生物技术遗传学实验指导.doc

目 录验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验二 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备实验三 人类染色体G显带技术实验四 人类染色体C显带技术实验五 核仁形成区银染技术实验六 人类染色体G显带核型分析实验七 X染色质标本的制备实验八 姐妹染色单体互换实验九 微核检测技术实验十 ABO血型的测定及其基因频率的计算实验十一 苯硫脲尝味实验及其基因频率的计算实验十二 人类皮纹分析实验十三 遗传征询实验十四 人类基因组DNA的提取实验十五 聚合酶链式反映（PCR）实验十六 DNA的琼脂糖凝胶电泳实验十七 PCR-RFLP技术遗传学实验须知一、医学遗传学实验目的和规定医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容。实验课有助于加深和巩固基础理论知识，并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能。在培养学生分析问题、综合问题和解决问题能力方面具有重要作用。为此，规定学生做到以下几点：1、实验课前做好预习，明的确验目的、实验原理。 2、复习有关理论内容。3、熟悉实验的重要环节。4、初步估计和鉴定实验的也许结果。 二、实验操作过程中的注意事项1、认真操作，仔细观测和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。 2、假如实验结果与理论结果不一致，须及时进行科学分析，判断结果的可靠性，寻找出现误差的因素。 3、各种实验试剂用后放回原处，瓶盖封严，轻拿轻放。 4、使用微量加样器时，一定调整好取用量，按使用规定操作。 5、实验室应保持肃静，注意清洁卫生，实验中用过的废弃物品要及时清理，避免堵塞下水管道。三、实验后的注意事项1、实验后，整理清洁所用仪器、设备，注意放回原位，以备下次使用。 2、如有仪器损坏，要及时填写破损报告，并报告老师。 3、离开实验室前，检查并关闭门、窗、水、电。 四、实验室的意外解决实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生，必须镇静做紧急解决，并立即报告老师。1、着火：如遇酒精灯推倒或其它因素着火，一方面将一切易燃品移至远处，然后用水扑灭或者切断电源。 2、火伤：皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂抹，如伤势较重，立即送医院治疗。 3、如有毒药品泼溅到皮肤上，如EB，同位素等，应用大量清水进行清洗，必要时，去医院解决。 4、割伤出血：遇玻璃割伤出血，可用碘酒或红药水消毒后，用纱布包扎。如有玻璃留在伤口，解决前应先取出。实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【目的规定】1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法【实验原理】人体外周血淋巴细胞培养(人体末梢血、微量全血短期培养)及其染色体标本制备是国内外研究显示染色体最常用和效果最佳的方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便，现已广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等。人体外周血中的小淋巴细胞，是已分化、处在G0期的细胞，几乎不具有分裂增殖能力。在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞，因此，需采用刺激细胞增殖的措施。人们发现从云豆(菜豆)中提取的植物血球凝集素(植物血凝素，PHA)可以刺激小淋巴细胞进行有丝分裂，即在PHA作用下，处在G0期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞具有分裂能力，重新进入增殖周期进行有丝分裂。在PHA作用下体外培养72小时左右，多数淋巴细胞已处在细胞周期的第二周期。此时，细胞分裂相较多，但都处在分裂的不同时期。一般来说，制作染色体标本重要是显示细胞分裂中期染色体，因中期染色体形态最为典型、最为清楚，最易辨认，是研究染色体的最佳阶段。为了获得大量可供分析的中期染色体，需在终止细胞培养前数小时加入适当浓度的有丝分裂阻断剂秋水仙素(或其衍生物秋水仙胺)。它可特异地克制纺锤丝的形成、阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期。