《普通遗传学实验指导》.doc

普通遗传学 实验指导 PU TONG YI CHUAN XUE SHI YAN ZHI DAO郑茂波 编著哈 尔 滨 学 院前言 遗传与变异问题是生命科学研究的核心。随着其他相关学科的发展, 遗传学逐步实现从对生物个体的表现型描述向较为精密的实验科学的飞跃, 从而成为生命科学研究的前沿领域。遗传学与许多学科相结合形成许多交叉学科, 如遗传学与细胞学结合形成细胞遗传学；遗传学与生物化学相结合形成分子遗传学；遗传学与数学相结合形成数量遗传学；遗传学与物理学相结合形成辐射遗传学等, 反映在实验手段上比遗传学发展的早期更为多元化。20世纪50年代, DNA双螺旋模型的建立标志着分子遗传学的诞生, 是生物学发展史上的里程碑。 普通遗传学实验是配合遗传学理论教学而设置的一门基础课程, 通过实验课的教学, 力求使同学们能够对遗传学的基本理论和概念有更加深刻的认识, 激发同学们对探索遗传学规律的浓厚兴趣。更为重要的是, 在实验过程中培养同学们观察问题、分析问题和解决问题的能力, 锻炼同学们实际操作能力。 哈尔滨学院遗传学教研室通过多年的教学实践, 在综合考虑到培养目标、学时设置、本门课程与其他课程教学内容重叠情况等因素的情况下, 选用了本书所包括的实验内容, 其中有经典遗传学实验、细胞遗传学实验、微生物遗传实验和分子遗传学实验。通过这些实验, 可以使同学们对遗传学的主要研究方法和手段有一概括的了解, 并在实验课中得到一定的训练。初步具备进行遗传学研究的基本实验方法和手段。由于课程设置的变化, 现已经把原来遗传实验中有关质粒DNA的提取和分子杂交等实验内容列入到分子生物学实验教学之中, 因此, 请同学们在学习过程中注意参考有关课程的实验内容, 从而对遗传学的实验方法有较为全面的认识。教师可以根据课时安排和学生情况对实验内容作适当调整。 书中采用的图片除特殊说明外, 均为本实验室在遗传学研究和实验教学过程中所拍摄和制作的。许多教师和工作人员在教学实践中对实验内容和教学方法提出过许多宝贵的意见和建议, 使得遗传学实验的教学得到不断完善。学院多届同学参与了大部分实验内容的操作和改革, 并编写和提供了部分实验素材, 对此我们深表谢意! 由于时间仓促以及我们的水平有限, 教材之中可能会有不妥之处, 希望各位同仁给予批评指导, 我们将不胜感激。 作 者 2010 年9 月于哈尔滨目录实验1 植物染色体标本制备1 实验2 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察4 实验3 孚尔根核反应染色法6 实验4 减数分裂与配子形成11实验5 果蝇的培养与性状观察29实验6 果蝇唾腺染色体的制备和观察32 实验7 果蝇杂交实验36 实验8 高等植物有性杂交39 实验9 四分子遗传分析：粗糙链孢霉的分离和交换43 实验10 染色体组型分析47 实验11 去壁低渗法制备植物染色体标本52 实验12 人类染色体分析：外周血培养及制备染色体标本59 实验13 植物染色体分带技术66 实验14 姐妹染色单体差别染色69 实验15 植物多倍体诱导及其细胞学鉴定85 实验16 性染色质：人体X染色质观察 90 实验17 细胞微核（micronucleus）检测技术96 实验18 植物总DNA的提取 100 实验19 细菌基因组DNA的提取106 实验20 质粒的提取109 实验21 细菌的转化实验90 实验22 细菌转导96 实验23 基因突变分析与检测100 实验24 荧光原位杂交实验 106 实验25 数量性状的遗传分析109 实验26 遗传平衡定律 113 附录1 实验室常用试剂的配制 116 附录2 不同的值及自由度时的P值表 119 实验一 植物染色体标本制备一、实验目的 1、学习植物根尖压片标本制备方法的基本技术。2、熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体形态和结构上的动态变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。二、实验原理 有丝分裂是高等动植物体细胞分裂的主要方式，高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。在有丝分裂过程中，真核细胞的染色质凝集成染色体，每个染色体能复制一份，复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向两极，精确地平均分配到两个子细胞中去，从而使产生得两个子细胞及与其母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。由于染色体上有遗传物质DNA，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。染色体的这种特异性、恒定性、连续性和在细胞分裂过程中的正确复制及分配被确认为是遗传物质的载体，是遗传传递规律的细胞学基础。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。