除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析.pdf

.():/.:./.周黎 李伽文 徐郅卓 等.除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析.广西植物():.():.除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析周 黎 李伽文 徐郅卓 曾 拓 王彩云(.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 武汉 .贵州师范大学 生命科学学院贵阳 )摘 要:天然除虫菊酯是从除虫菊()中提取的绿色植物源生物杀虫剂 醛脱氢酶()和 脂肪酶()是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶 为探究 和 基因的功能该研究从除虫菊无性系中克隆得到 和 基因的启动子并通过生物信息学分析、组织化学染色(染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析 结果表明:()克隆得到的 和 启动子序列分别为 、均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件()分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体在烟草叶片中观察荧光成像发现 启动子具有茉莉酸甲酯()和脱落酸()激素诱导特异性()用 和 处理除虫菊组培苗发现 的表达量在 内受 诱导时上调受 诱导时先升高后降低 的表达量受 和 诱导下调()分别构建了 和 启动子与 基因融合的植物表达载体转化烟草并对其转基因叶片进行 活性染色发现 启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达而 启动子仅在烟草叶肉细胞中表达 综上认为 和 的启动子具有组织特异性 启动子具有 和 激素诱导特性 该研究结果为除虫菊 和 基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解关键词:除虫菊 醛脱氢酶()脂肪酶()启动子 功能分析中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.().)收稿日期:基金项目:国家重点研发项目()中央高校基础研究基金()国家自然科学基金()第一作者:周黎()硕士研究方向为观赏植物生理与调控().通信作者:王彩云博士教授研究方向为花卉生理与品质及其花卉应用().:().()().().:().()().()().().().:除虫菊()作为一种多年生菊科植物几个世纪以来一直被用于提取绿色植物源杀虫剂除虫菊酯(.)其因提取于花头的除虫菊酯具有杀虫迅速、无富集易降解、对哺乳动物毒性小、适用于敏感人群等特性被广 泛 应 用 于 有 机 农 业 和 家 居 防 治()其花头还能够释放大量挥发性萜烯()法尼烯()b 能够在田间吸引瓢虫驱避蚜虫(.)同时吸引大量授粉昆虫如食蚜蝇等(.曾拓等)因此除虫菊也作为一种间作作物在我国云南有广泛的应用(周黎等)全世界对除虫菊酯的需求较大将其作为天然植物源杀虫剂以避免过度使用化学合成杀虫剂(.)因此如何提高除虫菊酯的含量一直是除虫菊产业和基础研究的热点和重点除虫菊酯在植物体内由单萜羧基部分(菊酸和除虫菊酸)和酮醇部分(除虫菊酮醇、茉莉酮醇和瓜 叶 酮 醇)酯 化 形 成(.)酸前体来源于萜烯途径的质体甲基赤藓醇 磷酸()途径(.)酮醇前体来源于茉莉酸类激素()途径(.)在除虫菊酯单萜合成模型中两分子二甲基烯丙基二磷酸()首先在腺体中依次由菊基二磷酸合成酶()、乙 醇 脱 氢 酶 ()、醛 脱 氢 酶 ()催化形成前体分子菊酸随后菊酸被运输到腺体下方的皮下组织最终在种子和果皮中被 脂肪酶()催化形成除虫菊酯后被胚胎吸收转移至幼苗组织中(.)参与除虫菊酸部分最后一步催化反应合成菊酸 菊酸 和酮醇则在 的催化 期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析作用下通过酯键相连合成最终产物除虫菊酯(.)由此可知 和 是除虫菊酯合成的关键限速酶基因 目前已经从拟南芥和棉花中克隆到大量 和 基因的启动子(.)