借此可获得大量中期分裂相细胞。在进行染色体标本制备的过程中，一方面要进行低渗解决，使细胞体积胀大、染色体松散开而便于观测分析。最常用的低渗液为0.075molL的KCl，也可用水或1枸橼酸钠等。低渗后的细胞需用固定液固定。醋酸固定液具有膨胀、固定作用。它和醇类混合固定，有助于染色体松散，可获得分散好、易于分析的分裂中期染色体标本。现在常用的固定液为甲醇-冰醋酸(3:1)固定液。【实验准备】1、试剂RPMI-1640营养液、小牛血清、0.25 胰蛋白酶、Hanks液、双抗(青霉素、链霉素)、2碘酒、75酒精、3.8NaHC03、520UmL肝素、40gmL秋水仙碱、PHA、0.075molL KCl低渗液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、二甲苯和香柏油等。2、器材超净工作台、光学显微镜(附照相设备)、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、高压蒸汽消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平(感量110毫克)、架盘天平、链霉素培养瓶及瓶塞、肝素小瓶及瓶塞(取血用)、10mL吸管、直头小吸管、5mL刻度离心管、2mL或5mL一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、棉签、大吸球、小吸头、pH试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、40C预冷的载玻片、酒精灯、火柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。【实验材料】人静脉血【实验内容、方法】一、采血在采血前，对各种用品进行清洗、无菌解决，配制、分装并冻存培养液(5mL瓶)，用5mL注射器抽取肝素0.1mL，备用。常规消毒肘部皮肤，用抽取肝素的注射器静脉采2mL，轻轻摇匀，待接种培养。二、接种培养将事先配制冻存的装有5mL培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出，置室温融化，每瓶滴入约0.3mL肝素抗凝血，轻轻摇匀，置370C培养箱培养72小时。三、积累分裂中期细胞在终止培养前2小时，于培养瓶内加入浓度为20gmL秋水仙素1滴，终浓度为0.1-0.15g/mL，摇匀，置370C温箱继续培养2小时后收集细胞、制片。四、制片1、收集细胞：从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移人5ml刻度离心管内，以2023rmin离心10分钟，吸去上清液，保存底物。2、低渗：每管加入370C预温的0.075molLKCL溶液4ml，用吸管轻轻吹打均匀，置370C水浴锅中低渗30分钟，以达成红细胞破坏、淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的。3、预固定：低渗解决后，每管加入1 mL甲醇：冰醋酸(3:1)固定液，将细胞轻轻吹打均匀，置离心机2023rmin离心10分钟。4、固定(一)：去上清液，加固定液5mL，吹打均匀，固定30min,2023rmin离心10分钟。5、固定(二)：去上清液，再加入5mL固定液，吹打均匀，再次固定30min，2023rmin离心10分钟。6、滴片：去上清液，留底物，每管加入少许(约0.2mL)固定液，将底物吹打均匀，制成细胞悬液。然后用吸管吸取混匀的细胞悬液，约以20cm或更高的距离滴至预冷的载玻片上，每片约23滴，随即将玻片在酒精灯火焰上微烤(一过性微烤数次)，以助细胞、染色体分散，使之均匀平铺于玻片上。将制片放人片盘，空气干燥后，收集于片盒中。7、染色和观测：待制片晾干后，放入约1:10 Giemsa染液的染色缸中染色15分钟左右，或架在染色用玻璃板上扣染15分钟左右(扣染是指染色时，将染色体制片的细胞面朝下，架在玻璃板上，将染液滴入玻璃板和细胞面之间)，自来水轻轻冲洗，晾干后光镜下观测。先用低倍镜观测后，选择分散好的染色体换为高倍及油镜观测，注意人类核型中近端、亚中和中着丝粒染色体的形态特点。【注意事项】1、有关淋巴细胞培养的注意事项同实验十二。2、PHA的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键，不同来源或同一厂家的不同批号、不同的保存时间，PHA的效价也许会有较大的差异，直接影响培养细胞中分裂细胞的数量。故每批PHA正式使用前，须进行一次预实验，摸索PHA的质量和使用量。