三、实验材料 洋葱（Aillum cepa）根尖，蚕豆（Vicia faba）根尖 。四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片；Carnoy固定液、改良苯酚品红染色液、0.002M 8-羟基喹啉水溶液、0.050.2% 秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1M HCl、加拿大树胶。五、实验方法和步骤（一）材料准备 1、培养洋葱根尖 选取底盘大的洋葱做生根材料，剥去外层老皮，用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽，将洋葱的鳞基置于盛水的小烧杯（或广口瓶）上，让洋葱的底部接触杯内的水面。把小烧杯放进2025培养箱内培养。培养时注意每天换水12次，防止烂根。待根长约1.5 cm时，在上午九时取健壮的根尖进行预处理。 2、种子培养根尖 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进2025培养箱内培养。当根尖长11.5cm 时，即可以在上午九时取生长旺盛的根尖进行预处理。 （二）预处理 目的，使获得中期分裂相较多的细胞，使染色体缩短，分散，形态结构稳定，便于压片，有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数。 预处理机理：阻止或破坏纺纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；改变细胞质的粘度；导致染色体高度浓缩、变短，利于染色体的分散。在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。处理的方法如下： 1秋水仙素水溶液 常用浓度为0.050.2%，室温下处理34小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。 2对二氯苯饱和水溶液 室温下处理35小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。 38-羟基喹啉水溶液 使用浓度为0.0020.004M，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理24小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。 4低温处理 将材料如小麦，浸入蒸馏水内，放置到14冰箱中（玉米及水稻68）处理2024小时，也起到良好的效果。 （三）固定 通常采用的是Carnoy固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理324小时。材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内04保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。 （四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到小烧杯内，用蒸馏水漂洗，再加入1N HCl溶液，在60下水解820分钟（洋葱用8分钟，蚕豆侧根用10分钟，玉米用20分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。（五）漂洗 解离后的根尖用蒸馏水漂洗34次，用吸管吸干水。漂洗时间和次数一定要足够，否则影响染色效果或染不上色（六）染色、压片 将解离漂洗后的根尖放在小培养皿里，滴加改良苯酚品红染色液染色10分钟左右。制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取1mm左右的生长区，其余部分弃掉，加1滴染色液，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸用拇指适当用力下压，用解剖针（或竹签）敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，使材料分散成薄薄的一层，以盖玻片不破裂为准。 （七）观察 将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变化。 （八）永久装片 由临时压片材料制做成永久玻片标本，可以将玻片放在CO2干冰或生物切片半导体冰冻机上，待玻片结冰后，取出玻片，用刀片迅速揭开盖玻片，放在空气中干燥后，用封藏剂（加拿大树胶）封固。六、作业 1、每人制作两张洋葱根尖细胞分裂的临时装片。 2、根据自己在实验中观察到的各时期的细胞特点，绘制有丝分裂前期、中期、后期的简图，并能区分各时期细胞的特点。3、解释什么是染色单体？什么是子染色体？子细胞中的染色体与母细胞中的染色体是否相同，为什么？有什么生物学意义？