MTT实验操作流程.doc

MTT实验标准操作流程1. 原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（即OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。2. 试剂及耗材CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基 胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板3. 注意事项MTT溶液的配制，通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。MTT一般最好现用现配，0.22m过滤后4避光保存两周内，或配制成5mg/ml保存在-20长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当MTT变为灰绿色时不能再用。DMSO可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。4. 实验步骤：4.1 细胞标准曲线制作4.1.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10104/ml。4.1.2 取4块96孔板，分别标记为0h、24h、48h、72h，每组设置3个复孔，每孔加入100 L细胞悬液，每板分别铺8组细胞，分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。4.1.3 5%CO2，37培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测： a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长l570nm的吸光值；4.1.4 标准曲线制作以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。4.2 MTT药物毒性实验步骤4.2.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10104/ml，药物毒性实验一般每孔细胞数量500010000个（具体数目根据预实验判断）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4.2.2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入90l细胞悬液, 这样待测细胞的密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加5个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。4.2.3 5%CO2，37培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物。（原则上，细胞贴壁后即可加药，或两h，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。加药时按照所需的浓度在EP管中先稀释好，每孔加入10l已经稀释好药物，使每孔最终体积为100l，为了避免产生误差，稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。需要注意的是，以DMSO作为溶剂溶解的药物至少需要进行100倍以上稀释才能使用，因为作用于细胞DMSO的含量高于1%时，DMSO会杀死细胞从而影响判断。）4.2.4 按照药物作用时间点，每24 h取出一块96孔板检测：a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值；4.2.5同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。4.2.6 MTT结果分析IC50值可以通过Graphpad prism5进行计算4.3 MTT增殖实验4.3.1 分别收集各组对数期的细胞，调整细胞悬液浓度； 4.3.2 取4块96孔板，每孔加入100 L细胞悬液，铺板使待测细胞为5103 cell/孔（边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应），每组设置3个复孔； 4.3.3 5%CO2，37培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测： a) 每孔加入20 L MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4h； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔加入150L DMSO，使结晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值。4.3.4 数据处理及MTT增殖曲线绘制。