此外高粱、大豆以及黄花蒿等物种中也报道了 基因的启动子 然而从除虫菊中仅分离出一个具有腺体特异表达的菊基二磷酸合成酶基因 的启动子(.)因此研究其他除虫菊酯合成酶基因的启动子是解析除虫菊酯合成调控机制的前提茉莉酸及其衍生物不仅作为反应底物参与除虫菊酯酮醇部分的生物合成同时作为防御应激类激素调控除虫菊酯的合成(.)课题组前期进行了茉莉酸甲酯处理下的白花除虫菊叶片和花期转录组数据分析注释到了很多与除虫菊酯合成代谢相关的基因 基于此本研究通过除虫菊无性系 克隆得到 和 基因的启动子序列对其调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行了分析进一步揭示除虫菊酯的合成机制及代谢调控中植物激素的作用从而为培育除虫菊优良品种和提高除虫菊酯含量提供理论依据材料与方法.实验材料除虫菊无性系的叶片取自华中农业大学组培室 大肠杆菌 和根癌农杆菌、购自上海唯地生物技术有限公司 用于转化的本氏烟草()在 、光照/黑暗条件的组培室中生长.启动子克隆利用 (美基生物 中国)提取除虫菊叶片的 作为模板依据除虫菊基因组(.)设计 基因启动子的特异引物 及 下游(表)基因启动子的特异引物 及 下游(表)利用 高 保 真 酶 ()进行扩增将扩增产物连接到 载体()转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序 利用除虫菊基因组对获得的片段进行检验 利用 软件对启动子的元件进行预测.载体构建以测序正确的质粒为模板分别利用含有同源重 组 片 段 的 引 物、(表)进行扩增 回收 产物连接到经 酶切的 载体上转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序选取测序正确的载体转化 农杆菌以测序正确的质粒为模板分别利用含有同源重组片段的引物、(表)进 行 扩 增 回 收 产物连接到经 和 酶切的 载体上转化大肠杆菌挑选单菌落进行测序选取测序正确的载体转化 农杆菌.烟草中 瞬时表达和荧光成像将含有重组 载体的农杆菌单菌落接种到发根农杆菌培养基()中培养至.离心 后用 侵染液重悬调节至 .选取生长 至 周的本氏烟草用无针头的注射器将农杆菌菌液注射到烟草叶片叶片左半部分注射含有空载 载体的农杆菌右半部分注射含有重组 载体的农杆菌 注射后的烟草置于人工气候室中培养 后在烟草叶片上喷施 的脱落酸()浓度参考胡慧敏等()的方法或喷施 的茉莉酸甲酯()浓度参考陈雨倩等()的方法以喷施清水植株的叶片作为对照 放 置 后 将 试 剂 盒 中 的 与 混合涂抹在烟草的注射区然后使用 (德国)仪器观察荧光.不同激素处理下除虫菊 和 基因表达分析 处 理:以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊 无 性 系 作 为 实 验 材 料 使 用 的 的 溶液喷施处理组培苗浓度参考()拧紧瓶盖培养、后将实验材料叶片放置在液氮中迅速冷却后保存于 冰箱广 西 植 物 卷 处 理:以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊 无 性 系 作 为 实 验 材 料 使 用 的 的 溶液喷施处理组培苗拧紧瓶盖培养、后将实验材料叶片放置在液氮中迅速冷却后保存于 冰箱利用 分析两种激素处理后的基因表达水平 提取使用植物 提取试剂盒 (康为世纪生物科技有限公司)反转录形成 使用 (北京全式金生物技术有限公司)进行荧光定量分析荧 光 定 量 的 仪 器 为 试剂为 (北京艾德莱生物科技有限公司)荧光定量使用的引物为、和 (表)(.).烟草遗传转化筛选及 表达将含有 质粒的农杆菌单菌落接种到 液体培养基中培养至 .离心 后用液体 ()基本培养基重悬调节至 .将烟草叶片切成.放入农杆菌菌液侵染 后在滤纸上晾干将侵染后的烟草叶片转移至共培养培养基上培养基配方为 基本培养基.苄氨基嘌呤().萘乙酸()黑暗条件下培养 后将叶片转移至筛选培养基培养基配方为 基本培养基.头孢霉素()卡那霉素()每 周继代一次当抗性芽生长至 时将抗性芽切下放置在含有 和 的 培养基中继续培养提取卡纳霉素抗性本氏烟草叶片的 以其为模板用 作为上游 启动子 特 异 引 物 作 为 下 游 检 验 转基因烟草用 作为上游 作为下游检验 转基因烟草转化所用菌株为阳性对照野生烟草为阴性对照 植物 提取试剂盒为 (美基生物中国)扩增 为 (近岸蛋白质科技有限公司中国)表 实验所用引物 引物序列 到(从左到右)()将继代培养一个月的阳性烟草用 (中国)进行染色实验步骤参照试剂盒说明书染色后用 的酒精脱色至叶片完全褪绿后在体视显微镜下观察染色情况 每个启动子均取 个独立的转基因株系进行染色结果与分析.