BcMid1蛋白原核表达及其与绿原酸的作用.pdf

第 卷 第期 年月合 肥 工 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)J OUR NA LO FHE F E IUN I V E R S I T YO FT E C HN O L O G Y(NA TUR A LS C I E N C E)V o l N o J u l 收稿日期:;修回日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目()作者简介:马志桃(),女,山西晋中人,合肥工业大学硕士生;张丹凤(),女,安徽安庆人,博士,合肥工业大学副教授,硕士生导师,通信作者,E m a i l:z h a n g d a n f e n g h f u t e d u c n;叶应旺(),男,安徽望江人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师D O I:/j i s s n B c M i d 蛋白原核表达及其与绿原酸的作用马志桃,胡婷婷,张丹凤,叶应旺(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 )摘要:M i d 蛋白是真菌钙通道蛋白,在维持细胞钙稳态方面发挥着重要作用.文章为探讨绿原酸对灰霉(B o t r y t i s c i n e r e a)生长的抑制与钙之间的关系,利用平板实验观察绿原酸存在条件下外源钙离子对灰霉生长的影响,并构建B c M i d 原核表达载体,在大肠杆菌R o s e t t a菌株中诱导B c M i d 蛋白表达,利用绿原酸的荧光特性探究B c M i d 蛋白与绿原酸的体外结合情况.结果显示,钙离子可以降低绿原酸对灰霉的生长抑制.成功构建的p E T a B c M i d重组载体可以在R o s e t t a菌株中表达B c M i d 蛋白,S D S P A G E和荧光定量检测发现绿原酸和B c M i d 蛋白可以结合,结合常数为 m o l/L.结果表明,绿原酸对灰霉的抑制与钙摄入相关,并且B c M i d 蛋白是绿原酸的潜在作用靶点.该文为进一步研究绿原酸对灰霉的抑制机理奠定了基础.关键词:灰霉;M i d基因;绿原酸;原核表达;荧光中图分类号:Q 文献标志码:A文章编号:()P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fB c M i d a n d i t s i n t e r a c t i o nw i t hc h l o r o g e n i ca c i dMAZ h i t a o,HUT i n g t i n g,Z HANGD a n f e n g,Y EY i n g w a n g(S c h o o l o fF o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g,H e f e iU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,H e f e i ,C h i n a)A b s t r a c t:M i d p r o t e i n i s a f u n g a l c a l c i u mc h a n n e l p r o t e i n t h a t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i nm a i n t a i n i n gc e l l u l a rc a l c i u m(C a)h o m e o s t a s i s T os t u d y t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e i n h i b i t o r ye f f e c t o f c h l o r o g e n i c a c i do n t h eg r o w t ho fB o t r y t i s c i n e r e aa n dC a,ap l a t e i n h i b i t i o ne x p e r i m e n tw a s a p p l i e d t oo b s e r v i n g t h e e f f e c t s o f e x o g e n o u sC ao nBc i n e r e ag r o w t hw i t ht h ep r e s e n c eo f c h l o r o g e n i ca c i d AB c M i d p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rw a s c o n s t r u c t e da n d t h eB c M i d p r o t e i nw a s e x p r e s s e d i nEc o l iR o s e t t a T h e f l u o r e s c e n c e c h a r a c t e r i s t i c so f c h l o r o g e n i c a c i dw e r eu s e d t o i n v e s t i g a t e t h ei nv i t r ob i n d i n go fB c M i d p r o t e i nt oc h l o r o g e n i ca c i