草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023黄鉴涛，胡海浩，马嘉霖，等.草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用J.广东海洋大学学报,2023,43(4):52-61.收稿日期：2023-03-28基金项目：广东省科技特派员专项（GDKTP2021029800）；国家自然科学基金（31602199）第一作者：黄鉴涛（1998），男，硕士生，主要从事水生动物病害防控。E-mail:通信作者：闫秀英（1978），女，副教授，主要从事水生动物病害防控。E-mail:草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用黄鉴涛，胡海浩，马嘉霖，战盈瑾，闫秀英，简纪常（广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）摘要：【目的】鉴定草鱼（Ctenopharyngodon idella）miR-218（cid-miR-218）家族成员，分析cid-miR-218在鱼淋巴囊肿病毒中国株（LCDV-cn）感染草鱼卵巢细胞系（Grass carp ovary cells，GCO）过程中的表达特性，探索cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染的调控作用。【方法】从LCDV-cn感染的GCO细胞中，通过茎环RT-PCR获取cid-miR-218家族成员，并进行测序验证和生物信息学分析；用定量PCR分析cid-miR-218家族在LCDV-cn感染GCO过程中的表达；用生物信息学方法预测cid-miR-218家族的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因；通过转染cid-miR-218-5p mimic和cid-miR-218-5p inhibitor上调和下调cid-miR-218-5p的表达，用定量PCR分析cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn mcp基因的表达情况；应用GO和KEGG数据库，对cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。【结果】在LCDV-cn感染GCO过程中，鉴定到cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2等5个cid-miR-218家族成员，其中cid-miR-218-5p的表达呈先升后降再上升的变化趋势，且差异表达最显著（P 0.05）；经生物信息学分析预测，cid-miR-218家族成员有较多共同的潜在靶基因，il-10是共有的靶基因。经验证，pmirGLO-il-10重组质粒与家族成员代表cid-miR-218-5p结合后，其荧光素酶活性降低（P 0.05），证明 il-10 是 cid-miR-218-5p 的靶基因。cid-miR-218-5p 过表达后，il-10 与LCDV-cn mcp表达均显著下降（P 0.05），而抑制 cid-miR-218-5p表达后，il-10与 LCDV-cn mcp表达则显著上升（P 0.05）。预测表明cid-miR-218家族参与调控病毒感染致瘤相关信号通路。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中，cid-miR-218家族中 cid-miR-218-5p起重要调控作用；cid-miR-218-5p负调控其靶基因 il-10的表达，并负调控LCDV-cn mcp基因的表达；cid-miR-218-5p和IL-10对鱼淋巴囊肿病诊断和防控有潜在的临床应用价值。关键词：草鱼卵巢细胞系；cid-miR-218家族；鱼淋巴囊肿病毒中国株；靶基因；白介素10中图分类号：S943.112；Q78文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0052-10doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.007Identification of Ctenopharyngodon idella miR-218 Family and ItsRegulation in Infection of Lymphocystis Disease Virus ChinaHUANG Jian-tao,HU Hai-hao,MA Jia-lin,ZHAN Ying-jin,YAN Xiu-ying,JIAN Ji-chang（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory ofAquatic Animal Disease Control and Healthy Culture/Key Laboratory of Control for Diseases ofAquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes,Zhanjiang 524088,China）第4期黄鉴涛等：草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用Abstract:【Objective】To identify the members of the Ctenopharyngodon idella miR-218(cid-miR-218)family,and analyze their expression characteristics,and explore the regulation of cid-miR-218-5pin grass carp ovary cells(GCO)challenged with lymphocystis disease virus China(LCDV-cn).