestive juice in the ascidium of pitcher plant,wecarried out a study of effect in different temperature and pH on activity of protease in digestive juice of pitcher plantwe also compared 3 kinds of precipitation methods of protease concentrate and isolated protein sample in digestivejuice byusing SDS-PAGE.The results showed that the optimum temperature of protease in digestive juice in the as-cidium was 50 with the maxlmum stability,and the peak value of activityof protease was found with the pH5.Ex-perimental results indicated the best method of the protein concentrate was chloroform/butanol(5:1),and there wereat least three kinds of protein component with different MW,i.e.24.3 kD,35.1 kD and 61.4 kD,respectively,it wasalso shown that the protein with 35.1kD has the character of antitrypsine.This research should supply some evi-dences for the exploitation and utilization reasonable in wild resource ofpitcher plant.KeywordsPitcherplant(Nepenthes mirabilis),Activityofprotease,Temperature,pH,SDS-PAGEwww.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000293基金项目：本研究由遵义医学院校区启动基金(KY200603)资助猪笼草为猪笼草科(Nepenthaceae)猪笼草属(Nepenthes)，中国野生猪笼草(Nepenthes mitabilis(lour.)Druce)只有一个种(陈焕镛,1965)，分布在广东西南部、香港及海南岛的丘陵灌丛中或酸性沼泽边缘(徐迟默,2003)。猪笼草是热带食虫植物的代表种(杨光穗等,2006)，由于生长在比较贫瘠的土壤中，而且根系很不发达，所以很难获得足够的养料，为了适应环境生存下去，在长期的自然选择和遗传变异中，叶子慢慢变化演变成奇妙的“捕虫器”，即食虫囊。猪笼草通过这种特殊的变态叶将昆虫或其他小型动物捕获，并通过变态叶的消化腺分泌消化液将其消化从中获得营养，特别是获得硝酸盐来补充光合作用。而对于猪笼草变态叶的解剖特点，吴钿和叶昌辉(2000)研究认为瓶状体是由叶卷须膨大形成，在瓶状体内基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biologywww.genoapplbiol.orgDOI:10.3969/gab.029.000293部下缘，密生燕窝状腺体，能分泌酸性消化液。对猪笼草瓶状体内消化液的研究，还没有相关的报道，我们前期预试验表明，猪笼草未打开瓶盖的囊中消化液中含有蛋白质成分。本研究通过比较不同的沉淀浓缩分离蛋白的方法，对消化液蛋白质性质做初步鉴定，为猪笼草的开发应用提供理论依据。1结果与分析1.1瓶状体内消化液总蛋白含量测定通过线性拟合得牛血清白蛋白(BSA)的量(mg)与吸光度 A 的关系式为：y=0.205x+0.043 1(式中 y 为牛血清白蛋白的量(mg/mL)，x 为吸光度)。式中的 BSA浓度相关系数为 0.995 9，BSA 蛋白含量标准曲线如图1 所示。按 3.3 测得不同老嫩程度的猪笼草囊内消化液可溶性蛋白含量如下(其中 14 为稀释倍数)：未成熟瓶状体内消化液蛋白含量为：y=(0.2050.018+0.043 1)14=0.655 2 mg/mL；成熟瓶状体内消化液蛋白含量为：y=(0.2050.092+0.043 1)14=0.868 0 mg/mL；衰老瓶状体内消化液蛋白含量为：y=(0.2050.139+0.043 1)14=1.002 4 mg/mL；试验重复六次，消化液测定结果表明，随着瓶状体发育的成熟，其内部消化液蛋白含量呈增加趋势，至发育后期，蛋白含量达最高值。1.2蛋白酶活性测定按 3.4 操作，蛋白酶活力测定结果如图 2，50条件下，无论新鲜液还是放置 6 h 的消化液均保持较高的酶活性。由图 2B 可知新鲜消化液最适 pH 为 5，离体室温条件下，酶活性丧失较大，但在等电点(11)，粗酶液出现红色絮状沉淀，而酶活性丧失较小，说明离体条件下酶活性不稳定。1.3聚丙烯凝胶电泳由图 3 可知，TCA 法沉淀的蛋白样品电泳拖尾现象严重；而 Sevag 法沉淀所得的蛋白样品较为清晰，利用 Sevag 法沉淀猪笼草粗消化液蛋白效果较好。在 37条件下，用胰蛋白酶处理 12 h，在分子量为 35.1 kD 处仍保留一条条带，而其它位置的条带丧失，比对胰蛋白酶分子量为 25 kD，该条带应为消化液本身条带，说明猪笼草消化液中具有抑制胰蛋白酶活性成分。