d T h e r e s u l t s s h o w e d t h a tC ac o u l d r e d u c e t h e i n h i b i t i o no f c h l o r o g e n i c a c i do n t h e g r o w t ho fBc i n e r e a T h ep E T a B c M i dr e c o m b i n a n tv e c t o rw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n dB c M i d p r o t e i nw a se x p r e s s e di nR o s e t t a s t r a i n S D S P A G Ea n df l u o r e s c e n c eq u a n t i f i c a t i o ns h o w e dt h a t c h l o r o g e n i ca c i da n dB c M i d p r o t e i nc o u l db i n d,a n d t h e i r b i n d i n g a f f i n i t yw a s m o l/L T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e i n h i b i t i o no f c h l o r o g e n i ca c i do nBc i n e r e ai s a s s o c i a t e dw i t hC ai n f l u xo fBc i n e r e ac e l l s,a n dB c M i d p r o t e i n i s ap o t e n t i a lt a r g e t o f c h l o r o g e n i c a c i d I t l a y saf o u n d a t i o nf o r f u r t h e rs t u d yo f t h ea n t i f u n g a lm e c h a n i s mo f c h l o r o g e n i ca c i do nBc i n e r e aK e yw o r d s:B o t r y t i s c i n e r e a;M i dg e n e;c h l o r o g e n i ca c i d;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;f l u o r e s c e n c e灰霉(B o t r y t i s c i n e r e a)是一种重要的植物病原真菌,其寄主有 种,包括多种重要粮食和经济作物.该病原菌具有广泛的遗传变异性和适应性,在寒冷、干旱、饥饿等条件下可产生菌核以提高对不良环境压力的抗性,因此十分难以控制.绿原酸又称 o 咖啡基奎宁酸,在植物中广泛存在,具有调节人体糖代谢和脂代谢、诱导减肥、降血压、消炎、抗氧化等多种健康益处,用于采后保鲜可延长水果货架期.绿原酸还有广谱抗菌活性,具有作为生物杀菌剂的潜力.据报道绿原酸可上调拟茎点霉钙转运蛋白相关基因的表达.本课题组之前的研究发现,绿原酸可引起真菌内质网应激,使内质网的钙离子释放到细胞质,破坏真菌细胞内钙稳态.但关于绿原酸对真菌外源钙摄入影响的相关报道较少.真菌细胞膜上C c h 和M i d 组成的钙通道,感知施加于细胞壁和质膜的多种机械压力信号,允许C a快速流入细胞质,从而激活一系列靶基因表达,以维持细胞在环境压 力下的生 长 .M i d基因缺失会导致真菌径向生长速度减慢,但在培养基中添加外源性C a C l后可缓解M i d 敲除株的生长缺陷.结合绿原酸对灰霉菌生长的抑制现象,本文推测绿原酸通过M i d 影响灰霉菌正常的钙流活动以达到抑制效果.因此,本研究在验证外源性钙可缓解绿原酸对灰霉径向生长抑制的基础上,探讨了绿原酸是否通过与M i d 蛋白互作抑制灰霉生长,为深入研究绿原酸抑制灰霉的生长机理奠定了基础.材料与方法 材料与设备 菌株与载体灰霉菌株(B o t r y t i s c i n e r e a,F J H)来自中国农业大学种子健康中心;大肠杆菌菌株DH 、R o s e t t a以及蛋白原核表达载体p E T a()均存于合肥工业大学食品与生物工程学院实验室 冰箱,该表达载体携带H i s标签.试剂绿原酸(纯度)购于北京百灵威科技有限公司;T a qD NAP o l y m e r a s e、d NT P s、苯甲基磺酰氟(PM S F)、过硫酸铵(A p s)、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)、十二烷基硫酸钠(S D S)、甘氨酸、丙烯酰胺(A c r)、四甲基乙二胺(T EME D)、硫酸卡那霉素均购于合肥博美生物科技有限责任公司;T r a n s S t a r t F a s t P f u D NA P o l y m e r a s e、Q u i c kG e lE x t r a c t i o nK i t均购于北京全式金生物技术有限公司;T i a n p r e p M i n iP l a s m i dK i t购于天根生化科技(北京)有限公司;T D NAL i g a s e、限制性内切酶(N d e、X h o)购于N e wE n g l a n dB i o l a b s;D NA M a r k e r(/b p)、异丙基D 硫代半乳糖苷(I P T G)、M a g B e a d sH i s T a g蛋白纯化磁珠、P E G 均购于生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白M a r k e r购于T h e r m o s c i e n t i f i c;H i s T a g(D I )X PR a b b i tmA b购于C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y;G o a t A n t i R a b b i tI g G购于博士德生物.