【Method】By the method of stem-loop RT-PCR,the members of the cid-miR-218 family wereobtained from GCO cells challenged with LCDV-cn,and were performed by sequencing andbioinformatics analysis.Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)was used to acquire the expression ofthe cid-miR-218 family in GCO cells challenged with LCDV-cn.Bioinformatics methods were used topredict the target genes of the cid-miR-218 family,and dual luciferase reporter gene system was used toverify the target gene of cid-miR-218-5p.Cid-miR-218-5p mimic and cid-miR-218-5p inhibitor weretransfected into GCO cells to up-regulate and down-regulate the expression of cid-miR-218-5p.qRT-PCR was used to detect the expression of cid-miR-218-5p,the target gene il-10 and the LCDV-cn mcpgene.GO and KEGG databases were used to enrich the signal pathways that the cid-miR-218 familymight be involved in regulation.【Result】In GCO cells challenged with LCDV-cn,five members ofthe cid-miR-218 family were identified,i.e.cid-miR-218-5p,cid-miR-218a,cid-miR-218b,cid-miR218b-1 and cid-miR-218b-2.The expression of cid-miR-218-5p increased firstly,then decreasedand increased,and the difference was significant(P 0.05).Various bioinformatics analysis predictedthat the cid-miR-218 family had many potentially common target genes,and il-10 was a common targetgene.Results of dual luciferase reporter gene experiment showed that the luciferase activity decreased(P 0.05)after targeting of the family member representative cid-miR-218-5p with the PmirGLO-il-10recombinant plasmid,which indicated that il-10 was the target gene of cid-miR-218-5p.After up-regulation of cid-miR-218-5p,the expression of its target gene il-10 and the LCDV-cn mcp gene weredecreased significantly(P 0.05).After down-regulation of cid-miR-218-5p,the expression of itstarget gene il-10 and the LCDV-cn mcp gene was significantly increased(P 0.05).Moreover,it waspredicted that the cid-miR-218 family was involved in regulation of tumorigenesis signaling pathwaysof viral infection.【Conclusion】In GCO cells challenged with LCDV-cn,cid-miR-218-5p of the cid-miR-218 family played important regulatory roles.Cid-miR-218-5p negatively regulated the expressionof its target gene il-10,and negatively regulated the expression of the LCDV-cn mcp gene,too.Thisstudy indicated that cid-miR-218-5p and IL-10 have potentially clinical application value in thediagnosis,prevention and control of lymphocystis disease.Key words:Grass carp ovary cells;cid-miR-218 family;lymphocystis disease virus China;target gene;interleukin 10微小RNA（miRNA）可调节细胞周期、细胞迁移和血管生成等相关基因的表达，进而调控肿瘤发生发展1，其中，miR-218在动物肿瘤疾病中一般具有潜在抑瘤作用，可抑制肿瘤的发展、转移和扩散2-3，但其在不同肿瘤疾病中的调控机制不尽相同4-5。miR-218还与肿瘤治疗预后有关，已成为多种肿瘤治疗和预后的靶标位点6。在病毒感染致病过程中，miR-218 起着调控作用。