YAP-shRNA载体构建及其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响.pdf

载体构建及其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响韩高扬，李小丽，王瑞娟，韩玉杰，张仁锋，魏创业，孔晓煌，连欢欢，王金龙（郑州大学附属郑州中心医院 胸外科，河南 郑州 ；郑州大学第一附属医院 肿瘤科，河南 郑州 ）基金项目：河南省医学科技攻关计划（联合共建）基金资助项目（）通信作者：王金龙：摘要：目的评价 相关蛋白（）在食管鳞癌（）中的表达及其临床意义，并研究 对食管癌细胞系生物学行为的影响。方法运用免疫组化检测 在食管鳞癌组织和正常组织中的表达情况。设计 质粒并转染食管癌细胞系（和 ），运用 和蛋白质印迹检测细胞系中 的表达情况。小室和 检测转染前后细胞系的侵袭和增殖能力。结果 在食管鳞癌组织中高表达，且食管鳞癌 阳性的患者生存期明显缩短。和蛋白质印迹显示细胞转染成功且可挑选出转染效率最优的质粒。小室和 检测到转染后的细胞系的侵袭和增殖能力下降。结论食管癌组织中 高表达，且 阳性的患者生存期明显缩短，抑制 表达将减弱食管癌细胞系的侵袭和增殖能力。关键词：食管癌；相关蛋白；转染；生存期中图分类号：，（，；，）：（）（），（），：；食管癌（，）是造成死亡的第六大癌症 ，全球总发病率的 左右发生在发展中国家，中国占全球 病例的 以上，每年约 万例 。尽管手术切除、辅助放化疗和免疫治疗等措施有所进展，但食管鳞癌（，）的 生存率仍然很低 。传统的治疗方法还远远不能令人满意。与大多数其他癌症一样，的发展是复杂的，其发生机制尚未完全阐明。信号传导通路最初是以果蝇 样激酶 而命名的通路。通路主要的生物学效应包括控制细胞的分化、调节细胞增殖凋亡平衡、维持细胞的接触性抑制及参与肿瘤的发生 。信号通路故障，动态平衡被破坏，会导致细胞增殖异常，甚至肿瘤的发生 。在 信号传导通路中寻找新靶点，在分子水平、细胞水平、动物实验和临床试验等方面研究治疗恶性肿瘤的方法，已成为现在研究 信号传导通路的主要方向。其中 相关蛋白（，）是 信号传导通路下游的河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，关键效应分子，在人体内，通路参与细胞增殖的负调控，磷酸化后是抑制转录的关键因子，但有些研究表明 是一个癌基因，可促使正常细胞向恶性肿瘤细胞分化。因此本实验通过研究 在 中的表达情况，并构建 来了解其对食管鳞癌细胞系生物学行为的影响，以期找到食管癌治疗的新靶点。对象与方法 研究对象选取 年 月至 年 月在郑州大学第一附属医院胸外科接受食管癌根治术且病史资料完整的 例食管鳞癌组织标本，同时取正常食管组织（距恶性肿瘤 ）。患者术前无放疗、化疗和免疫治疗史，所有患者均自确诊之日起进行随访，直至 年月 日或患者死亡，其中 例患者随访失联，此项研究得到了郑州大学第一附属医院医学伦理委员会的支持。按 年国际抗癌联盟最新的食管癌 分期（第 版）进行分期 。由 名不知此研究内容的病理科医生共同判定病理切片免疫组化评分。免疫组化结果判定采用半定量法，结合染色强度和染色范围评判 表达结果。根据病理切片染色的强度和染色阳性细胞占总细胞的比率进行评分。染色强度：阴性（强度和阴性对照类似）为 分；弱阳性（淡黄色）为分；阳性（黄色）为分；强阳性（棕黄色）为分。染色阳性细胞占比：阳性细胞数 为 分，为 分，为 分，为 分，为 分。结合染色强度与染色阳性细胞占比的乘积进行综合判定：分为阴性（），分为弱阳性（），分为阳性（），分为强阳性（）。