仪器设备霉菌培养箱购于上海博讯实业有限公司医疗厂;立式高压蒸汽灭菌锅购于上海申安医疗器械厂;台式高速冷冻离心机购于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;超声波破碎仪购于江苏海思睿智能科技有限公司;聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,P C R)扩增仪、蛋白小垂直板电泳槽、电泳仪电源均购于美国B I O R A O;化学发光凝胶成像系统购于上海天能科技有限公司;L A S m i n i分子影像仪购于日本C y t i v a;L S 荧光分光光度计购于美国P e r k i nE l m e r公司.实验方法 C a对灰霉菌丝生长的影响用直径为mm的无菌打孔器取d左右菌龄的灰霉菌饼,分别接种于直径为 mm的含g/L绿原酸的察氏(C D)培养基、添加 mm o l/LC a C l的C D培养皿中心,倒置于 霉菌培养箱中培养,观察菌落直径及生长状态.以不含绿原酸的C D培养基作为对照,每个处理进行个重复,整个实验重复次.基因克隆在N C B I数据库下载B c M i d目的基因登录号,利用P r i m e rP r e m i e r 软件设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.引物序列()如下:F:C AT AT G C C T C T G C C AAAA C T C AG T C C,R:C T C GAG T C AGAT G C C G C T C AA C AT GA.以灰霉c D NA为模板,用高保真酶(P f u酶)进行P C R扩增,退火温度为,得到目的基因片段.重组质粒的构建)双酶切.将P C R产物与蛋白表达载体p E T a分别用限制性核酸内切酶N d e、X h o进行双酶切,酶切h,经琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收.)连接.酶切后的胶回收产物用T 连接酶 过夜连接.)转化.连接产物转到大肠杆菌DH 感受态中,涂布在含 g/m L硫酸卡那霉素的L B第期马志桃,等:B c M i d 蛋白原核表达及其与绿原酸的作用培养基上过夜培养.)鉴定.挑取长势良好的单克隆菌株摇菌,菌落P C R鉴定,取与阳性对照条带一致的菌液提取质粒双酶切验证是否可切开,若能切开则送菌液测序.目的蛋白的原核表达及纯化)将构建好的重组质粒p E T a B c M i d转入大肠杆菌R o s e t t a感受态中,选取阳性菌株扩大培养后,加入 mm o l/L异丙基 D 硫代半乳糖苷(I P T G)诱导剂,诱导 h,离心收集菌体.)用p H值为 的P B S重悬菌体,加入终浓度为 mm o l/L的P M S F、m g/m L的溶菌酶,静置 m i n,超声破碎,离心收集上清,获得粗蛋白提取液,S D S P A G E检测目的蛋白表达情况.)将粗蛋白提取液与H i s标签蛋白纯化磁珠孵育h,使目的蛋白与磁珠充分结合,随后用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液从低到高梯度洗脱蛋白,收集得到纯度较高的B c M i d 蛋白.之后用透析袋在 透析 h以除去目的蛋白中的咪唑.)将得到的B c M i d 目的蛋白用W e s t e r nB l o t鉴定.B c M i d 蛋白经S D S P AG E凝胶电泳后,转到P V D F膜上,膜依次用的脱脂牛奶室温封闭h,H i s标签兔抗室温孵育h,T B S T清洗次,HR P标记的羊抗兔I g G抗体室温孵育h,T B S T清洗次,随后用现配的曝光液浸湿膜,在提前预冷的分子影像仪上曝光.目的蛋白与绿原酸的体外相互作用将B c M i d 蛋白与mm o l/L绿原酸 、r/m i n避光孵育h,制备份完全相同的蛋白胶进行S D S P AG E凝胶电泳.一份经考马斯亮蓝R 染色后 醋酸脱色观察B c M i d 蛋白条带位置;另一份直接经荧光凝胶成像系统观察荧光位置.对比观察蛋白条带位置是否与荧光位置重合.参考文献 用荧光分光光度计进行绿原 酸 荧 光 测 量.将 绿 原 酸 浓 度 固 定 在 m o l/L,室温下向含绿原酸的水溶液中依次等量滴加B c M i d 蛋白,混匀后检测 m o l/L范围内的B c M i d 蛋白随浓度升高对绿原酸荧光强度的影响.并且以B c M i d 蛋白浓度为横坐标,绿原酸荧光强度为纵坐标绘制散点图,观察两者的 关 系.其 中 激 发 波 长 n m,发 射 波 长 n m,激发和发射的狭缝宽度为 n m.参考文献 ,根据S t e r n V o l m e re q u a t i o n计算绿原酸与B c M i d 蛋白的结合常数Ka,即FFFKac,其中:F、F分别为绿原酸中加入B c M i d 蛋白前后的荧光强度;c为B c M i d 蛋白浓度;Ka为两者的结合常数.