如，在猪繁殖与呼吸综 合 征 病 毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）感染过程中，miR-218-5p可抑制 PRRSV的复制7；miR-218通过抑制干扰素的产生促进水泡性口炎病毒的免疫逃避8；在高危人类乳突病毒（Human papillomavirus，HPV）感染中，miR-218的表达降低，miR-218与高危HPV感染和女性宫颈上皮内瘤变有关9；miR-218介导调控卡波氏肉瘤病毒（Kaposis sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）编码的病毒干扰素调节因子，从而诱导内皮细胞迁移侵袭、调控致瘤效应10。鱼淋巴囊肿病是一种皮肤瘤，病鱼皮肤、鳍等多处长有囊肿，由淋巴囊肿病毒（Lymphocystis diseasevirus,LCDV）感染导致11，LCDV可感染140多种鱼类11。牙鲆（Paralichthys olivaceus）淋巴囊肿病病原53第43卷广东海洋大学学报是鱼淋巴囊肿病毒中国株（LCDV-cn）11，LCDV-cn的致病机制和鱼类淋巴囊肿病的防治有待深入研究，从 miRNA 层面解析 LCDV 的致病机制将为鱼类淋巴囊肿病防控提供新的思路。miR-218在不同物种间有明显的保守性，在人（Homo sapiens）、鼠（Rattus norvegicus）、牛（Bos taurus）、泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）等动物中，miR-218序列一致度较高12-13。目前，对LCDV-cn感染草鱼（Ctenopharyngodonidella）卵巢细胞系（Grass carp ovary cells，GCO）的生物学特性已有研究14，本研究制备LCDV-cn感染GCO的样品，鉴定LCDV-cn感染GCO过程中编码的草鱼miR-218（Ctenopharyngodon idella miR-218，cid-miR-218）家族成员，分析cid-miR-218家族在LCDV-cn 感染 GCO 过程中的表达特性，探索 cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染GCO的调控作用，为在miRNA层面阐明LCDV-cn的致病机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料和试剂从患淋巴囊肿病的牙鲆囊肿中分离LCDV-cn，保存于广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室14；GCO细胞购自深圳检验检疫局；pmirGLO双荧光素酶报告基因载体购于武汉淼灵生物科技有限公司；pMD-18T载体和大肠埃希菌Escherichia coliDH5购自宝日医生物技术有限公司（Takara）。所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要试剂包括胎牛血清（FBS，Gibco）、MEM培养基（Gibco）、HERPS（Gibco）、PrimeScriptTMRTreagentKit with gDNA Eraser 反转录试剂盒（Takara）、TBGreenPremix Ex Taq II定量试剂盒（Takara）、共转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX（Thermofisher-Scientific公司）、Dual-Lumi II双荧光素酶报告基因检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。1.2 GCO细胞培养和LCDV-cn感染GCO 细胞培养、LCDV-cn 感染 GCO 细胞具体操作以及所产生的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）参见文献14。1.3 cid-miR-218家族成员的鉴定待 LCDV-cn 感染 GCO 至 72 h 时，取已感染的GCO细胞1106个，室温下以800 r/min离心5 min，取细胞沉淀，加入 1 mL Trizol，按照 TRIzol LS 试剂盒说明书提取细胞总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取结果。用所提取的合格RNA和茎环反转录引物（表 1），依据 PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser反转录试剂盒说明书，进行茎环特异性反转录，制备茎环RT-PCR特异性反转录模板cDNA，保存于-80 备用。用上述制备的茎环反转录 cDNA 及表 1 中的相应茎环 RT-PCR 引物，进行茎环 RT-PCR 扩增cid-miR-218 家族成员。茎环 RT-PCR 扩增体系为50 L，包含 EX-Taq 25 L，100 g/mL cDNA 3 L，10 mol/L 上下游引物各 2 L，ddH2O 18 L。PCR条件为95 30 s、60 30 s、72 60 s，35个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。茎环 RT-PCR 扩增获得 cid-miR-218 家族成员长度约 60 bp 的目的片段，包括上游序列 4 bp（5-GCGC-3）、cid-miR-218 家族成员序列、茎环序列33 bp（5-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATCGAC-3）。将cid-miR-218家族成员分别插入pMD18-T 载体，转化至 E.coli DH5，于 37 下培养。挑选阳性菌落14，送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.4 cid-miR-218家族成员的表达定量分析依据 LCDV-cn 感染 GCO 细胞的 CPE 特点14，收集 LCDV-cn感染 GCO 细胞后 0、4、8、16、24、48、72、144和196 h的细胞样品，提取细胞总RNA并反转录为cDNA，采用RT-qPCR检测cid-miR-218家族成员的表达量。