其使用量不宜过大，否则会导致红细胞凝集。一般，自己直接从菜豆中提取的PHA效果较好。3、接种的血样标本愈新鲜愈好。肝素用以抗凝，用量不宜过多。4、秋水仙素用量和作用时间要适当。该药有强烈的毒性作用，用量过大、作用时间过长，可使染色体缩短和发生异常分裂现象，甚至染色体破碎。5、低渗是制片好坏的重要环节。低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体的制片质量，如染色体分散不好、有胞浆背景，或细胞破损、染色体丢失等。要注意低渗液使用前需370C温箱预温。6、低渗后的预固定也很重要，预固定期，固定液量不要多，加入固定液后要立即用吸管吹打均匀，用力不要过猛。此外两次固定期，固定液也不要过多，吹打时用力也不要过猛，以免细胞破碎，染色体丢失。固定液要在使用时配制。7、最后的滴片也是染色体制片好坏的很关键的一步。载玻片上有油污或预冷不够，或滴片时所滴悬液重叠、操作不好，或底物悬液过浓等都直接影响细胞、染色体的分散。底物悬液过稀或酒精灯上烤片时间太长，都也许导致制片中可供分析用的染色体很少，甚至找不到染色体。【实验报告】1、血培养中PHA所起的作用是什么?秋水仙素的作用是什么?2、简述血培养和外周血淋巴细胞染色体标本制备的过程。实验二 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备【目的规定】1、初步掌握实验动物骨髓细胞染色体标本的一般制备方法(直接法)。2、了解小白鼠染色体的形态特性及其数目。【实验原理】骨髓细胞具有旺盛的分裂增殖能力。在骨髓细胞中，有丝分裂细胞所占的比例比一般细胞大。为了积累更多的有丝分裂中期细胞，可在收集细胞前进行秋水仙素解决。通过制备的骨髓染色体标本，可以观测毒性物质在体内对细胞染色体的影响。同时，在检测环境致突剂方面，也有其独特的优点。方法简捷、直接，易于掌握，一般实验室均可进行。因此，此法也是用动物实验检测有害物质对机体遗传物质损伤的实验方法之一。【实验准备】1、试剂0.04秋水仙素、0.075molL KCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、香柏油、二甲苯等。2、器材光学显微镜、恒温培养箱、离心机、架盘天平、酒精纱布及其它一般用品。【实验材料】健康小白鼠(体重约20克)【实验内容、方法】1、取材和低渗取材前34小时，于小鼠腹腔内注入0.04秋水仙素0.1mL10g体重，以积累中期分裂相。断颈髓法处死小鼠，取其股骨，用酒精纱布清除其上粘附的肌肉及结缔组织，并用剪刀剪去股骨两端少许骨骺及骨皮质，暴露骨髓质，用注射器抽取0.075molL KCl 5mL冲洗骨髓腔，将冲洗后的液体收集到5mL离心管中，反复冲洗两次以上，至骨髓腔变白为止，将冲洗液吹打均匀后置370C恒温箱低渗解决20分钟。2、预固定取出低渗后的离心管，加入23滴预固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，立即吹打均匀，平衡后用离心机2500rmin离心5分钟，去上清液，留底物。3、固定一加固定液5mL于离心管中，吹打均匀，室温固定10分钟后，2500rmin离心5分钟。去上清液，留底物。4、固定二再加固定液5mL于离心管中，吹打均匀，室温固定10分钟后，2500rmin离心5分钟。倾去上清液，加入少许(约0.5mL)固定液。5、滴片将沉淀物吹打均匀后，吸于滴管内，滴在预冷的载玻片上，每片23滴，酒精灯上烘烤一下，放在片盘上，晾干后装入片盒中。6、染色和观测1:10的Giemsa染液染色15分钟后，自来水冲洗。待制片干燥后置显微镜下观测。小鼠染色体形态数目与人类染色体不同，小鼠所有为端着丝粒染色体，2n=40。【注意事项】1、在用酒精纱布解决股骨上的软组织时，不要使组织块掉入离心管中。2、可参照实验十四染色体标本制备过程中的注意事项。【实验报告】1、小白鼠腹腔内提前注射秋水仙素的意义是什么?2、叙述小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程(直接法)。实验三 人类染色体G显带技术【目的规定】初步掌握染色体G显带制备的基本方法。【实验原理】自20世纪60年代末以来，染色体显带技术得到了很大的发展。人们用物理、化学的方法解决染色体标本，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现出明暗相间或深浅不同的带纹。这一技术的应用，可以准确辨认23对不同类型的染色体，并能辨认同一号染色体上的不同区带。从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了有效的手段。