细胞培养人食管鳞状细胞系 和 （购自中国科学院上海细胞库）在含有 （体积分数）胎牛血清的 （，）中培养。培养温度为 ，二氧化碳体积分数为 。细胞在转染前 接种在六孔板中。质粒与转染针对不同的靶序列（表 ），设计了 种用于 敲除的 质粒：（）、（）、（）、（）和 （）的阴性对照质粒。使用 转染试剂（德国希尔登 ）将质粒转染到相应细胞中。后采用 检测各组 表达情况，后采用蛋白质印迹检测各组 蛋白表达情况，以评估 种质粒的有效性，从而为后续实验选择最佳质粒。表 种不同的靶序列质粒名称靶序列 检测 后利用 （，加利福尼亚州卡斯巴德）试剂从细胞中提取 。按逆转录试剂盒说明书（美国赛默飞世尔科学公司）对每个 样本（）进行逆转录合成 合成。然后利用 检测 基因表达量。以管家基因 作为内参，引物序列和 引物序列如（表 ）所示。每组设 个复孔，以 作为参照，计算 均值，应用相对定量法 进行定量分析。表 引物序列和 引物序列靶基因上游引物下游引物 蛋白质印迹检测各组 蛋白表达情况 后提取蛋白，采用紫外分光光度计测提取蛋白的水平，配制分离胶，水封，加浓缩胶，跑胶，电泳转膜，封闭，加入一抗（），在 冰箱内过夜孵育，用 液 洗 膜 遍，然 后 再 加 入 稀 释 的 二 抗（）进行孵育，用 液洗涤 遍，最后加荧光显影剂显影。小室检测侵袭能力用 和 转染 和 细胞系，并进行培养。后先用胰蛋白酶分离细胞，再用 洗涤，培养在无血清培养液中。在下室中加入 的含血清的培养液，稀释肿瘤细胞悬液至每毫升 个，并吸取 细胞悬液加入上室中。在 、的培养箱中培养 。用棉签擦去滤膜上方未穿出的肿瘤细胞，滤膜用 多聚甲醛固定，时间约 ，用结晶紫染色，切下的膜固封在载玻片上，在倒置显微镜下计膜背面的细胞数，计四周和中间的 个视野，然后计算出平均值。检测增殖能力用 和 转染 和河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，细胞系，把细胞的水平调整为每毫升 个，调整好的细胞悬液按照每孔 的上样量加到 孔板内，每组细胞 个复孔。在 、的培养箱中培养，分别在 、在每孔细胞的悬液中加入 的 溶液，然后继续在培养箱中孵育。后从培养箱中取出 孔板，用酶标仪在 处测定各组的吸光度，记录每组 孔的数值，并取平均值。统计学方法采用 统计软件进行统计分析，运用 检验进行统计分析，并以 回归模型行多因素预后分析，检验水准 。结果 免疫组化结果 蛋白在食管正常组织中染色呈淡黄色，染色部位主要集中于细胞核，少数为细胞质，染色阳性率为 ，蛋白在食管鳞癌组织中染色呈棕黄色，在大部分细胞核和细胞质中均染色，阳性率为 （图 ）。通过分析，发现 蛋白在食管鳞癌组织中的表达与正常食管组织中表达差异具有统计学意义（），不同年龄、性别、分化程度、肿瘤大小患者的 蛋白表达比较差异无统计学意义（），但淋巴结转移有统计学意义（）（表）。通过随访发现食管鳞癌 阳性的患者生存期缩短（图）。和 为 在正常食管组织的细胞核和细胞质中呈阴性表达；和 为 在食管鳞癌细胞核和细胞质中呈阴性表达；和 为 在食管鳞癌细胞核和细胞质中阳性表达；、放大倍数为 ，、放大倍数为 。图 蛋白 染色表 表达与食管鳞癌临床病理因素分析（）项目患者数量 阴性 阳性年龄 岁 性别女 男 分化程度高 中 低 分期 、分期 、注：为 相关蛋白。图 食管鳞癌患者的生存曲线 质粒对 基因表达的影响本研究设计了 种不同 （、），经过转染 和 细胞系，运用 和蛋白质印迹来检测 在该细胞中的表达情况（图 ），检测可见经 和 转染的 和 细胞，表达较低，且 优于 ，从而挑选出 为最有效质粒，并培养经 转染的 和 细胞系做下一步实验。