七、学习资料有丝分裂，又称为间接分裂，由W. Fleming (1882)年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于 (动物和高等植物)。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。通过有丝分裂，每条染色体精确复制成的两条染色单体并均等地分到两个子细胞，使子细胞含有同母细胞相同的遗传信息。有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述人为的划分为六个时期：间期（interphase）、前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)。不同时期的染色体的形态和行为是各不相同的。间期是DNA合成和细胞生理代谢活动旺盛的时期，占细胞周期的大部分时间。根据细胞内染色体的形态和DNA合成情况，又可将间期划分成：G1期此时没有DNA复制，但有RNA和蛋白质合成。S期此时细胞内进行DNA合成，将DNA总量增加一倍。G2期此时细胞里含有两套完整的二倍体染色体，不再进行DNA合成。M期（分裂期）此时染色体真正开始分裂。在间期结束时， DNA以染色质的状态存在于细胞核中，细胞运作正常。前期：染色质丝螺旋缠绕，缩短变粗，高度螺旋化成染色体。每条染色体包括两条并列的姐妹染色单体，这两条染色单体有一个共同的着丝点连接着。并从细胞的两极发出纺锤丝。梭形的纺锤体出现，染色体散乱分布在纺锤体的中央,细胞核分解，核仁消失，核膜逐渐解体。中期：细胞分裂的中期，纺锤体清晰可见。这时候，每条染色体的着丝点的两侧，都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的一个平面上。这个平面与纺锤体的中轴相垂直，类似于地球上赤道的位置，所以叫做赤道板。分裂中期的细胞，染色体的形态比较固定，数目比较清晰，便于观察清楚。在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。后期：由于纺锤丝蛋白收缩，着丝粒纵向分裂，每个染色体的二个染色单体分别向两极移动。由于着丝粒在每个染色体上位置的不同，可呈现不同的形状。染色单体就成为子染色体。末期：分裂后的两套染色体到达两极后开始在两极聚集并解螺旋形成染色质丝，逐渐变细变长，纺锤丝消失，核仁、核膜重新重建，细胞扳在细胞中央赤道扳形成，一个细胞分裂形成了二个子细胞。动、植物细胞有丝分裂的过程的不同点是：1、动物细胞有中心体,在细胞分裂的间期,中心体的两个中心粒各自产生了一个新的中心粒,因而细胞中有两组中心粒.在细胞分裂的过程中,两组中心粒分别移向细胞的两极.在这两组中心粒的周围,发出无数条放射线,两组中心粒之间的星射线形成了纺锤体.2、动物细胞分裂末期,细胞的中部并不形成细胞板,而是细胞膜从细胞的中部向内凹陷,最后把细胞缢裂成两部分,每部分都含有一个细胞核.这样,一个细胞就分裂成了两个子细胞表1-1 不同材料采用不同预处理方法获得的效果（供参考）植物名称染色体数(2n）处 理 因 素处理时间温 度效 果*小麦420.2%秋水仙素水溶液9:00-11:0025+小麦42对二氯苯饱和水溶液10:00-14:00室温+小麦4214冰箱20-24小时14+小黑麦56对二氯苯饱和水溶液10:00-14:00室温+豌豆14对二氯苯饱和水溶液10:00-11:30室温+烟草48对二氯苯饱和水溶液8:30-11:30室温+蚕豆120.050.1%秋水仙素水溶液20:00-23:00室温+蚕豆120.050.1%秋水仙素水溶液14:30-17:308+洋葱160.050.1%秋水仙素水溶液7:30-11:3015+茄子240.002M 8-羟基喹啉9:00-13:0015+大麦140.050.1%秋水仙素水溶液8:00-11:0025+* +优 +良。图1-1 洋葱根尖细胞的有丝分裂图片资料实验二 动物染色体标本制备一、实验目的 1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的基本原理及技术。2、观察动物骨髓细胞分裂中期染色体形态及数目特征。二、实验原理 染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期相（4n、8n和16n）往往来自于巨核细胞。对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。为了提高有丝分裂的指数，在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般采用秋水仙素。这些方法对于动物的核型分析是非常有用的。三、实验材料 小白鼠（Mus musculus Linnaeus），无尾两栖类蛙属（Rana）或蟾蜍（Bufo）。四、实验器具和药品试剂解剖器具、2ml注射器、5号针头、10ml刻度离心管、吸管、试管、载玻片、离心机、显微镜、水浴锅；肝素、秋水仙素（0.01）、柠檬酸钠溶液（2）、KCl、甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液（pH6.8），Giemsa原液。