表面增强拉曼散射检测细菌及病原体的研究现状及展望.pdf

第 卷第期光散射学报V o l N o 年月THEJ OUR NA LO FL I GHTS C A T T E R I NGJ u n 文章编号:()表面增强拉曼散射检测细菌及病原体的研究现状及展望张伟达,彭宇思,林成龙,徐美美,黄政仁,杨 勇,(中国科学院 上海硅酸盐研究所,高性能陶瓷与超微结构国家重点实验室,上海 ;中国科学院大学 材料科学与光电技术学院,北京 )摘要:表面增强拉曼散射(S E R S)技术是一种在单分子水平上通过收集分子光谱信号来识别分子物种的强有力的工具,现已被广泛用于医学诊断、食品安全、生物分析等领域.本文综述了S E R S技术在常见细菌及病原体的研究进展,阐述了通过设计和调控纳米结构的形貌、种类(贵金属和半导体衬底)、掺杂元素、氢化时间和物理条件(温度、p H)等使其具有优异的灵敏度,从而扩大S E R S技术的应用.同时讨论了S E R S技术与现在热门的微流控技术、C R I S R P技术的联用,以及在单分子检测上的优缺点.最后,展望了S E R S生物传感器技术的发展前景.关键词:S E R S细菌病毒C R I S P R微流控中图分类号:O 文献标志码:Ad o i:/j i s s n 收稿日期:,修改日期:基金项目:国家重点研发计划政府间国际科技创新合作项目(Y F E )、国家自然科学 基金面上项目()、上海市科委生物专项(D X )和上海市优秀学术带头人(X D )项目通讯作者:杨勇,二级研究员,博士生导师,中国科学院引进杰出人才和上海市浦江人才、上海市优秀学术带头人,E m a i l:y a n g y o n g m a i l s i c a c c nR e s e a r c ha n dp r o s p e c t i v eo f s u r f a c e e n h a n c e dR a m a nS c a t t e r i n gf o rd e t e c t i o no fb a c t e r i aa n dp a t h o g e n sZ HANG W e i d a,P E NGY u s i,L I NC h e n g l o n g,XU M e i m e i,HUANGZ h e n g r e n,YANGY o n g,(S t a t eK e yL a b o r a t o r yo fH i g hP e r f o r m a n c eC e r a m i c sa n dS u p e r f i n eM i c r o s t r u c t u r e s,S h a n g h a i I n s t i t u t eo fC e r a m i c s,C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,S h a n g h a i ,C h i n a;C o l l e g e o fM a t e r i a l sS c i e n c ea n d O p t o E l e c t r o n i c sE n g i n e e r i n g,U n i v e r s i t yo fC h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,B e i j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:S u r f a c e e n h a n c e dR a m a ns c a t t e r i n g(S E R S)t e c h n o l o g y i s ap o w e r f u l t o o l t o i d e n t i f ym o l e c u l a r s p e c i e sb yc o l l e c t i n gm o l e c u l a r s p e c t r a l s i g n a l sa t t h es i n g l e m o l e c u l e l e v e l,a n dh a sb e e nw i d e l yu s e d i nm e d i c a ld i a g n o s i s,f o o ds a f e t y,b i o l o