河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，为 检测 在 和 中的表达；为蛋白质印迹检测 在 和 中的表达（，）。图 经 转染后食管癌细胞中 的表达情况 的沉默对肿瘤细胞侵袭和增殖能力的影响采用 小室实验来检验转染前后肿瘤细胞的侵袭能力，通过计算 和 组在 小室中 后的穿膜细胞数，可以看到 组穿膜的细胞数明显减少（图 ），差异具有统计学意义（）（图 ），提示 基因的沉默能够抑制 和 的侵袭能力。采用 实验来检验转染前后肿瘤细胞的增殖能力，用酶标仪在 处测定各组的吸光度，记录每组 孔的数值，并取均值。通过绘制生长曲线显示 组的增殖数明显下降，差异具有统计学意义（）（图 ），提示了 基因的沉默能够抑制 和 的增殖能力。图 小室的穿膜细胞图 小室的穿膜细胞数图 细胞系的生长曲线 讨论 在多种恶性肿瘤中高表达已被证实 ，然而关于 的表达与食管鳞癌的临床病理因素之间的关系及对食管癌细胞系生物学行为的影响却少有报道。在此次研究中，通过对食管鳞癌临床病理因素的分析，证实 在食管鳞癌组织中高表达与淋巴结转移密切相关，且 高表达的食管鳞癌患者的生存时间缩短，通过 转染 和 细胞系使其 表达降低，转染后的 和 细胞系通过 小室实验和 实验证实其侵袭和增殖能力降低。信号传导通路的异常可导致恶性肿瘤发生，因而被广泛关注。是位于染色体 上的候选癌基因 ，在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织中呈高表达，且其表达位于细胞核和细胞质 。一项纳入 例肝癌组织标本的研究河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，显示，的表达与 水平呈正相关，并且是影响肝癌患者生存期的独立预后因素 。对 例食管鳞癌组织进行了免疫组化研究，研究发现其中 的食管鳞癌组织的细胞核和细胞质中表达 ，且与正常食管组织表达差异有统计学意义，虽然不同年龄、性别、分化程度、肿瘤大小患者的 表达差异无统计学意义，但 的表达差异与淋巴结转移相关。结果表明，是在食管鳞癌中高表达的癌蛋白，且与食管鳞癌的不良预后相关。信号传导通路可调节细胞增殖和凋亡，使内环境处于动态平衡的状态，而 是 信号传导通路下游的关键效应分子。作为候选癌基因，已被证实是调节器官大小和细胞增殖的因子 。转基因小鼠肝脏中 的过度表达可将肝脏质量从体重的 增至约 ，并最终导致肿瘤的发生 。肝癌中 表达的降低可使肿瘤细胞的迁移能力降低，期细胞数量显著增加 。为了了解 对 生物学行为的影响，本研究沉默了 细胞系中的 。转染 和 细胞系后，和 蛋白表达水平低于对照组，并且侵袭和增殖能力降低，与以上结果基本一致。小结 作为一种癌蛋白在食管鳞癌中高表达，并且可以增加癌细胞的侵袭和增殖能力。此外 的高表达可导致食管鳞癌患者的生存率降低，因此 可成为未来食管癌治疗的新靶点。但 在食管鳞癌中的分子机制及功能还需要进一步努力阐明。参考文献 陈茹，郑荣寿，张思维，等 年中国食管癌发病和死亡情况分析 中华预防医学杂志，（）：国家卫生健康委员会 食管癌诊疗规范（年版）中华消化病与影像杂志（电子版），（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：?，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，