所用引物见表1，RT-qPCR总体积为 20 L，包含 TB Green Premix Ex Taq II 10 L，100 g/mL cDNA 2 L，10 mol/L 上下游引物各2 L，ddH2O 4 L。反应条件为95 30 s，95 5 s、60 30 s，40个循环。应用 SPSS 24软件，用 2-Ct法17分析定量PCR结果，采用单因素方差分析组间差异显著性，显著性水平设为0.05。1.5 cid-miR-218家族成员靶基因和靶位点预测应 用 RNAhybrid（https:/bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）、miRanda（http:/www.microrna.org/）和 TargetScan（http:/www.targetscan.org/fish_62/）软件预测cid-miR-218家族成员的靶基因。应用 RNA22(https:/cm.jefferson.edu/rna22v2/)预测靶基因的靶位点。1.6双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因根据生物信息学方法预测的靶位点，设计扩增靶基因片段的引物GLO-il10F和GLO-il10R（表1），扩增含靶位点的草鱼il-10片段。RT-PCR总体积为54第4期黄鉴涛等：草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用50 L，包含ExTaq酶25 L，10 mol/L GLO-il10F/R各 2 L，100 g/mL cDNA 2 L，ddH2O 19 L。反应条件为 95 180 s；95 40 s、53 40 s、72 60 s，循环30次。将PCR产物插入pMD18-T载体，构建测序重组质粒和亚克隆筛选。通过菌落PCR（引物见表1）和测序验证靶基因片段序列。将测序结果正确的靶基因片段与双荧光素酶pmirGLO载体连接，构建 pmirGLO-il10质粒，并通过测序进行验证。依据双荧光素酶报告基因系统操作手册，将构建正确的pmirGLO-il10质粒分别与cid-miR-218-5pmimic、cid-miR-218-5p inhibitor、NC 共 转 染 入GCO 细胞，于 20 培养 48 h，然后检测各组细胞荧光素酶活性。cid-miR-218-5p mimic（5-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3）、cid-miR-218-5p inhibitor（5-ACAUGGUUAGAUCAAGCACAA-3）和 NC（5-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3）于生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.7 cid-miR-218-5p的过表达和抑制表达对 cid-miR-218-5p 进行过表达和抑制表达实验。分为4组：过表达组（转染cid-miR-218-5p mimic模拟物，转染浓度为20 mmol/L）、抑制表达组（转染cid-miR-218-5p inhibitor 抑 制 物，转 染 浓 度 为20 mmol/L）、阴性对照NC组（转染NC，转染浓度为20 mmol/L）和阳性对照组（LCDV-cn 正常感染，无转染）。按常规细胞培养方法，用 MEM 培养基（含100 mg/mL FBS，不含抗生素）培养GCO细胞，当 GCO 单层细胞融合度为 70%90%时，使用Lipofectamine RNAiMAX 将 cid-miR-218-5p mimic、cid-miR-218-5p inhibitor 和 NC 分别转染入 GCO 细胞，继续培养 24 h 后，用 LCDV-cn 进行感染，并于20 继续培养。然后，收集LCDV-cn感染GCO细胞后 0、4、8、16、24、48、72、144 和 196 h 样品，制备引物PrimersRT-miR-218-5pmiR-218-5p-FRT-miR-218amiR-218a-FRT-miR-218bmiR-218b-FRT-miR-218b-1miR-218b-1-FRT-miR-218b-2miR-218b-2-FmiR-218-RU6F15U6R15RV14M1314GLO-il10FGLO-il10Rqil10Fqil10RqmcpFqmcpR18s-F1618s-R16序列Sequences(53)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACATGGGCGCTTGTGCTTGATCTAAGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACATGGCGCTTGTGCTTGATCTAACGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCATGGGCGCTTGTGCTTGATCTAAGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCATGGCGCTTGTGCTTGATCTAACGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATGGTGCGCTTGTGCTTGATCTAGTGCAGGGTCCGAGGTCTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACCGAGCTCTCCCTTTGAGTTTGCCACCACCGCTCGAGGCAGTGCATCAGCAAGTAGTGCCAAAACGCCCATCGATTCCTGGTGGCAAACTCAAAGGGAGGCTCTATTCCTGTAGACACCGCTGACATTGGACAAACGACCAATTACCCATTTCCGACACGTTTCCGATACGCTCATTC用途Usagecid-miR-218-5p茎环RT-PCR反转录cid-miR-218-5p茎环RT-PCR和定量PCRcid-miR-218a茎环RT-PCR反转录cid-miR-218a茎环RT-PCR和定量PCRcid-miR-218b茎环RT-PCR反转录cid-miR-218b茎环RT-PCR和定量PCRcid-miR-218b-1茎环RT-PCR反转录cid-miR-218b-1茎环RT-PCR和定量PCRcid-miR-218b-2茎环RT-PCR反转录cid-miR-218b-2茎环RT-PCR和定量PCR茎环RT-PCR和定量PCRmiRNA定量PCR内参菌落PCR构建pmirGLO-il-10il-10 