g i c a l a n a l y s i sa n do t h e r f i e l d s I nt h i sp a p e r,t h er e s e a r c hp r o g r e s so fS E R St e c h n o l o g yi nc o mm o nb a c t e r i aa n dp a t h o g e n sw a s r e v i e w e d,a n di tw a se x p o u n d e dt h a tt h em o r p h o l o g y,t y p e(p r e c i o u sm e t a la n ds e m i c o n d u c t o rs u b s t r a t e),d o p i n ge l e m e n t s,h y d r o g e n a t i o nt i m e,p h y s i c a lc o n d i t i o n s(t e m p e r a t u r e,p H)o fn a n o s t r u c t u r e sw e r ed e s i g n e da n dr e g u l a t e dt om a k e i th a v ee x c e l l e n t s e n s i t i v i t y,t h u sa m p l i f y i n gt h ea p p l i c a t i o no fS E R St e c h n o l o g y A t t h es a m e t i m e,t h ec o m b i n a t i o no fS E R St e c h n o l o g ya n dp o p u l a rm i c r o f l u i d i ct e c h n o l o g ya n dC R I S R Pt e c h n o l o g yw e r ed i s c u s s e d,a sw e l l a st h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fS E R St e c h n o l o g yi ns i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n F i n a l l y,t h ed e v e l o p m e n tp r o s p e c t o fS E R Sb i o s e n s o r t e c h n o l o g yw a sp r o s p e c t e d K e yw o r d s:S E R Sb a c t e r i aV i r u sC R I S P R M i c r o f l u i d i c s光散射学报第 卷引言病原体是指可以造成人或动植物感染疾病的微生物(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌)、寄生虫或其它媒介(微生物重组体包括杂技体或突变体),它是能引起疾病的微生物和寄生虫的统称.其中,对人类健康威胁较大的是真菌、病毒以及细菌.致病性细菌和病毒在人体内快速甚至爆炸性增殖,对人类生命健康造成严重威胁.世纪爆发了三次由病毒传播引起的大规模疫情,分别是由 年的S A R S病毒、年的ME R S病毒以及 年的S A R S C o v 病毒在社会上迅速传播而导致大面积感染的现象.大多数病原体可以通过呼吸道飞沫的方式进行传播,同时注意到病原体对环境的污染可能造成接触传播或者气溶胶传播.因此,高效鉴定和监测病原体的方法和技术已引起人们的广泛关注.目前,诊断传染病最好的方法是:实时聚合酶链反应用于分子诊断,电化学发光用于免疫检测,酶联免疫吸附法用于吸附检测 .荧光检测技术目前已广泛应用于病毒和细菌的测量和分析.有机染料或无机量子点组成的荧光标记剂已用于基于荧光测量的生物分析.虽然荧光检测技术有很好的应用,但仍存在一些问题,如灵敏度低或缺乏灵敏度,而这一特征对于特定基因的生物测定是必需的.近年来,一些研究人员提出了一种解决荧光检测问题的新方法 表面增强拉曼散射技术,.表面增强拉曼散射(S u r f a c e e n h a n c e dR a m a ns c a t t e r)是指吸附于纳米尺度的粗糙金属或者非金属化合物衬底上分子的拉曼信号得到增强的现象.