关于G带的形成机理，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是G带产生的因素。在染色体上的蛋白质经解决而丢失后，这些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。尚有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上TA和CG碱基的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。AT碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而GC碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。总之，目前说法较多，但重要概括了三种观点，即显带是由于:DNA的作用；蛋白质的作用；DNA、染料和蛋白质三者之间互相作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。可以肯定，G显带具有很多优点，如制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清楚，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观测。故已成为当今细胞遗传学与分子细胞遗传学领域中应用广泛的一种技术，并成为研究分析染色体的重要常规方法之一。【实验准备】1、试剂：0.85生理盐水、0.025胰蛋白酶溶液、吉姆萨染液、3.8NaHC03、二甲苯、松柏油等。2、器材：普通光学显微镜、370C水浴箱、普通冰箱、立式染缸、直头小吸管、橡皮吸头、pH试纸、吸水纸(滤纸)、扣染玻璃板、擦镜纸、镊子等。人类中期染色体标本制备用试剂和器材同实验十四。【实验材料】常规方法制备的人类中期染色体标本制片(片龄35天最宜)。【实验内容、方法】1、一方面将配制好的0.025胰酶溶液装入立式染色缸中,调pH值至7.07.2,放人370C恒温箱中预温。2、取染色体制片一张置胰酶缸中解决15秒左右，迅速投入0.85生理盐水缸中漂洗数秒(可准备两缸盐水，做两次漂洗)。3、用自来水稀释的吉姆萨染液(自来水:吉姆萨原液=8:1)扣染20分钟。4、将标本用流水冲洗、晾干，必要时封片、镜检。镜检时，先在低倍镜下选择分散好、长度适中的分裂相，然后转换油镜观测其显带情况，选择显带好的标本进行G显带核型分析。【注意事项】1、染色体制片胰酶解决前，需370C温箱烤片一天左右。如滴片后当天进行G显带，可在滴片后置800C烤箱烤片两小时。2、胰酶预温时要注意预温温度，温度过高时胰酶变性失效。3、胰酶溶液需在使用前配制。染色体在胰酶中的解决时间可因制片质量、片龄而不同。在不同个体的染色体制片中也可有差异。此外，不同厂家生产的胰酶或不同批号的胰酶，在解决时间上都可有差别，故每次进行染色体G显带时，最佳先试做一张制片，分段并用不同时间解决，摸索胰酶解决时间，以保证获得最佳的染色体G显带标本。【实验报告】1、G显带过程中应注意哪些问题?2、简述染色体G显带标本制备的基本方法。实验四 人类染色体C显带技术【目的规定】1、初步掌握染色体C显带的制备方法。2、熟悉1号、9号、16号和Y染色体C带的带型特性。【实验原理】C显带技术是一种染色体局部显带技术。染色体经碱、酸、盐解决后，再经Giemsa染色，呈现出特有的着丝粒、次缢痕区及Y染色体长臂远侧段等的结构异染色质区深染，称为C带。此区域的DNA多为高度反复序列，并仅与组蛋白紧密结合，因而保护了C带区的异染色质免受酸、碱、盐破坏，并易被Giemsa深染。如该区域的DNA一旦发生变性，在改变变性条件后，即可快速复性，这是高度反复序列DNA所具有的特性。其它部位的DNA一旦被碱破坏变性后，不易发生复性，或复性较慢，因此，不易被Giemsa着色。所以，染色体两臂的常染色质部分仅显示出浅淡的染色体轮廓。优良的C带标本，可使结构异染色质区着色很深。在人类染色体中，染色体的着丝粒区、第1、9、16号染色体的次缢痕区和Y染色体长臂的远侧段明显深染。因此，运用C带，可以准确地辨认这些染色体，并可拟定着丝粒的位置和数目，还可配合其它显带技术对染色体某些结构异常、Y染色体异常及性别，做出准确的诊断。不同个体、种族，C带的大小和染色的强度不同，呈现出多态性，故C显带技术在多态性研究和鉴别染色体来源等方面具有一定的意义。【实验准备】1、试剂：510饱和Ba(OH)2、0.1molL HCl、蒸馏水、70、80、95酒精和纯酒精、2SSC溶液、Giemsa染液、香柏油或石蜡油、二甲苯等。