和 启动子克隆以提取的除虫菊基因组 为模板使用特异性引物 和 克隆得到 基因 上游 的启动子序列使 期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析.片段.片段.图 ()和()扩增.()()用特 异 性 引 物 和 扩 增 启动子获得条带大小为 (图)分别命名为 和.和 调控元件分析利 用 软 件 分 析 了 和 的顺式作用元件 结果显示在 序列 的区域共检测到 种 个作用元件在 序列 的区域检测到 种 个作用元件 和 均含有多个核心启动子元件()和增强子元件()等基本特征元件此外还包含许多与激素响应、水杨酸()、生长素()、赤霉素()等胁迫响应(损伤、低温、干旱等)和光响应相关的元件(表 表)这两个基因启动子序列均含有 响应元件(和)和 响应元件().和 活性和激素诱导特性分析将含有 和 表达载体的农杆菌分别注射烟草叶片荧光成像结果显示含有 和 载体的农杆菌注射部位荧光强度高于空载对照说明 和 能够驱动 基因的表达具有启动子活性 注射含有 表达载体农杆菌的叶片在 和 激素处理后荧光强度显著高于清水对照表明 具有 和 激素诱导特性(图)而注射含有 表达载体农杆菌的叶片在 和 激素处理后荧光强度低于清水对照(图).不 同 激 素 处 理 下 除 虫 菊 叶 片 和 基因表达分析用 和 处理除虫菊 组 培 苗检 测 和 基 因 转 录 水 平 结 果 表 明 和 处理可显著影响除虫菊 和 基因的表达其中 的表达受 诱导上调受 诱导表达量先升高后降低 的表达受 和 诱导下调(图).和 组织特异性分析将 和 启动子区域与 报告基因融合转化烟草获得了 个独立的 广 西 植 物 卷表 部分顺式作用元件 类别名称核心序列 数量预测功能 转录调控核心启动子元件 启动子和增强子区的共顺式作用元件 激素响应生长素响应元件 参与茉莉酸甲酯响应的顺式作用元件 参与脱落酸响应的顺式作用元件 参与赤霉素响应的顺式作用元件 参与水杨酸响应的顺式作用元件 胁迫响应 结合位点参与干旱诱导 创伤响应 参与低温反应的顺式作用元件 参与防御和应激反应的顺式作用元件 无氧诱导所需的顺式作用元件 光响应/光响应模块的一部分 光响应的部分保守 模块 部分光响应元件 光响应元件 光响应的顺式作用元件 转基因株系和 个独立的 转基因株系 对这些转基因株系进行 染色结果表明在野生型植物中无任何组织观察到蓝色在 转基因烟草叶的腺毛头部显现出明显蓝色而在 转基因烟草叶中未发现明显的组织特异染色(图)讨论与结论本研究利用除虫菊基因组及 测序验证 期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析表 部分顺式作用元件 类别名称核心序列 数量预测功能 转录调控核心启动子元件 启动子和增强子区的共顺式作用元件 激素响应参与茉莉酸甲酯响应的顺式作用元件 参与脱落酸响应的顺式作用元件 胁迫响应 创伤响应 参与低温反应的顺式作用元件 参与防御和应激反应的顺式作用元件 结合位点参与干旱诱导 光响应 光响应模块的一部分 光响应的顺式作用元件 光响应元件 获 得 了 和 的 启 动 子 序 列 和 序列均含有多个核心启动子元件()和增强子元件()等基本特征元件表明这两个基因的启动子拥有典型启动子的功能 此外 和 区域还包含了激素响应、胁迫响应和光响应元件 启动子序列分析表明 和 均含有参与 响应的 基序和 响应基序这恰好解释了 可以促进除虫菊酯的合成 类似地在 和 中均发现了 元件它是参与干旱诱导的 的结合位点而有趣的是之前 等()研究表明除虫菊酯的产量受干旱的影响 除了除虫菊中 和 基因会响应机械损伤使得除虫菊酯含量上升外(.)黄花蒿中 基因也会因为伤害处理而上调(王焕燕)这可能与损伤响应元件 相关 综上可知和 序列包含、等转录因子可结合的元件如、等(.)因此推测这两个基因的表达可能受这些转录因子的调控 最 新 的 研 究 发 现 证 实 了 白 花 除 虫 菊 中 和 均可以通过上调 基因表达进而提高叶片中除虫菊酯的含量(.)植物次生代谢物质合成受茉莉酸()、等植物激素的调控(.)