通常可以观察到吸附在某些纳米结构表面的分子产生的拉曼光谱强度相比于相同数量的分子产生的拉曼光谱强度得到了数量级的提高.此外,考虑到电磁增强机制具有很高的增强因子,可以达到 ,同时电磁增强机制具有局域性的长程增强效应,因此被检测的分子只要位于散射电场的作用区域内,即距离金属纳米结构表面 范围内,其都能被衬底表面的局域等离子体电场所激发产生S E R S增强效果.年,F l e i s c h m a n n团队在吸附有吡啶分子的粗糙银电极表面观察到被显著增强的吡啶分子拉曼信号,这标志 着S E R S现 象 的 首 次 现 世,年,V a nD u y n e和C r e i g h t o n等人 对从粗糙电极表面获得的强拉曼信号进行了详细的实验证明和理论计算,发现拉曼光谱的表面增强因子约为个数量级,远高于之前认为的数十倍.这种粗糙银电极产生的巨大增强效应使S E R S研究成为可能.而传统的拉曼散射技术由于大部分光子都发生没有能量交换的瑞利弹性散射,而只有约/部分的光子以非弹性的方式散射,这使得拉曼散射光强度十分弱,严重限制了拉曼光谱技术的应用,而S E R S的出现解决了拉曼散射强度弱的问题,扩大了拉曼技术在实际检测中的应用.S E R S在病原体检测的应用 S E R S用于病原体的鉴定与检测 S E R S用于细菌检测金银作为典型的贵金属材料,本身优异的物理化学性质使其具有良好的S E R S增强效果.考虑到金银纳米颗粒本身优异的抗菌性能,尤其是银纳米颗粒,在抗生素投入使用之前,因具有良好的抗菌性能被用来处理烧伤等开放型伤口.正如我们所了解的,S E R S增强效果以及光谱的可分析性与纳米结构本身密切相关,而材料的理化性质对其纳米颗粒的结构有显著的影响,因此电荷分布、尺寸大小、形貌、颗粒组成、表面包覆情况、浓度、团聚、溶解速率和用于合成的还原剂类型等对纳米结构有影响的因素,都会影响最终得到的S E R S光谱.一般来说,获得细菌S E R S光谱的方法有以下三种:直接在细菌表面或内部形成胶体银;通过制备性能良好的S E R S活性基底,将细菌直接放置在S E R S活性基底上;将细菌和胶体均匀混合,将所得混合物放在平面上.在常规的细菌S E R S检测中,为了消除培养基中营养物质对所得到的光谱的干扰,需要对细胞进行清洗/离心循环操作,考虑到渗透失衡的存在,一些菌株的细菌是对渗透压变化敏感的,为了防止溶解的发生我们需要采用缓冲液去清洗.已经有研究表明,硼酸盐溶液是一种不抑制S E R S效应的缓冲,同时硼酸盐缓冲液也没有表现出明显的S E R S光谱.故在单个细菌上形成胶体金或胶体银最常用的方法是将细菌浸泡在N a B H溶液中.为了在细菌表面制备胶体,D i n a和Z h o u等人,通过向细菌样本中先加入硝酸银溶液,m i n之后再加入盐酸羟胺溶液以减少阴离子在细菌细胞壁上的吸附作用,同时在进行S E R S检测前,将悬浮液样本移到玻片上,并指出必须使用多聚赖氨酸覆盖的玻片来固定革兰氏阳性细菌.虽第期张伟达:表面增强拉曼散射检测细菌及病原体的研究现状及展望然硼氢化物制备了完全包裹细菌细胞的A g/A u涂层,但如图中(a)观察到A g N P s簇与细胞壁接触,这表明包裹率并未达到 ,图中(b)显示了大肠杆菌(革兰氏阴性)和表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)的S E R S光谱.W e i等人 分析了B R缓冲液在不同p H下得到的S E R S光谱,结果表明随着p H的变化,如图所示,革兰氏阴性菌(G)的S E R S光谱强度和特征峰波数的变化比革兰氏阳性(G)明显,证明了为了得到细菌样品中更详细的S E R S光谱,必须严格控制缓冲液的p H.400800120016002000Ratman shift(cm)-1E.coli 5695S.epidermidisnormalized normalized(a)(b)图(a)大肠杆菌的T EM图.红色箭头表示具有大而细长结构的A g复合材料.(b)E c o l i 和S e p i d e r m i d is与A gN P s簇接触的S E R S光谱.