定量PCRmcp 定量PCR定量PCR内参表1本研究所用引物Table 1Primers used in this study55第43卷广东海洋大学学报cDNA用于cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn主要衣壳蛋白（major capsid protein）基因 mcp 的表达定量。cid-miR-218-5p、cid-miR-218-5p 靶 基 因 il-10、LCDV-cn mcp基因的定量PCR所用引物见表1，反应体系和反应条件见1.4。1.8cid-miR-218家族调控LCDV-cn感染的信号通路预测应 用 GO（http:/geneontology.org/）和 KEGG（https:/www.genome.jp/kegg/）数据库，对 cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。2 结果与分析2.1 cid-miR-218家族成员的茎环RT-PCR扩增图1可见，样品RNA无降解，茎环特异性反转录结果良好，可用于后续实验。茎环RT-PCR扩增后，获得预期大小的片段（图2）。菌落PCR（图2）和测序结果表明，获得了正确的 cid-miR-218 家族成员，包 含 cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2。生物信息学分析表明，cid-miR-218家族的前体序列不同，可能由草鱼不同染色体编码。cid-miR-218家族与其他物种的 miR-218 家族（miRBase:https:/www.mirbase.org/）同源（表2）。2.2 cid-miR-218家族成员的表达特性图 3 可见，在 LCDV-cn 感染 GCO 细胞过程中（0 196 h），cid-miR-218-5p 的表达先升后降再上升，4、8 h时显著上升（P 0.05），在 16 48 h时降低，72 196 h时再次上升（P 0.05）；cid-miR-218b、cid-miR-218b-1 和 cid-miR-218b-2 的表达量一直极低，不同时间表达差异也不显著（P 0.05）。2.3 cid-miR-218家族成员靶基因的预测预测结果表明，cid-miR-218家族成员有较多共同的靶基因，其中，il-10是cid-miR-218家族每个成员共有的靶基因。应用 RNA22 预测到 il-10（GenBank登录号：JQ768312）与cid-miR-218家族成员的结合位点相同（图4），因miRNAs的长度不同而稍有差异。由于cid-miR-218家族成员与靶基因il-10的结合位点相同，且在LCDV-cn感染过程中cid-miR-218-5p 表达差异最显著，后续研究以 cid-miR-218-5p作为家族成员代表。2.4 cid-miR-218-5p靶基因的验证含靶位点的草鱼il-10片段长度为324 bp，位于il-10基因mRNA（GenBank登录号：JQ768312）的第602 845碱基。菌落PCR、双酶切（图5）和测序结果说明插入的目的片段正确，成功构建了双荧光素酶报告质粒pmirGLO-il-10。图6显示，共转染pmirGLO-il-10和 cid-miR-218-5p mimic后，双荧光素酶活性显著下降，且与共转染cid-miR-218-5p inhibitor或NC后双荧光素酶活性差异显著，表明草鱼il-10是cid-miR-218-5p的靶基因。2.5 cid-miR-218-5p的过表达和抑制表达图7可见，在LCDV-cn感染GCO过程中，上调cid-miR-218-5p后，cid-miR-218-5p的表达量明显升高（P 0.05）；下调cid-miR-218-5p后，cid-miR-218-5p 的表达量明显下降（P 0.05）。The date with the same letter or without letter means that there was not significant difference between different time for a family number(P 0.05).Astatotilapia burtoni abu-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 布氏新亮丽鲷 Neolamprologus brichardi nbr-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 nbr-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 罗非鱼 Oreochromis niloticus oni-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 oni-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 红丽鱼 Pundamilia nyererei pny-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 pny-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 大西洋鳕 Gadus morhua gmo-miR-218-5p UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 河鲀 