由图 4 及图 5 可知，两种蛋白质沉淀法均可浓缩消化蛋白混合液，而采用 Sevag 法沉淀的消化液蛋白经 SDS-PEAG 电泳后显示的条带清晰，综合两种沉淀法结果，猪笼草消化液蛋白质是一种混合消图 1 BSA 蛋白含量标准曲线Figure 1 The standard curve of BSA protein level图 2 温度和 pH 对蛋白酶活性影响注:A:温度对蛋白酶活性影响;B:pH 对蛋白酶活性影响Figure 2 The effect on the activity of protease with temperatureand pHNote:A:The effect on the activity of protease with different tem-perature;B:The effect on the activity of protease with pH294猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探PreliminaryStudyontheActivitiesofProteaseinDigestiveJuiceofPitcherPlant化酶，至少包括三种组分：蛋白分子量约为 24.3 kD、蛋白分子量约为 35.1 kD 以及蛋白分子量约为61.4 kD，其中蛋白具有抗胰蛋白酶消化活性。2讨论2.1猪笼草消化液中蛋白的定量分析结果表明未成熟猪笼草瓶状体内蛋白含量较少，而成熟猪笼草消化液中含有一定量可被胰蛋白酶降解的蛋白，经测定该类蛋白具有胃蛋白酶活性。因此可以得出猪笼草消化液中含有蛋白水解酶，并且其消化液中蛋白类消化酶均为猪笼草变态叶成熟到一定程度所分泌的产物，其活性在笼状体整个发育阶段均保持稳定。2.2 pH对消化液中蛋白酶活性影响猪笼草瓶状体消化液中蛋白酶的最适 pH 为 5。随着 pH 的升高，蛋白酶活性逐渐降低，但 pH 为 11处出现了另一峰值。说明猪笼草消化液是一种适应广的消化液。可在不同的 pH 条件下发挥作用。在动物体内，如鱼体内不同部位的消化道中蛋白酶的性质不同(Kawais and Ikedas,1972)，胃中提取的蛋白酶为酸性蛋白酶，酸性条件下酶活性较高；肠中提取的蛋白酶为碱性蛋白酶，在碱性条件下具有较高的活性(Esalassen,1986)。说明猪笼草消化酶是一种有别于图 3 Sevag 与 TCA 法沉淀方法比较(A)以及胰蛋白酶抗性(B)注:T:TCA 法沉淀的蛋白样品;S:Sevag 法沉淀所得的蛋白样品;M:Marker;1:胰蛋白酶 37水浴 12 h;2:胰蛋白酶与 Se-vag 法沉淀所得蛋白混合 37水浴 12 h;3:Sevag 法沉淀所得蛋白 37水浴 12 hFigure 3 The comparison between Sevag and TCA(A)and theresearch for antitrypsin(B)Note:T:The protein sample with TCA precipitation method;S:Protein sample with Sevag precipitation method;M:Marker;1:Thetrypsinsolutionwasincubatedina waterbath at 37 for12 h;2:Trypsin and mixed proteins obtained by Sevag precipitationmethod were incubated in a water bath at 37 for 12 h;3:Pro-teins obtained by Sevag method were incubated in a water bath at37 for12 h图 4 消化液中蛋白的 SDS-PEAG 电泳图注:m:预染 marker;M:非预染 marker;16:Sevag 法 6 次重复沉淀的消化液蛋白Figure 4 SDS-PAGE of the protein in digestive juiceNote:m:The marker with pre-staining;M:The marker withnon-staining;16:The protein in digestive juice treated by sevagmethod for 6 times图 5 等电点沉淀法的初纯化结果 SDS-PEAG 电泳图注:m:预染 marker;M:非预染 marker;14:等电点沉淀法沉淀的蛋白样品Figure 5 SDS-PEAG of the protein which purified by isoelectricprecipitation methodNote:m:The marker with pre-staining;M:Non-staining marker;14:The protein samples treated by by isoelectric precipitationmethod295基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology动物消化酶的新型消化酶，具有一定的开发价值。2.3温度对消化液中蛋白酶活性的影响一般来说，在一定温度范围内，随着温度的升高酶催化反应的速度加快；但超过一定的温度后，酶的催化反应的速度反而随温度的升高而减慢(肖美燕和徐尔尼,2007)。本实验结果表明猪笼草消化液中蛋白酶的最适温度为 50，在最适温度以下，随温度的升高酶活性逐渐增加，超过最适温度，随温度的升高酶活性逐渐降低。猪笼草属热带植物，对环境温度要求较高(张荣京等,2007)。