在 n m激发下,对 批样品进行了光谱分析F i g (a)T EMo fE c o l i R e da r r o w s i n d i c a t eA gc o m p o s i t e s w i t hl a r g ea n d e l o n g a t e ds t r u c t u r e s(b)S E R Ss p e c t r ao fE c o l i a n dS e p i d e r m i d i s i nc o n t a c tw i t hA gN P sc l u s t e r s T h es p e c t r ao f b a t c h e so fs a m p l e sw e r ea n a l y z e du n d e r n me x c i t a t i o n图不同p H细菌的S E R S光谱F i g S E R Ss p e c t r ao fb a c t e r i aw i t hd i f f e r e n tp H采用将细菌直接放在S E R S活性基底上的方法获得S E R S光谱时,得到良好的细菌S E R S光谱的关键是制备具有S E R S活性的基底,A g、A u等贵金属在这方面表现出优良的特性.M a l v a d k a r等 利用斜角气相沉积聚合技术,在低真空条件下,将氯对二甲苯(P P X C l)纳米薄膜沉积在烯丙基化硅片上,制备S E R S衬底,然后通过热蒸发将一层金膜沉积在P P X C l表面上,从而建立具有S E R S活性的表面,该结构是由直径为 n m的纳米线阵列平行组装而成的.测试时,通过接种环将细菌悬浮液样品放置到S E R S衬底表面,然后进行拉曼测试,其拉曼光谱如图所示.L i n等人 制备了一个类似过滤器的S E R S活性基底,将含有金黄色葡萄球菌样品直接滴到基质表面,得到的S E R S光谱以 和 c m的峰为主,这是由于其细胞壁上胡萝卜素存在导致的,在 C F U/m L浓度下检测金黄色葡萄球菌时产生的S E R S信号增加了 倍.W a n g等人 制备了在多孔阳极氧化铝(AAO)纳米通道中生长的A g N P s阵列,颗粒间隙在 n m之间,通过该衬底获得各种革兰氏阴性细菌的S E R S光谱以及细菌在不 同 生 长 阶 段 的S E R S光 谱.P r e m a s i r i等 通过多步原位生长法制备了包覆S i O的金纳米颗粒,然后利用接种环将细菌悬浮液样品放在S E R S基底上得到S E R S光谱,结果表明对S E R S光谱有贡献的分子主要是:嘌呤降解的代谢物:腺嘌呤,次黄嘌呤,鸟嘌呤,尿酸和腺嘌呤核糖核苷酸(AMP).P o l i s e t t i等人 利用S E R S技术在绿脓杆菌群落中原位绘制了绿脓菌素的空间时间图,结果表明绿脓菌素的产生依赖于生长碳源和绿脓杆菌的特定菌株.S a n y a s i等人 为了解决具有多重耐药和生物膜形成能力的菌株对抗微生物疗法发展的阻碍,开发了一种平均粒径在 n m,具有较长时间稳定性的多糖包裹的A gN P s,即使在浓度远低于抗生素的最低抑制浓度(M I C)时,该A gN P s仍能抑制革兰氏阳性(枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)的生长和生物膜的形成,同时对哺乳动物的细胞毒性降低或没有.因此,一般来说,将细菌直接放置在S E R S活性表面得到对应的S E R S光谱时,纳米颗粒需要没有包覆,如果纳米颗粒被包覆,则S E R S光谱由纳米颗粒表面的涂层主导.采用通过胶体与细菌悬浮液混合获得S E R S光谱的方法时,有的学者直接将混合的悬浮液用于S E R S分析,得到S E R S光谱,而有的学者是将混合液体放在一个平面上观察,当样品干燥后得到光谱.K a h r a m a n等人 通过一种细菌对流组光散射学报第 卷400600800100012001400160018002000Raman shift(cm)-1Normalized intensity图在mm面积上收集 个随机细胞的S E R S光谱F i g S E R Ss p e c t r ao f r a n d o mc e l l sw e r ec o l l e c t e do v e ra na r e ao f mm装的S E R S技术,用A gN P s实现了样品的均匀制备,在沉积过程中细菌和纳米颗粒组装在一起,形成独特的有序结构,同时具有良好的再现性,单光谱采集只需要 s,无需进行大量的数据处理,就可以实现细菌的识别和鉴定.C h e n等人 利用近红外S E R S技术对水中致病菌进行检测,该方法的关键是细菌细胞悬液中原位合成的A gN P s,对致病菌L n n o c u a的检出限为 C F U/m L,通过加入细胞膜破坏剂T r i t o nX ,可以有选择性的区分不同细菌种类.