作为除虫菊酯合成关键基因其启动子具有 和 激素诱导特性 的基因表达量在 诱导下上调在 诱导下先显著上升后下降 这与前人的研究结果基本一致除虫菊中 和 基因的表达受 的影响(.)进一步证明 可以调控除虫菊酯合成 在除虫菊的近缘种黄花蒿中用 处理黄花蒿 基因表达量也有显著的提高(王焕燕)这说明 也会调控青蒿素的合成 与 处理结果相反的是 启动子不具备 和 诱导广 西 植 物 卷.处理.处理.图 不同激素处理下 和 转基因烟草荧光成像结果.特异性且处理后基因表达量显著下降 这与前人研究报道的拟南芥 不受 调控结果基本一致 仅为 响应分泌蛋白(.)而 可以响应 并通过响应生长素抵御生物胁迫(.)拟南芥、棉花和除虫菊的 基因启动子均能响应 除此之外除虫菊 可以响应 拟南芥和棉花 基因启动子均可响应乙烯()且拟南芥 基因启动子具有生长素诱导特性这在除虫菊中未见报道(.期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析.处理下 基因的表达分析.处理下 基因的表达分析.处理下 基因的表达分析.处理下 基因的表达分析 不同小写字母表示差异显著(.).(.).图 不同处理下除虫菊叶片 和 基因表达分析.图 转基因烟草和野生型烟草 染色.广 西 植 物 卷 .胡阳光)这说明参与代谢合成的基因通常具有各自的激素诱导特异性通过响应一种或者多种植物激素调控次生代谢物质合成在植物生物或非生物胁迫中发挥作用 等()研究表明 能够促进次生代谢物在植物体内的积累 短效处理可以促进除虫菊酯合成基因的瞬时上调但不能维持较高的除虫菊酯含量 路径部分合成酶基因和 基因表达量反而下调(.)除虫菊酯前体物质主要在腺体中合成被运输到细胞外形成最终产物储存在花头的子房中(王凤姣等)花头中具有丰富的特殊结构如 分 泌 管/腔 或 胞 外 空 间(.)然而在叶片中并没有发现类似的结构或空间来储存除虫菊酯 除虫菊毛状根中也仅存在极低含量的除虫菊酯(.)这意味着除虫菊酯的生物合成可能受到强大的负反馈以避免除虫菊酯的过度积累 植物体内这种负反馈调节机制可能通过抑制 酶的活性从而降低除虫菊酯的含量此外 组织染色结果表明 主要在腺体中表达而 仅在皮下薄壁细胞表达 这些结果基本与前人的研究一致即腺体中表达的 用以合成菊酸薄壁细胞中表达 用以合成除虫菊酯(.)黄花蒿 基因只在成熟的莲座叶的腺毛体中表达(王焕燕)然而本研究的结果与前人的预测略有不同本研究表明薄壁细胞也可能具有表达 的能力 基因并非为腺体特异表达 拟南芥中 和其他 信号同样定位在细胞壁或者胞外(.)通过亚细胞定位研究拟南芥 和 蛋白多分泌于质体和细胞质中 蛋白通常分布在细胞壁或胞外(.)当 前 报 道 仅 分 析 了 棉 花 和 基因组数据和启动子的元件在空间表达研究上 未 见 报 道(.)本研究分析了 和 的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性其中 具有 和 激素诱导特异性且这两种激素影响除虫菊酯合成基因的表达水平 主要定位在腺体中而 主要定位在胞外这再次验证了菊酸的合成部位在腺体而除虫菊酯的合成部位在胞外 本研究可为进一步探讨除虫菊中 和 基因的表达调控机制提供理论参考依据参考文献:.(.).:.():.陈雨倩 徐刚 令狐前前.麻疯树 基因启动子克隆及其功能初步分析.植物生理学报():.():.().:.().():.():.胡慧敏 蔡婉菡 穆可彬 等.大豆 信号途径 基因异源表达探究.大豆科学():.:.胡阳光.棉花 和 基因在盐和干旱胁迫下功能初步分析.开封:河南大学.():.().:.期周黎等:除虫菊 和 基因启动子克隆及功能分析 .():.().()():./().():.:.():.().:.():.():.:.():./().():.():.:.():.:.():.():.():.():./.:.().:.:.王焕燕.黄花蒿 启动子的克隆及其功能分析.重庆:西南大学.:.:.:.():.王凤姣 徐海洋 闫建斌 等.植物天然农药除虫菊酯的生物合成和应用研究进展.合成生物学():.():.():.():.():.:.():.():.曾拓 李伽文 周黎等.观赏植物花色与授粉昆虫相互适应关系的研究进展.园艺学报():.():.()():.周黎 曾拓 李进进 等.除虫菊间作套种模式及其农艺效应初探.贵州师范大学学报(自然科学版)():.(责任编辑 周翠鸣)广 西 植 物 卷