Tetraodon nigroviridis tni-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus ipu-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUG 20 ipu-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGC 21 锦龟 Chrysemys picta cpi-miR-218-5p UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 非洲爪蟾 Xenopus tropicalis xtr-miR-218 UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 21 短吻鳄 Alligator mississippiensis ami-miR-218-5p UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 21 2.2 cid-miR-218 家族成员的表达特性 图 3 可见，在 LCDV-cn 感染 GCO 细胞过程中（0 196 h），cid-miR-218-5p 的表达先升后降再上升，4、8 h 时显著上升（P 0.01），在 16 48 h 时降低，72 196 h 时再次上升（P 0.05）。The date with the same letter or no letter indicate no significant difference between different time in a group(P 0.05)图 3 cid-miR-218 家族在 LCDV-cn 感染 GCO 过程中的时序表达 Fig.3 Temporal expression of the cid-miR-218 family in GCO cells challenged with LCDV-cn 2.3 cid-miR-218 家族成员靶基因的预测 预测结果表明，cid-miR-218 家族成员有较多共同的靶基因，其中，il-10 是 cid-miR-218 家族每个成员共有的靶基因。应用 RNA22 预测到 il-10（GenBank 登录号：JQ768312）与 cid-miR-218 家族成员的结合位点相同（图 4），因 miRNAs 的长度不同而稍有差异。由于 cid-miR-218 家族成员与靶基因 il-10 的结合位点相同，且在 LCDV-cn 感染过程中 cid-miR-218-5p 表达差异最显著，后续研究以 cid-miR-218-5p 作为家族成员代表。UTR：非编码区；CDS：蛋白质编码区 UTR:Untranslated regions;CDS:Coding for amino acids in protein cid-miR-218-5pcid-miR-218acid-miR-218bcid-miR-218b-1cid-miR-218b-2baccc040801200 4 8 16 24 48 72 144 196 时间 Time/h相对表达Relative expressionfdee5-UTRCDS3-UTRil-10682TAATGGACAGATCAACCACAT702TGTACCAATCTAGTTCGTGTT（cid-miR-218-5p 35)681ATAATGGACAGATCAACCACAT702GTGTACCAATCTAGTTCGTGTT（cid-miR-218a 35)682TAATGGACAGATCAACCACAT702CGTACCAATCTAGTTCGTGTT（cid-miR-218b 35)681ATAATGGACAGATCAACCACAT702ACGTACCAATCTAGTTCGTGTT（cid-miR-218b-1 35)683AATGGACAGATCAACCACAT702GTACCAATCTAGTTCGTGTT（cid-miR-218b-2 35)2.6cid-miR-218-5p在感染过程中对其靶基因il-10的调控作用图 8 可见，在 LCDV-cn 过程中，il-10 的表达上升。上调cid-miR-218-5p后，靶基因il-10表达下降，其表达量一直较低，与其他组的相应表达量差异显著（P 0.05）；下调 cid-miR-218-5p 后，靶基因 il-10的表达上升，与其他组的相应表达量差异显著（P 0.05）。说明 cid-miR-218-5p 对其靶基因 il-10 表达57第43卷广东海洋大学学报起负调控作用。2.7 cid-miR-218-5p在感染过程中对LCDV-cn复制的调控作用图 8 可见，在 LCDV-cn 过程中，mcp 的表达上升。上调cid-miR-218-5p后，GCO细胞中LCDV-cnmcp基因的表达下降，其表达量一直较低，与其他组的相应表达量差异显著（P 0.05）；下调 cid-miR-218-5p后，GCO细胞中LCDV-cn mcp基因的表达上图4cid-miR-218家族与其靶基因il-10的结合位点Fig.4Binding sites of the cid-miR-218 family with thetarget gene il-10Astatotilapia burtoni abu-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 布氏新亮丽鲷 Neolamprologus brichardi nbr-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 nbr-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 罗非鱼 Oreochromis niloticus oni-miR-218a UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG 22 oni-miR-218b UUGUGCUUGAUCUAACCAUGCA 22 红丽鱼 Pundamilia nyererei pny-miR-2