结果与分析 C a对灰霉菌落扩展的影响利用C D培养基对灰霉进行钙饥饿培养,探讨C a对灰霉菌落生长的影响,结果如图所示.个培养基分别为C D(培养基)、含g/L绿原酸 的C D(培 养 基)、含g/L绿 原 酸 和 mm o l/LC a C l的C D(培养基).培养d后,与对照组相比,添加绿原酸后菌落直径降低 ,而在绿原酸存在条件下添加C a后灰霉菌落直径降低 ,说明在察氏培养基中添加C a可降低绿原酸对灰霉的抑菌作用(P ),表明绿原酸对灰霉的抑制与C a相关.图C a对灰霉菌落扩展的影响 p E T a B c M i d重组质粒的构建以灰霉c D NA为模板,扩增B c M i d基因片段,结果如图 a所示.图中,M为D NA M a r k e r,泳道为P C R产物.由图可知,得到与预期大小(b p)一致的特异性条带,由此判断已扩增出B c M i d目的基因片段.B c M i d基因扩增产物与p E T a表达空载经双酶切、胶回收后,连接产物转化于Ec o i lDH 过夜培养,观察到平板上的单克隆菌株圆润饱满,生长状态良合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷好.菌落P C R鉴定结果如图 b所示,、号单克隆菌液与号阳性对照大小一致,号为阴性对照,说明这株菌为潜在阳性菌株.将上述号和号菌株扩大培养提取质粒,进行 L体系酶切验证,结果如图 c所示.图 c中:M为D NA M a r k e r;泳道和泳道分别为号菌液的质粒、酶切产物;泳道和泳道分别为号菌液的质粒、双酶切产物.结果显示,提取的个质粒均可酶切成个条带,且条带大小与p E T a空 载(b p)、B c M i d基 因(b p)大小一致,表明目的基因片段成功连上载体.图重组质粒的构建选号菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果显示基因序列正确,表明重组质粒构建成功.B c M i d 蛋白在R o s e t t a菌株中的原核表达Ec o i lR o s e t t a是表达型菌株,将重组质粒p E T a B c M i d转入其中,在I P T G诱导下可大量表达目的蛋白.N i NT A琼脂糖珠可纯化携带H i s标签的B c M i d 蛋白,经咪唑梯度洗脱获得纯度较高的B c M i d 蛋白.经过夜透析除去 咪 唑 和P E G 浓 缩 后,进 行W e s t e r nB l o t鉴定,结果如图所示,M为蛋白M a r k e r.由图 a可知,泳道和泳道为B c M i d 蛋白,经纯化透析后蛋白条带单一明亮,说明获得的B c M i d 蛋白质量较高.由图 b可知,泳道和泳道为WB曝光后的蛋白条带,条带大小符合预期,说明收集的蛋白即为B c M i d 蛋白.图目的蛋白的表达纯化和W e s t e r nB l o t检测结果 B c M i d 蛋白与绿原酸的体外相互作用将B c M i d 蛋白与绿原酸孵育,结果如图所示,M为蛋白M a r k e r.由图 a可知,泳道为孵育液经S D S P AG E凝胶电泳后B c M i d 蛋白条带位置.由图 b可知,泳道泳道为B c M i d 蛋白条带位置观察到的荧光(绿原酸自发荧光),表明B c M i d 蛋白是绿原酸作用于灰霉的潜在作用靶点.图目的蛋白与绿原酸的结合绿原酸荧光强度的变化可以初步反映其与B c M i d 蛋白的结合情况,如图所示.图目的蛋白对绿原酸荧光强度的影响第期马志桃,等:B c M i d 蛋白原核表达及其与绿原酸的作用由图 a可知,在 n m激发下绿原酸在水中的荧光较弱,但随着B c M i d 蛋白浓度的增加,绿原酸的荧光强度不断增强,这可能是由于两者结合形成复合物,使绿原酸在水溶液中的溶解度增加荧光增强.由图 b可知,在一定范围内绿原酸荧光强度与B c M i d 蛋白浓度线性相关.根据计算可得Ka()m o l/L,这一现象进一步为绿原酸与B c M i d 蛋白的体外结合提供了证据.结论据报道钙稳态在真菌致病性和生长过程中发挥着重要作用.本文发现,在不含钙的察氏培养基中,绿原酸导致灰霉对钙缺乏敏感度增加,而加入C a会缓解绿原酸对灰霉的抑制,且添加C a后菌丝生长更为茂盛.这与前人研究发现的钙离子可促进菌丝生长结果一致.因此本文推测绿原酸对灰霉的抑制与钙摄入相关.M i d 蛋白是真菌特异性蛋白,与钙稳态密切相关.研究表明,M i d 缺失的真菌突变株在低C a培养基中的生长速率降低.这与本文研究发现的绿原酸胁迫下灰霉的生长对低C a敏感结果一致,表明绿原酸对灰霉的抑制可能与M i d 有关.通过S D S P AG E和荧光定量检测发现,绿 原 酸 和B c M i d 蛋 白 可 以 结 合 且Ka()m o l/L,因此本文推测绿原酸通过结合B c M i d 蛋白抑制灰霉C a流入,使胞内钙稳态失调,从而抑制灰霉生长、削弱致病力.但两者不同条件下的结合效率和结合能力、结合位点以及结合后对目的蛋白构象的改变还有待进一步研究.后续本课题组将通过分子对接模拟等手段多方式验证绿原酸与B c M i d 蛋白的互作.综上所述,本文通过体外平板实验发现绿原酸对灰霉的抑制与钙摄入相关.通过构建表达载体、利用大肠杆菌原核表达系统表达B c M i d 蛋白,体外分析绿原酸与B c M i d 蛋白的结合作用,初步发现B c M i d 蛋白与绿原酸存在相互作用.本文为绿原酸通过B c M i d 蛋白抑制钙通道,以降低灰霉生长和致病力的作用提供了初步证据,为揭 示绿原酸对 灰霉的潜在 抑菌机理提 供了方向.