目前用于细菌S E R S检测的基底以贵金属A g为主,获得细菌S E R S光谱的方法常用的有三种,但细菌S E R S光谱的解释是复杂的,不仅仅是多变的生理环境,细菌本身也受气候、温度、p H等多种因素影响,学者们通过形貌调控、掺杂纳米颗粒等手段使细菌的检测取得了较大的成果,同时具有S E R S活性的半导体衬底在细菌检测方面具有很大的潜力.S E R S用于病毒检测S E R S技术作为一种单分子水平上的光谱检测技术,考虑到其超高的S E R S灵敏度、无损检测、优异的重复性和稳定性而被广泛应用于环境科学、食品安全和生物传感方面.病毒是目前世界上最丰富的生物实体,比古生菌和细菌加起来还多,它不仅代表了最大、最具有遗传多样性的核酸库,同时几乎可以感染任何形式的生命,不仅如此,病毒还可以迅速进化并引起新的流行病,如人畜共患的H N 流感病毒、寨卡病毒和埃博拉疫情.目前,大约有 万种未知病毒在动物宿主中传播,其中有相当数量的病毒具有人畜共患、传播给人的潜力.因此,更好地了解循环病毒及其流行病学对于更好地防范至关重要,随着S E R S技术的不断优化,目前国内外已有大量的文献报道了运用S E R S技术成功地对呼吸道病毒、流感病毒、艾滋病毒等进行直接非标记检测和诊断,病毒的爆发和大规模传播对人类社会产生了巨大的负面影响,严 重 威 胁 了 广 大 人 民 群 众 的 生 命 安 全.年年末爆发的S A R S C o V 病毒,严重影响了社会正常运作.从S A R S C o V 病毒肆虐的严峻形势来看,对病毒快速准确的诊断不仅便于对治疗疾病采取有效的措施,而且在一定程度上提高医疗资源的利用率.Y e h等人 开发的V R I R I ON构建了A u纳米颗粒的微流体平台,用于快速、无标记捕获和S E R S检测S A R S C o V 病毒,极大的缩短了检测时间和准确度.此外,C h o o和R a y团队采用脱氧核糖核酸(D NA)和病毒刺突抗体作 为受体,对S A R S C o V 病毒实现了超灵敏的定量S E R S检测,二者的L O D可以分别达到 P F U/m L和 C o p i e s/m L,同时极大的缩短了检测时间.Z a v y a l o v a等人 基于用胶体S E R S直接组装S E R S适体传感器方案,提出一种简单(一步)、快速(m i n)的检测方案,该方案对S A R S C o V 具有较高灵敏 度 和 特 异 性,L O D ,T C I D /m L.Y a n g等人 提出了一种人类血管紧张素转换酶(A C E)功能化的金病毒陷阱的纳米结构,该结构可以对污染水中的S A R S C o V 病毒进行捕捉和快速检测,检测限低至单病毒水平,这得益于A C E 与S蛋白高亲和力的 倍病毒富集和由斜金纳米针组成的病毒陷阱,以及多组分 的S E R S信号的增强,从而实现对污染水 c o p i e s/m L的低检测限,检测时间短至m i n.大量的研究已经表明S E R S技术在病毒检测领域显现出了优异的性能,但采用的S E R S衬底以贵金属为主,贵金属具有特有的等离子体共振效应使获得的S E R S增强因子可达到 ,但贵金属本身制备成本高、易氧化、易团聚、信号再现性低以及差的生物相容性,这就使得在生物传感器领域,急需一种既具有贵金属的优良增强性能,同时有优异的生物相容性、光谱稳定性和重现性,故应用于生物分子检测的S E R S衬底迅速从贵金属扩展到半导体材料.Z h a n g等人 采用新型的油/水/油三相液液界面自组装方法制备S E R S免疫底物,形成了两第期张伟达:表面增强拉曼散射检测细菌及病原体的研究现状及展望层致密的金纳米颗粒薄膜,通过这种方法设计的生物传感器能够在磷酸盐缓冲盐水中检测到浓度为 f g/m L的S A R S C o V 刺突蛋白,在未处理的唾液中检测到浓度为 f g/m L,对S A R S C o V 病毒具有良好的特异性和敏感性.K u k u s h k i n等人 利用双标记D NA适体作为识别元件,结合S E R S方法检测S A R S C o V 病毒,可以在 C o p i e s/m