五、实验方法和步骤1、取成年健康小鼠，每只腹腔注射0.01秋水仙素0.30.4ml。（见图A）2、34小时后，以脱颈椎法处死（见图B、C），立即用剪刀剪去大腿处的皮肤和肌肉，连同关节头一起取下两侧股骨和胫骨，剔净其上肌肉，用2柠檬酸钠溶液洗净（见图D、E）。剪去关节头，使其露出骨髓腔，用吸有适量2柠檬酸钠溶液的注射器，将针头插入骨髓腔，将骨髓用柠檬酸钠溶液吹洗入刻度离心管，反复吹洗直至骨腔变白。用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓细胞全部释放出来（见图F）。3、将所得的骨髓细胞悬液1000rpm离心10分钟，吸去上清液，加0.075mol/LKCl58ml，立即用吸管吹打均匀，室温下静置低渗25分钟。4、低渗后立即1000rpm离心10分钟，去上清，沿管壁加58ml甲醇-冰醋酸（31）固定液，立即吹散打匀，静置30分钟。重复一次固定，第三次改用甲醇-冰醋酸（11）固定液再固定20分钟，然后离心去上清，留约0.10.2ml的沉淀细胞和上清液，视细胞多少可再加甲醇-冰醋酸（11）固定液23滴，摇匀制成细胞悬液（见图G、H、I）。5、滴片：取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀载玻片上细胞，空气中自然干燥（所得制片可留作显带实验）（见图J）。 6、染色:载玻片充分干燥后，用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液9份磷酸缓冲液混匀后染色。将玻片平放在支架上，材料面（即细胞面）朝上，用染液覆盖载玻片，染色1015分钟（见图K）。染色亦可在载玻片上用醋酸洋红染色数分钟即可。7、冲洗干燥：在自来水下细流冲洗8-10秒，去掉多余的Giemsa染色液，自然干燥（或用吸水纸吸干多余水分）。8、镜检观察：玻片干躁后，先用低倍镜找分裂细胞区，在分裂细胞区内寻找典型分裂相细胞。当找到含有红色条状物质的细胞轮郭图象后，再用高倍镜观察染色体，把染色体数目齐全、分散度高、重叠很少的图象，记录其染色体数目、坐标及图象，作实验报告。正常情况下，常规染色时雄性小鼠有3个最短的染色体，1对19号染色体和1个Y染色体，而雌性小鼠只有2个最短的染色体（见图L）。在显微镜下观察动物骨髓细胞分裂中期染色体形态特征，尽可能地寻找典型的中期染色体，观察到染色体的长臂、短臂、着丝点位置及某些染色体次缢痕、随体。9、永久片的制作：理想的制片如欲制成永久片，可以直接在载玻片上滴一滴DAMAR 树脂，选用合适大小的盖玻片封片，晾干后，贴上标签注明有关内容（如材料名称，制片时间，工作者姓名）即可。六、作业 1、找出分散适度的中期染色体图象，在油镜下进行仔细观察，熟悉小鼠染色体的形态，统计2n的染色体数目。2、绘制一个你所观察到的小鼠骨髓细胞染色体中期分裂相。3、本实验中秋水仙素、低渗液、固定液各起什么作用？4、骨髓细胞染色体制片与植物细胞染色体制片有何不同？七、学习资料1、小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体制片过程（如图2-1）。2、染色体标本片质量评价：（1）细胞密度合适、均匀；（2）背景干净，细胞核和染色体清晰；（3）有较多分裂相；（4）染色体分散较好。BAFEDGCCC 图2-1 小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体制片过程A、取材前34 h，向腹腔内注射秋水仙素；B、腹腔内注射秋水仙素34小时后， 断头处死小鼠；C、取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失；DE、滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等组织清除干净；F、加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓细胞全部释放出来；GH、用滤网将获得的液体过滤到离心管中，加低渗液至8ml左右，室温下静置2030分钟，进行低渗。低渗结束后，加入1ml左右的Carnoys固定液进行预固定，轻轻混匀后，离心；I、1200转/分，离心5分钟，弃上清，加入固定液，混匀后，室温放置30分钟，再次离心去上清，重复固定一次，离心后，向沉淀中加入1ml预冷的固定液，将细胞重悬；J、滴片；K、滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色1015分钟，弃去染液，水洗，镜检；L、显微镜下观察结果显示。实验三 孚尔根（Feulgen）核反应染色法一、实验目的 学习和掌握孚尔根（Feulgen）反应染色方法，鉴定植物组织及细胞中DNA的存在与分布，以及染色体在有丝分裂中的行为。二、实验原理 DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色，其反应式（见图3-1）。