2、器材：光学显微镜、恒温水浴箱、温度计、立式染缸、镊子、扣染用玻璃板、小吸管、50mL量筒、擦镜纸等。【实验材料】常规方法制备的人类中期染色体标本制片。【实验内容、方法】1、将染色体制片投入580C饱和Ba(OH)2中5分钟。2、取出标本置0.1molL HCl中漂洗。3、蒸馏水漂洗数次。4、酒精脱水：70酒精80酒精95酒精纯酒精(每个浓度5分钟)，空气干燥。5、置650C2SSC溶液中温育1.52小时。6、Giemsa染色20分钟，自来水冲洗，空气干燥，显微镜下观测。将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观测，找到分散好的、染色体长度适宜的分裂相，换油镜观测。注意观测各染色体的着丝粒区深染，特别是第1号、9号、16号染色体着丝粒区及次缢痕区深染，两者合在一起形成明显大的C带，Y染色体长臂远侧段约1/22/3区段深染，C带明显。第1、9、16号染色体和Y染色体长臂的C带具有多态性。【注意事项】1、片龄不宜过长，否则影响C带质量。2、制片从饱和Ba(OH)2中取出时要迅速投入0.1molL HCl中，以免Ba(OH)2的沉淀物粘贴在玻片上影响C带的观测。3、染色浓度及时间不宜过高过长，以免影响C带的质量。【实验报告】1、简述染色体C显带标本制备的基本方法。2、在C显带标本中，你能辨认第1、9、16号及Y染色体吗?它们的C带特点与其它各号染色体有什么不同?实验五 核仁形成区银染技术【目的规定】1、初步掌握人类染色体核仁形成区银染标本的制备方法。2、熟悉核仁形成区的所在部位。【实验原理】人类D组和G组染色体的随机柄部次缢痕区，称为核仁形成区(NOR)，与核仁形成有关。硝酸银染色技术，使具有活性的核仁形成区特异地染成黑色。这种银染色阳性的NOR称为AgNOR，是具有转录活性的rDNA部位。现已证明，这里是具有转录活性的18SrRNA和28SrRNA基因的所在部位。此处常伴有丰富的酸性蛋白质，而这种蛋白具有较多的SH基团和二硫键，易使硝酸银中Ag+还原为Ag颗粒，从而使有转录活性的核仁形成区镀上银颗粒而呈现出黑色区域，故被银染的不是rDNA自身而是酸性蛋白质。没有转录活性的NOR则不着色。对AgNOR出现频率进行计数，可以了解有活性的rRNA基因(rDNA)的动态变化，估计rDNA的转录活性。人类细胞中的AgNOR数目及其在染色体上的位置都是比较稳定的，如发生改变，说明细胞内rRNA基因活性发生变化。现认为，该技术是研究18SrRNA和28SrRNA基因分布和转录活性的一种简易有效的方法，并已广泛地用于肿瘤细胞遗传学、体细胞遗传学、进化遗传学和临床细胞遗传学等领域。【实验准备】1、试剂：50硝酸银、明胶甲酸液、Giemsa染液、蒸馏水。2、器材：光学显微镜、恒温水浴箱、小吸管、小吸头、盖玻片、擦镜纸。【实验材料】人外周血淋巴细胞染色体标本制片(片龄在一周以内)。【实验内容、方法】1、先吸取50AgN03两滴滴在染色体标本制片上，然后加入明胶甲酸液3滴，轻轻来回摇摆混匀，盖上盖玻片。2、将玻片平置于沸水水浴箱的铁板上12分钟，待玻片变金黄色，立即用自来水冲洗，以冲掉盖玻片。3、以5Giemsa染液复染10分钟，自来水冲洗，空气干燥，显微镜下观测。AgNOR计数：选择分散好、数目全的中期分裂相染色体，计数D组6个和G组4个近端着丝粒染色体Ag-NOR的数目。凡有银染点的近端着丝粒染色体，不管单侧或双侧的，都计数为一个银染的染色体。【注意事项】1、硝酸银溶液应在临用前配制。配制及使用时，注意不要溅到四周，以免形成很难除掉的黑色污点。2、掌握好银染温度，温度越高，反映速度越快。【实验报告】1、仔细观测AgNOR形态、数目及其在染色体上的位置。2、了解NOR银染的原理。实验六 人类染色体G显带核型分析【目的规定】1、通过G显带核型分析，掌握G显带核型分析方法并初步掌握各号染色体的带型特性。2、与非显带核型分析进行比较，结识G显带核型分析，能准确的辨认每一条染色体。【实验原理】染色体标本用适当浓度的胰蛋白酶溶液解决，再用Giemsa染液染色，在染色体上显出深浅交替的横纹，为G带。通过显示G带，不仅可以准确区分每一条染色体，还可检测出染色体的微小结构异常。人类G显带染色体核型分析是染色体研究中最重要和最常用的方法。它可根据染色体的数目、结构进行核型分析，而对染色体病患者做出准确的诊断。可在显微镜下直接进行分析，也可进行显微照相，经冲洗、放大后，根据照片进行分析。根据丹佛(Denver)及伦敦(London)会议提出的标准，按照每条染色体的特异带型，将照片上的染色体按其轮廓剪下，进行配对、分组、排列，并贴在报告纸上。人体细胞具有46条染色体，即23对，其中22对为常染色体，男、女相同，编为122号。