L下识别S A R S C o V 病毒,其灵敏度可以与现有的诊断金标准 逆转录聚合酶链反应相媲美.L e o n g等人 设计了一种手持式S E R S呼吸分析仪,可以在m i n之内识别C O V I D 感染者,名参与者无论表现出何种症状,其灵敏度和特异性均达到.M o u s a v i等人 为了识别新型S A R S C o V 冠状病毒的不同亚型,采用柔性S E R S 底物策略,根据新型S A R S C o V 病毒,通过检测刺突蛋白受体的结合域,使用柔性S E R S底物以及多元统计分析对其进行了量化.S e r e b r e n n i k o v等人 开发了新型冠状病毒肺炎病原特异性抗原 尖刺受体结合结构域修饰的测流免疫分析(L F I A),并对其进行了表征,这种改进的L F I A包括使用金纳米颗粒与固定抗体和 巯 基 苯 甲 酸 作 为 表 面 增 强 拉 曼 散 射(S E R S)纳米标签,并通过S E R S光谱对纳米标签结合进行配位,该方法的检出限低至 n g/m L,检测时间短至 m i n.Z h a n g等人 首次将水热法合成的锑掺杂氧化锡纳米颗粒用于S E R S衬底,发现 MB A探针分子与AT ON P s底物之间存在的电荷转移,这对S E R S起到了化学增强的作用,增强效果由AT O N P s中S b离子的掺杂比例决定,的S b掺杂比例AT ON P s表现出最小的光学带隙能量和最强的S E R S增强,该研究进一步扩大了S E R S的应用领域.然而,这与电磁增强主导的贵金属得到的S E R S光谱相比,半导体衬底的S E R S增强效果还是相对较弱,这是因为大部分蛋白分子或病毒颗粒的分子量很大,电荷转移起主要作用的半导体衬底无法显著增强整个生物大分子的化学键振动,因此提高半导体彻底灵敏度以满足生物大分子的检测是研究的重点.杨莉莉等人 通过水热法合成了一种具有S E R S活性的新型T aO半导体衬底,采用MV分子作为染料分子,并通过能带工程即掺杂来优化半导体材料的S E R S性能,通过优化M o元素的掺杂量使T aO半导体衬底的增强因子达到 ,这是在 n m的激光激发下实现MV分子共振、MV分子和T aO纳米棒之间的光致电荷转移共振、各向异性T aO纳米棒“间隙”和“尖端”周围的电磁增强的协同共振导致的.P e n g等人 开发了一个具有“纳 米 峡 谷”形 态 的 分 层 纳 米 结 构 的 球 形S n S,该结构作为半导体基S E R S衬底,将毛细管效应引起的分子富集、晶格应变和硫空位协同促进电荷转移使化学增强显著,从而提高检测限.G r i b a n y o v等人 以甲流病毒为例开发了一种基于S E R S的流感病毒定量检测的胶体适体传感器,将流感血凝素适体提供的特异性和S E R S技术的敏感性结合起来,同时采用制备简单、稳定性高的A g纳米颗粒,可以实现流感病毒的快速检测(分钟之内),该传感器的L O D为 V P/m L,动态范围为 V P/m L,其拉曼强度和 流 感 浓 度 的 线 性 关 系 如 图中(a)所 示.W a n g等 人 利 用 基 于S E R S的 免 疫 磁 珠 对H N 流 感 病 毒 进 行 特 异 性 检 测,H N 强 的S E R S信号可以最终通过作为S E R S基底的纳米银的原位还原从而实现灵敏性检测,当H N 型流感病毒稀释到 ,C I D T /m L,如图中b所示当H N 流感病毒降低时,拉曼峰高度降低,c m处拉曼峰高度呈线性依赖关系(R ).Y a n g等人 制备T i O纳米线作为一种绿色敏感柔性半导体S E R S衬底,采用R G作为探针分子 通 过 氢 化 处 理 发 现 可 以 将 半 导 体T i O的S E R S性能至少提高个数量级,研究发现,当氢化处理的时间为h后,增强因子(E F)为 ,这与A g基底的作用效果相当.除此之外,对R G分子进行 次循环检测和降解后,底物仍然可以保持再生和显著的S E R S活性,氢化处理在提高S E R S性能的同时,还给T i O纳米线衬底带来了自清洁功能.Z e n g i n团队 开发了一种用于检测具有代表性的乙型肝炎病毒(H B V)D NA序列的S E R S生物传感器,游离的A u纳米颗粒表面上被吲 哚 绿 标 记 的D NA报 道 分 子 链 通 过H B VD NA靶标的连接杂化硅基底上的D NA捕获链,从而形成一种灵敏的生物传感器,杂化硅衬底上游离的A u N P s与A u N P s之间的耦合产生了强烈的空间分布电磁场,故该生物传感器可用于成功区分和检测H B VD NA靶标,检测限可达到 M.