利用1N HCl 、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基（即使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态）。水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中，这个反应还可对细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)进行定位和定量侧定。水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。 图3-1 Schiff试剂的反应过程三、实验材料 洋葱（Aillum cepa）根尖，蚕豆（Vicia faba）根尖，小麦（Triticum aestivum Linn）幼穗，洋葱（Aillum cepa）叶片表皮、愈伤组织等。四、实验器具和药品试剂显微镜、恒温水浴锅、温度计、冰箱、温箱、天平；乙醇、冰醋酸、碱性品红、偏亚硫酸氢钠、盐酸、活性炭、亮绿、Carnoy固定液、0.050.2% 秋水仙素溶液、1M HCl、漂洗液。五、实验方法和步骤（一）材料准备取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧杯上使其长出新根。待根尖长1cm时，于上午8时剪下根尖进行预处理、固定、保存（请参考实验一）。（二）水解实验时，从冰箱取出预先准备好的洋葱根尖，分装到若干个小试管中，用清水洗三次，换1NHCl洗一次，倾去，换入预热60的1NHCl3ml，放入恒温水浴锅中在600.5下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。然后吸去热1NHCl，换入冷1NHCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在600.5之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。 （三）染色吸净水分，加入Schiff试剂避光染色30分钟，然后用漂洗液漂洗23次，经水洗后准备压片。（四）压片观察取一根尖置于载玻片上，切下生长区部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液压片镜检。六、作业 1、验交Feulgen反应制片一张。 2、总结实验成败的原因。 3、简图表示Feulgen反应的染色结果。 4、说明Feulgen反应中设上对照组的必要性。七、学习资料（一）Feulgen方法应注意的几个问题：1. 对照切片的制做进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。2. 固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。3. 水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱;如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为812min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。4. Schiff试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。（二）Sohiff液的配制 将lg碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，使其完全溶解，然后冷却到60过滤。加入30ml 1N HCl和3g焦亚硫酸钾或亚硫酸钠，塞紧瓶塞，置于暗处或外包黑纸24小时。1N HCl与焦亚硫酸盐生成的SO：将溶液中碱性品红脱色成为无色碱性品红(即白亚磺酸)。如溶液尚有浅黄色，可用05g活性炭脱色，摇动几分钟后迅速用粗滤纸过滤滤液应为清亮五色。制成的Schiff试剂应置于棕色瓶中，瓶塞需拧紧并用黑纸包裹，避光保存于4，保质期可达半年。若暴露于空气，或加热则使Schiff试剂中的S02逸出，变性的Schiff试剂则不能使用。除碱性品红外。其他碱性染料也可制成能与醛基反应的类似Schie 反应液，但是。不能达到五色。在染色时可用l盐酸乙醇洗去不起反应的余色。Schiff试剂在不同的pH条件下可显示不同的物质，如Sehiff试剂在pH 3043时，对Feulgen反应效果好，而pH 24时，对PAS(糖原)反应效果好。注意：Schiff试剂虽无色，但氧化后为紫红色。同时要防止污染环境，用后要回收。实验四 减数分裂与配子形成一、实验目的 1、观察减数分裂过程并熟悉减数分裂各个时期的特征及染色体的形态、数目的变化，为研究遗传基本规律奠定细胞学基础。2、学习并进一步掌握动、植物减数分裂玻片标本的制作方法和基本技能。3、了解动、植物的生殖细胞的形成过程。二、实验原理 减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，仅在配子形成过程中发生。