另一对为性染色体，男、女有别，男性为XY，女性为XX。X染色体编入C组，Y染色体编入G组。在剪接粘贴时，性染色体可单独排列。核型分析后，将其分析结果按国际标准进行描述。【实验准备】剪刀、镊子、核型分析纸、直尺、胶水、铅笔和橡皮。【实验材料】正常人外周血淋巴细胞G显带中期分裂相照片。【实验内容、方法】一、 正常人类染色体G带带型辨认的重要特性A组染色体涉及第13号染色体，其长度最长。1号和3号染色体的着丝粒均在12处，2号染色体的着丝粒约在3/8处。1号染色体短臂：在分裂中期显示的320条带左右的分裂相上，近侧段有二条深带，第2条深带稍宽，在解决较好的标本上，远侧段可显示34条淡染的深带。此臂分为三个区，近侧的第1条深带为2区1带，第2条深带为3区1带。长臂：副缢痕紧贴着丝粒，着色深度大小不一，其远侧为一宽的浅带。近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条深带染色较浓。此臂分为4个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2条深带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。2号染色体短臂：可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分为2个区，中段两条带之间的浅带为2区1带。长臂：有47条深带，第3和第4深带有时融合。此臂分为3个区；第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。3号染色体着丝粒染色较浓。在长臂和短臂的近中段各具有一条明显而宽的深带。短臂：一般在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中一条较窄，且着色淡，这是区别3号染色体短臂的显著特性。在解决较好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带。此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。长臂：一般在近侧和远侧各有一条较宽的深带，在显带较好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。B组染色体涉及第4、5号染色体，长度次于A组，着丝粒均在1/4处。4号染色体短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。长臂：可见四条均匀分布的深带，在显带较好的标本上，远侧段的二条深带可各自分为二条较宽的深带。此臂分为3个区，近侧段的第1和第2深带之间的浅带为2区1带，远侧段二深带之间的浅带为3区1带。5号染色体短臂：可见两条深带，其远侧的深带宽而浓染，此臂只有一个区。长臂：近侧段有二条深带，染色较淡，有时不明显；中段可见三条深带，染色较浓，有时融合成一条宽阔的深带。远侧段可见二条深带，近末端的一条着色较浓。此臂分为3个区，中段第2深带为2区1带，中段深带与远侧段之间的宽阔的浅带为3区1带。C组染色体涉及第612号和X染色体，中档长度。11号和X染色体的着丝粒在3/8处，其它各号染色体的着丝粒约在1/4处。6号染色体短臂：中段有一条明显而宽阔的浅带，近侧段和远侧段各有一条深带。近侧深带紧贴着丝粒。在显带较好的标本上，远侧段的深带可分为二条深带。此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。长臂：可见五条深带，近侧的一条紧贴着丝粒。远侧段的末端一条深带着色较浅。此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1带。7号染色体着丝粒着色浓。短臂：有三条深带，中段深带着色较淡，有时不明显。远侧深带着色浓，状如“瓶盖”。此臂分为2个区，远侧段的浅带为2区1带。长臂：有三条明显的深带，远侧近末端一条着色较淡，第2和第3深带稍靠近。此臂分为3个区，近侧第1条深带为2区1带，中段的第2深带为3区1带。8号染色体短臂：有两条深带，中段有一较明显的浅带，这是与10号染色体鉴别的重要特性。此臂分为2个区，中段的浅带为2区1带。长臂：可见三条分界极不明显的深带，有时不明显，远侧的深带着色较浓。此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。9号染色体着丝粒着色浓。短臂：近侧段和中段各有一条深带。在显带较好的标本上，中段可见二条窄的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。