考虑到人体的成长体温在 附近,大于室温,温度的升高导致A u纳米颗粒的聚集从而产生了更强的空间电磁场,使得该芯片的检测光散射学报第 卷2500020000150001000050000I585,a.u.105106107Virus,VP/mLInfluenzaAvirusInfluenza B virusAllntoic fluid30002700240021001800150012009006003000Intensity(counts)-6-4-202468LogTCID50/ml10R2=0.9566(a)(b)图(a)拉曼强度和流感浓度的线性关系;(b)拉曼强度与H N 流感病毒浓度之间的线性关系F i g (a)L i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nR a m a n i n t e n s i t ya n d i n f l u e n z a c o n c e n t r a t i o n;(b)L i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nR a m a n i n t e n s i t ya n dH N i n f l u e n z av i r u sc o n c e n t r a t i o n400800120016002000Wavenumber/cm-1Raman intensityT=37T=25图从芯片/乙型肝炎病毒D NA/金纳米颗粒结构在 和 的表面增强拉曼散射光谱F i g S u r f a c e e n h a n c e d R a m a ns c a t t e r i n gs p e c t r af r o mt h ec h i p/H B VD NA/g o l dn a n o p a r t i c l es t r u c t u r ea t a n d(H B VD NAt a r g e t c o n c e n t r a t i o n:p M)限对得到了进一步的改善,达到了 M,两种温度下的S E R S光谱图如图所示.该研究成果有望被扩展到其他无标记的蛋白质、病毒和爆炸物的超灵敏的选择性检测.目前,能够用于实际检测的S E R S基底大多都是A u、A g等贵金属,由于贵金属中存在的等离子体共振主导的电磁增强,使其具有较大的增强因子,已达到 M以至于更低的检测限,而目前半导体衬底也迅速发展,各种具有S E R S活性的新型半导体衬底材料层出不穷,通过掺杂其它元素、调整纳米结构的形貌、氢化处理等手段,来调控半导体衬底的增强因子,但是目前半导体衬底面对着检测限普遍低于 M的检测瓶颈,这难以满足S E R S生物传感器在实际检测中的灵敏度需求的问题,目前我们迫切的需要在半导体基衬底中实现超高的可媲美贵金属衬底的S E R S灵敏度.S E R S技术与其它技术的联用 基于S E R S的微流控器件微流控芯片分析技术是使用微管道(尺寸数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所设计的科学和技术,使用微流控芯片技术不仅可以将样品预处理、分离、检测等基本的操作单元集成在一起,而且可以将其与其它各种检测技术结合在一起,从而实现对生物样品的高通量检测,该技术在病原体检测中具有巨大的优势和潜力.考虑到S E R S技术优异的灵敏性、特异性和重复性,我们将S E R S技术的分析模块集成在微流控芯片上,实现了S E R S技术与微流控技术的联用.检测时,用接种环将含有病原体的生物样品引入到微流控芯片集成的纳米结构S E R S检测微区,这样可以直接获得原位检测和生物信息,此外,在微流体通道中产生的均匀混合条件已被证明有助于S E R S定量分析,因此两者的结合也实现了高灵敏度和可重复性的理想机制环境.该集成系统还具有功耗低、检测速度快等优点,这为病原体的高效检测提供了新思路.目前,基于S E R S的微流控器件被应用在许多领域,如材料科学、分析化学、医疗分析和诊断等,相关技术的突破和S E R S技术分析平台的研发,对提高病原体检测的速度和准确性是至关重要的.