参考文献P E T R A S C H S,KNA P PSJ,KANJA L V,e ta l G r e y m o u l do f s t r a w b e r r y,ad e v a s t a t i n gd i s e a s e c a u s e db y t h eu b i q u i t o u sn e c r o t r o p h i cf u n g a lp a t h o g e nB o t r y t i sc i n e r e aJ M o l e c u l a rP l a n tP a t h o l o g y,():花晨艳姜黄素对猕猴桃灰霉病抑制作用机理研究D合肥:合肥工业大学,S AN T ANA GAL V E ZJ,C I S N E R O S Z E VA L L O SL,J A C O B O V E L AZ QU E ZD C h l o r o g e n i ca c i d:r e c e n t a d v a n c e so n i t s d u a l r o l e a s a f o o da d d i t i v e a n dan u t r a c e u t i c a l a g a i n s tm e t a b o l i cs y n d r o m eJ M o l e c u l e s,():韩宇东杜仲叶绿原酸的提取、分离纯化及其抗氧化和降脂研究D遵义:遵义医学院,王轩,包飞,陈旭蒲公英中绿原酸酶法提取工艺及其对圣女果保鲜效果研究J农产品加工,():,开凯绿原酸对猕猴桃和樱桃番茄采后病原菌抑制作用及机理研究D合肥:合肥工业大学,L IW,S H R I V A S T A V AM,L U H,e ta l C a l c i u m c a l c i n e u r i ns i g n a l i n gp a t h w a y i nC a n d i d aa l b i c a n s:ap o t e n t i a ld r u gt a r g e tJ M i c r o b i o l o g i c a lR e s e a r c h,():M I S HRA R,M I N C N,P E T E R M C e l l su n d e rp r e s s u r e:h o wy e a s t c e l l s r e s p o n dt om e c h a n i c a l f o r c e sJ T r e n d s i nM i c r o b i o l o g y,():P A T R I C I AADC,J E S S I C AC,W I NK E L S T R T E RLK,e ta l T h e i n v o l v e m e n to f t h eM i d/C c h/Y v c c a l c i u mc h a n n e l s i na s p e r g i l l u sf u m i g a t u sv i r u l e n c eJ P L O S ON E,():e S N EHA R AN IA,KA R AKKA TJ,S I NGHSA,e ta l I n t e r a c t i o no fc u r c u m i nw i t h L a c t o g l o b u l i n s t a b i l i t y,s p e c t r o s c o p i ca n a l y s i s,a n dm o l e c u l a rm o d e l i n go f t h ec o m p l e xJ J o u r n a lo fA g r i c u l t u r a la n dF o o dC h e m i s t r y,():KAN GJ,YUANL,X I EMX,e t a l I n t e r a c t i o n so fh u m a ns e r u ma l b u m i nw i t hc h l o r o g e n i ca c i da n df e r u l i ca c i dJB i o c h i m i c aE tB i o p h y s i c a A c t a G e n e r a lS u b j e c t s,():YU Q,WAN G H,C HE N G X,e ta l R o l e so fC c h a n dM i d i nm o r p h o g e n e s i s,o x i d a t i v e s t r e s s r e s p o n s e a n dv i r u l e n c ei n c a n d i d a a l b i c a n sJM y c o p a t h o l o g i a,(/):HA R R E N K,TUD Z YN S K IB C c h a n d M i d a r ef u n c t i o n a l l yr e q u i r e df o rv e g e t a t i v eg r o w t hu n d e r l o w c a l c i u mc o n d i t i o n s i nt h ep h y t o p a t h o g e n i ca s c o m y c e t eB o t r y t i s c i n e r e aJ E u k a r y o t i cC e l l,():(责任编辑张镅)合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