长臂：可见明显的二条深带，副缢痕一般不着色，在有些标本上呈现出特有的狭长颈部区。此臂分为3个区，近侧的一条深带为2区1带，远侧的一条深带为3区1带。10号染色体着丝粒着色浓。短臂：近侧段和中段各有一条深带，在有些标本上，近中段可见二条深带，但与8号染色体短臂比较，其深带的分界欠清楚。此臂只有1个区。长臂：可见明显的三条深带，远侧段的二条深带稍靠近。近侧的一条深带着色最深，这是与8号染色体相鉴别的重要特性。此臂分为2个区，近侧段的一条深带为2区1带。11号染色体短臂：近中段可见一条深带，在显带较好的标本上，这条深带可分为二条较窄的深带。此臂只有一个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒。远侧段可见一条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体相鉴别的一个明显特性。在显带较好的标本上，远侧段的这条较宽的深带，可提成两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般较难辨认，但它是分区的一个界标。在有些标本上，近末端处可见一条窄的浅色深带。此臂分为两个区，上述两条深带之间很窄的浅带为2区1带。12号染色体短臂：中段可见一条深带，此臂只有一个区。长臂：近侧有一条深带，紧贴着丝粒。中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体相比，这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的重要特性。在显带较好的标本上，中段这条较宽的深带可分为三条深带，其正中的一条着色较浓，在有些标本上，远侧段的近端还可见12条染色较深的深带。此臂分为2个区，中段正中的深带为2区1带。X染色体其长度介于7号和8号染色体之间。短臂：中段有一明显的深带，如竹节状。在有些标本上，远侧段还可见到一条窄的、着色淡的深带。此臂分为二个区，中段的深带为2区1带。长臂：可见45条深带，近中段的一条最明显。此臂分为2个区，近侧端的深带为2区1带。D组染色体涉及1315号染色体，具有近端着丝粒和随体。13号染色体着丝粒区深染。长臂：可见4条深带，第1和第4深带较窄，染色较淡；第2和第3深带较宽，染色较浓。此臂分为3个区，第2深带为2区1带，第3深带为3区1带。14号染色体着丝粒区深染。长臂：近侧和远侧各有一条较明显的深带。在解决较好的标本上，中段尚可见一条着色较浅的深带。此臂分为3个区，近侧深带为2区1带，远侧深带为3区1带。15号染色体着丝粒区深染。长臂：中段有一条明显的深带，染色较浓，有的标本上，近侧段可见有12条染色浅的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1带。E组染色体涉及第1618号染色体。16号染色体为中央着丝粒染色体，17和18号染色体为亚中央着丝粒染色体，着丝粒约在1/4处。16号染色体短臂：中段有一条深带，显带较好的标本上可见二条深带。此臂只有一个区。长臂：中段和远侧各有一条深带，有时远侧的一条不明显，副缢痕着色浓。此臂分为两个区，中段深带为2区1带。17号染色体短臂：有一条深带，紧贴着丝粒，此臂只有一个区。长臂：远侧段可见一条深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。此臂分为2个区，这条明显而宽的浅带为2区1带。18号染色体短臂：有一条窄的深带，此臂只有一个区。长臂：近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为2个区，两深带之间的浅带为2区1带。F组染色体涉及19、20号染色体，均为中央着丝粒染色体。19号染色体着丝粒及其周边为深带，其余均为浅带。短臂与长臂均只有1个区。20号染色体着丝粒区深染。短臂：有一条明显的深带。此臂只有一个区。长臂：在中段和远侧段可见12条染色较淡的深带，有时全为浅带。此臂只有一个区。G组染色体涉及第21、22染色体和Y染色体。是染色体中最小的、具近端着丝粒的染色体。21、22号染色体可具有随体。21号染色体着丝粒区着色淡。与22号染色体比较，其长度比22号短，其长臂近侧有一明显而宽的深带。此臂分为2个区，其深带为2区1带。22号染色体着丝粒区着色浓。与21号染色体相比，其长度比21号长。在长臂上可见二条深带。近侧的一条着色较浓，并且紧贴着丝粒。近中段一条着色淡，在有的标本上不显现。此臂只有一个区。Y染色体长度变化较大，有时整个长臂被染成深带。在显带较好的标本上可见二条深带。此臂只有一个区。