实验结果显示，猪笼草消化液中蛋白酶的最适温度高于其环境温度，这与目前了解的其它动物消化酶(Kawais and Ikedas,1972)活力的最适温度均高于所处环境的温度的普遍现象是一致的(Das and Tripathi,1991)。2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳猪笼草消化液的 pH 约在 25.8 范围内，而 12%TCA 对酸性蛋白的沉淀的效果不好。用 TCA 沉淀消化液中的蛋白经过 SDS-PAGE 电泳后蛋白条带拖尾严重，可能与蛋白本身所带电荷有关。Sevag 法沉淀蛋白的效果是 TCA 的 3.8 倍(何志伟等,2007)，并且 SDS-PEAG 电泳结果条带较为清晰。因此，可选用Sevag 法配合 SDS-PEAG 对蛋白酶进行定性分析。用等电点沉淀法分离蛋白酶取得了一定的效果，但消化液中有部分蛋白等电点与该蛋白酶较接近，给分离纯化造成了一定的阻力。人胃蛋白酶分子量 34.5 kD(王莹和张丽萍,2008)。从实验结果上看，电泳分离结果中有一条蛋白条带分子量与蛋白酶相近，但 SDS-PAGE 得出的结果只是目的蛋白的表观分子量，猪笼草消化液中可能同时存在多种蛋白酶。因此，需要通过双向电泳进一步分离消化液，并通过氨基酸序列分析，确定消化液的蛋白质成分。3材料与方法3.1供试材料和处理野生猪笼草(Nepenthes mirabilis(Lour.)Druce)(中国植物图像数据库鉴定)，来源于遵义医学院珠海校区后山。原始标本保留于本教研室标本室，标本编号 ZYSH-1018。取猪笼草酶液经滤纸过滤，滤液 412 000 r/min 离心 20 min，取上清即为酶粗提液。3.2实验仪器和试剂超速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)；UV-2500 紫外分光光度计(日本岛津)；DYY-7c 型电泳仪(北京市六一仪器厂)。考马斯亮兰 R-250，牛血清白蛋白，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED，冰醋酸，氯仿，正丁醇，胰蛋白酶等试剂来源于本院生物工程重点实验室，胃蛋白酶测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。3.3标准曲线的制作及酶粗提液蛋白含量的测定用牛血清白蛋白制备标准蛋白曲线，分别取不同老嫩程度(根据瓶状体瓶盖开放时间及消化液颜色判断,标准为:瓶状体瓶盖开放前 7 d 内为未成熟瓶状体;瓶状体瓶盖开放后 14 d 内为成熟瓶状体；成熟期过后直至枯萎期间为衰老瓶状体)的猪笼草叶瓶状体内酶粗提液 1 mL，在 595 nm 波长下测其吸光度，与标准曲线比对求酶粗提液蛋白含量。3.4酶活力测定3.4.1 蛋白酶活力测定根据胃蛋白酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作步骤进行。蛋白酶活性定义为：每毫升酶液在一定的 pH 和温度下，每 1min 分解蛋白生成 1 g氨基酸相当于一个酶活力单位(即 1 个酶活力单位=1 g酪氨酸/min/mL 酶液)。3.4.2 反应温度和 pH 的设定在 pH=3.4 条件下设定 4、18、25、37、50、60、70以及 80为酶反应温度，分别测其酶活力。各组酶液分别在其相应的温度 6 h 后重复测定一次。在温度为 37条件下设定 pH 2、pH 3.4、pH 5、pH 7、pH 9 和 pH 11 为酶反应 pH，分别测其酶活力。过夜重复测定一次。3.5聚丙烯凝胶电泳消化液酶蛋白的浓缩：为有效分离猪笼草消化液中的蛋白酶，分别采用三种沉淀方法，即等电点沉淀法(周先碗和胡晓倩,2003)，TCA 沉淀法(余兰和于香安,2004)和 Sevag 法(氯仿-正丁醇法)沉淀法(余华,2005)，并比较了三种浓缩方法的优劣。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：电泳条件：SDS-PAGE，胶联度：12%；缓冲体系：甘氨酸缓冲液；恒压 100 mv；电泳时间 2 h。参考文献Chen H.Y.,ed.,1965,Flora hainanica,Vol.2,Science Press,Bei-www.genoapplbiol.orgDOI:10.3969/gab.029.000293296猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探PreliminaryStudyontheActivitiesofProteaseinDigestiveJuiceofPitcherPlantjing,China,pp.384(陈焕镛,主编,1965,海南植物志,第 2 卷,科学出版社,中国,北京,pp.384)Das k.M.,and Tripathi S.D.,1991,Studies on the digestive en-zymes of grass carp,Ctenopharyngodon idella(Val.),Aqua-culture,92:21-30Esalassen M.,1986,Purification and some properties of twoN-acetylhextacean decapods,Comp.Biochem.Physiol.,85(6):235-239He Z.W.,Liu Z.D.,Shao B.,Wei G.H.,and Xu 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