近年来,基于S E R S的微流控器件在病原体的检测方面表现出广泛的适用性.第期张伟达:表面增强拉曼散射检测细菌及病原体的研究现状及展望S E R S本身具有高灵敏性的特点.而微流控技术可以在一定程度上缩小检测样品的体积,实现自动检测样品以达到两种技术更好的融合,因此,集成两种技术优点的仪器在病原体检测方面有很好的应用前景.H e等人 设计了一种基于S E R S的便携式微流控生物传感器,在现场传感方面显示出了巨大的潜力.C h o i等人 基于S E R S设计了一个用于鼠疫耶尔森氏菌特异性抗原分数自动免疫分析集成的微滴平台,该平台通过连续的液滴生成、运输和合并实现高效快速的免疫反应,液滴分裂实现免洗免疫检测.该设备能够为n L体积的液滴中进行复杂的多步骤免疫分析提供了一个多功能平台,该平台对鼠疫耶尔森氏菌F 抗原的检测限为 p g/m L,与传统的酶联免疫吸附法的灵敏度高两个数量级,样品用量更少 L,实现完全自动化的快速检测(m i n).W a n g等人 为了检测人血清中的禽流感病毒,提出了一种基于S E R S的数字微流体检测平台(DMF),设计了夹心免疫分析方法即抗体包被的磁珠作为固体载体去捕获样本中的抗原,形成磁珠抗体抗原的免疫复合物,采用 MB A标记免疫复合物,可以实现对目标抗原的特异性超敏检测.使用DMF设计工作时,需要对电极施加简单的阵列组合,从而达到独立驱动液滴的效果,实现原有的输送和均匀分配,它对多步骤的免疫分析具有低消耗、高自动化的优势,与标准E L I S A方法相比如图所示,MD F S E R S检测限可以达到 p g/m L,检测时间控制在h,试剂消耗只有大约 m L.图DMF S E R S法检测人血清H N 的校准曲线F i g C a l i b r a t i o nc u r v e f o r d e t e c t i o no fH N i nh u m a ns e r u mb yDMF S E R SK a m i n n s k a等人 将紫红素(F C)标记的免疫金纳米花与固定在S E R S活性底物(A u A g包覆G a N)上的抗原和抗体形成三明治结构,用于检测人血浆中乙型肝炎病毒抗原(H B s A g),乙型肝炎病毒抗原的最低检出限为 I U/m L,该方法的平均相对标准偏差(R S D)小于.目前,几乎所有的定量分析都要准备浓度梯度的目标试剂,重复液体转移会消耗大量的时间,制备不同浓度的试剂也会有实验误差,为了克服这个问题,J e o n等人 开发了一种基于S E R S的梯度液滴系统,利用微流控浓度梯度发生器实现了对试剂的连续稀释.不仅如此,X i a o等人 基于S E R S开发了一种便携式自动化的L F I A阅读器和集成的多通道L F I A反应柱,对甲胎蛋白和癌胚抗原的生物标记分子进行检测,L O D达到 n g/m L.C R I S P R系统与S E R S技术的联用簇 状 规 则 间 隔 短 回 文 重 复(C R I S P R)和C R I S P R相关蛋白(C a s)是一类细菌编码、R NA引导、可编程的D NA靶向和切割系统,C R I S P R C a s系统作为一种新型的诊断工具,具有特异性识别基因组的功能,它是一种由R NA介导的核酸内切酶.当目标D NA存在时,就激发其反式裂解活性,可以特异性的切割目标.C a s a是报道的第一个V型C R I S P R/C a s系统,现在已经有学者将其应用于检测体内病毒R NA等核酸靶点.考虑到C R I S P R/C a s系统在分子诊断具有的潜力和应用,但在使用过程中往往需要聚合酶链反应(P C R)和核酸扩增技术的配合,而且采用扩增技术会使实验结果出现假阳性的结果,故将其与S E R S技术结合,实现直接使用基因组D NA,不需要复杂的纯化和扩增步骤,就可以实现对病原体的灵敏检测.Z h u a n g等人 实现基于重组酶聚合酶扩增(R P A)集成的微流控纸基分析装置(P A D),提出了R P A C a s a P A D用于牛奶和肉类样品的伤寒沙门氏菌的超灵敏S E R S检测,可实现伤寒沙门氏菌 C F U/m L的检出限,动态检测范围可达到 C F U/m L,同时检测时间缩短到 m i n左右.P a n等人 开发了一个超灵敏C R I S P R/C a s a驱动的S E R S生物传感器用于羊奶的真实性检测,用普鲁士蓝(P B)修饰S S D NA形成探针,并固定在微孔板上,在目标D NA