这一过程的特点是：连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个核，每个核只含单倍数的染色体，即染色体数减少一半，所以称作减数分裂。另外一个特点是前期特别长，而且变化复杂，包括同源染色体的配对、交换、分离和非同源染色体的自由组合等。在高等生物里雌雄性细胞形成的过程中，都是先由有性组织（如花药和胚珠、精巢和卵巢）中的某些细胞分化为孢母细胞（2n）,以及精母与卵母细胞（n）。进一步由这些细胞进行一种连续二次的减数分裂，即减数第一分裂和减数第二分裂，最终各自产生4个小孢子（n）或精细胞（n），或是分别产生一个大孢子或卵细胞（n）与三个退化的极体（n）。再经受精作用，雌、雄配子融合为合子，染色体数目恢复为2n。这样，在物种延续的过程中，确保了染色体数目的恒定，从而使物种在遗传上具有相对的稳定性。在分裂过程中，可以详细地到染色体的形态、数目、组成和染色体的鉴定和分析等，从而为遗传学研究中远缘杂种的分析、染色体工程中的异系鉴别、常规的组型分析以及三个基本规律的论证，提出了直接与间接的依据和细胞学基础。并可导致了各种遗传重组的发生，为生物的进化提供了物质基础。 三、实验材料 小麦（Triticum aestivum Linn）幼穗，短角斑腿蝗（Catantopsbrachycerus）精巢。四、实验器具和药品试剂显微镜、解剖针、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、小广口瓶等；卡诺氏固定液（Carnoys Fluid）、45醋酸和改良苯酚品红等。五、实验方法和步骤（一）小麦花药压片标本的制作与观察1、取材 当大田中的小麦处于孕穗早期时，选取旗叶叶耳与其下面一叶叶耳之间相距12cm的主穗，剥去外部叶鞘，剪下幼穗，投入Carnoy固定液中，固定424h后用70酒精换冼两次，保存在70%酒精中。2、压片从70酒精中取出一段幼穗，剥下一朵颖花，置载玻片上，用解剖针剥开内外颖，将花药剔出(花药长度以12mm为宜)，在花药上加一滴改良苯酚品红染液，染色35min，然后持解剖针横切花药成24段，再用针头轻压，使花粉母细胞从花粉囊中挤出，尽量挤净，弃去药壁碎片，盖上盖玻片即可在显微境下观察。盖上玻片时，不必施加压力，有多余的染液时，可用吸水纸吸去，但加上玻片后，不能来回移动。若染色太淡，可在盖玻片边缘加一滴染液，让它渗进去继续染色并进行烤片，静置12分钟再压片，即可获得较清楚的制片。如果染色效果不甚理想，可以置于酒精灯火焰上烘烤加强染色效果。烘烤压片是一项很重要技术，比较烘烤前面细胞质与染色体的着色情况。通常将片子在酒精灯光焰上来回移动，直到气泡逐渐扩大时为止，烘烤要反复多次进行，可使细胞染色尽量褪去，染色体得到充分鲜明的着色，如染色过深，可以在盖玻片边缘注一滴45%的冰醋酸，而在相对的边缘用吸水纸吸收在盖玻片下流动的染色液，直到胞质脱色而染色体仍清晰可见为止。3、减数分裂时期的观察先在低倍镜下找到花粉母细胞，然后转用高倍镜观察。花粉母细胞与体细胞明显不同，主要特征是细胞及核的体积都较大。观察辨认压片标本中的花粉母细胞处于减数分裂的哪个时期。换用稍大或较小的花药进行压片与观察，简图表示你所看到的各个分裂时期实验中同学之间可以相互参观和交流，借以扩大观察内容和范围。（二）蝗虫精巢压片标本的制作与观察1、取材蝗虫以夏秋两季采集为宜。蝗虫雌雄个体的形态特征有明显的差别雄体腹部末端为交配器，形似船尾，而雌体末端分叉，与雄体明显不同捕到雄虫后用镊子夹住雄虫尾部，向外拉。可见到一团桔黄色团状结构组织块，这就是蝗虫的精巢。剔除精巢上的其它组织，将其放到Carnoy固定液中固定1.52小时后用70%酒精换洗两次，70酒精中保存备用。 图4-1蝗虫雌雄个体的腹部末端形态特征2、压片挑起精细管，置载玻片上，除去外围脂肪，从中间切成两段，弃去后半段(近输精管端)，留下前半段(因为前半段细胞分裂旺盛而后半段多为精于)。滴一滴改良苯酚品红染液，同时以小镊子轻轻挤压精细小管外壁，以使性母细胞或减数分裂中各时期的细胞流出精细小管管壁，以利于观察。染色1015分钟后盖上盖玻片，用手指隔着吸水纸略加压力，使细胞散开，铺成单层。随后便可放显微镜下观察。3、减数分裂过程的观察制成的临时压片标本中，除了正在进行减数分裂的细胞之外，还可看到精原细胞的有丝分裂过程。仔细区分精母细胞和精原细胞，确定减数分裂各个时期，画图表示各期特征。如制永久片，可以将玻片放在CO2干冰或生物切片半导体冰冻机上，待玻片结冰后，取出玻片，用刀片迅速揭开盖玻片，放在空气中干燥后，用封藏剂（加拿大树胶）封固。六、作业 1、每人至少作出二张良好的临时片。 2、 绘出下列各分裂时期的简图。 （1）终变期 （2）中期 （3）后期 （4）中期 （5）后期 （6）四分孢子 3、联系有丝分裂实验，说明高等植物的染色体周史，染色体的恒定性、特异性和连续性。4、减数分裂与有丝分裂有何区别？子代与亲代的差异是由哪一种分裂造成的？七、学习资料1、实验材料的采集在实验过程中，取材的时间对实验效果影响很大，除小麦以外，常用来进行减数分裂过