二、正常人G显带核型分析1、每位同学发两张正常人外周血淋巴细胞G显带中期分裂相照片。其中一张将染色体按其轮廓逐个剪下，根据其大小、带型特点和着丝粒位置，依次分组、配对，排放在核型分析纸上。摆放时短臂向上，长臂向下，着丝粒位于铅笔画的横线上，多次调整检查无误后，方可进行粘贴。2、将另一张照片适当剪小，粘贴在核型分析纸上方正中间。3、写出分析结果。【注意事项】1、实验操作时，不宜面对剪下的染色体大声说话、咳嗽和打喷嚏，以免染色体吹跑遗失。2、剪贴时应注意一对染色体要排列紧密，不要有间隔，而每对之间要有间隔。着丝粒都要排列在横线上。上下线染色体规定对齐排列。3.、X染色体排列在C组旁，Y染色体排列在G组旁。4、按染色体轮廓剪成长方形，以便排列、配对和粘贴。【实验报告】1、每人剪贴分析一张正常人体细胞G显带中期分裂相染色体照片。2、简朴说出G显带各号染色体带型的特点。3、进行性别诊断并写出核型。实验七 X染色质标本的制备【目的规定】1、初步掌握X染色质标本的制备方法。2、观测熟悉人类间期细胞X染色质的形态特性、数目及所在部位。3、了解性染色质检查的临床意义。【实验原理】X染色质检查的重要临床意义在于性别的鉴定。在正常女性间期细胞核膜边沿经常可以观测到一个被碱性染料浓染的、直径1微米左右的小体。这一小体，是由女性一条“失活”的X染色体形成的，是不具有转录活性并呈异固缩状态的X染色质，也称X小体或巴氏小体。女性另一条X染色体与其它染色体同样呈解螺旋状态，并具有转录活性。X小体的数目在女性中是性染色体数目减1。正常女性细胞中有两条X染色体，所以仅有一个X小体，而具有三条X染色体的不正常女性，则有两个X小体。男性个体因只有一条X染色体，而不发生异固缩，因而没有X小体。但先天性睾丸发育不全症患者(核型：47，XXY)，在细胞核中也可见到X染色质。因此，可以通过X染色质数目的检查，鉴定胎儿的性别和性别畸形。X染色质大多位于核膜内侧缘，1微米左右，深染。形状不一，有球状、扁凸状、三角形和半圆形等。正常女性间期细胞中，X染色质阳性检出率为2070，大多为3050，高时可达70以上，男性细胞中则平均低于1。可采用口腔粘膜细胞、绒毛细胞、羊水细胞等进行检查。【实验准备】1、试剂：0.85生理盐水、甲醇、冰醋酸、95乙醇、硫堇染液、香柏油、二甲苯、加拿大树胶。2、器材：光学显微镜、离心机、小吸管、载玻片、烧杯(50mL)、量筒(50mL)、小吸头、牙签、片盘、镊子、擦镜纸。【实验材料】人口腔粘膜细胞【实验内容、方法】1、取5mL离心管，加入5mL0.85生理盐水。2、受试者嗽口后，用牙签刮取口腔颊部粘膜，置离心管中生理盐水中涮洗，弃掉牙签。用吸管轻轻吹打涮洗下来的细胞，以1500rmin离心10分钟。3、弃上清液，加入新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)5mL，轻轻吹打均匀，室温固定10分钟。4、1500rmin离心10分钟，弃上清液，留底物，加固定液0.30.5mL(加入量视底物量而定)，轻轻吹匀后，将细胞悬液滴在清洁的载玻片上，每片约2滴，空气干燥。5、硫堇染色法：(1)将空气干燥后的制片放入蒸馏水中漂洗数分钟。(2)用5molL HCl水解10分钟。(3)蒸馏水中漂洗数分钟(中间可更换一次蒸馏水)，充足洗掉HCl。(4)将制片置人硫堇染液中浸染30分钟。(5)蒸馏水漂洗，晾干。(6)加50酒精漂洗一次。(7)70酒精分色半分钟。(8)95、100酒精脱水各1-2分钟。(9)二甲苯透明两次(12分钟)，加拿大树胶封片。6、镜检100个细胞，记录具有X染色质细胞所占的百分率。正常值：男性为10以下或没有，女性为40以上。【注意事项】1、口腔颊部刮片时，用力要适当、均匀，以求刮下的细胞可以观测到X染色质。2、掌握好盐酸水解的时间和温度。【实验报告】1、绘出一个所观测的具有X染色质的口腔粘膜上皮细胞。2、镜检100个细胞，记录具有X染色质细胞的比例。实验八 姐妹染色单体互换【目的规定】1、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体姐妹染色单体分化染色技术。2、初步掌握SCE的观测及分析方法。3、了解SCE频率变化的意义。【实验原理】姐妹染色单体分化染色技术可使中期染色体的两条染色单体着色深浅不同，能借以观测姐妹染色单体互换(SCE)现象。姐妹染色单体互换，是指在染色体复制过程中，同一条染色体上的两条姐妹染色单体在相同位置上发生的等位对称的片段互换，即两条姐妹染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互相互换的现象。当细胞在具有BrdU(5溴脱氧尿嘧啶核苷)的营养液中增殖分裂时，由于BrdU是与脱氧胸腺嘧啶核苷相类