酶工程在生物技术上的应用.pptx

北京师范大学珠海分校12生物技术2班1/742 目录2酶在去除细胞壁酶在去除细胞壁上应用上应用酶在蛋白质酶在蛋白质测序上应用测序上应用酶在大分子测酶在大分子测序上应用序上应用氢化酶在生物制氢氢化酶在生物制氢上应用上应用2/74Chapter.1酶在除去细胞壁应用过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 3/74Chp1植物细胞壁Chp2细菌细胞壁Chp3酵母细胞壁Chp4霉菌细胞壁主要内容 CONTENTS PAGE CONTENTS PAGE 4/74微生物细胞和植物细胞表层。细胞壁对微生物和植物维持其细胞形态和结构起着主要作用，可保护细胞免遭外界原因破坏。但在生物工程方面，很多时候都要去除细胞壁。介绍 TRANSITION PAGE PAGE 5/74一 细胞内物质提取：微生物和细胞内许多物质，如胰岛素，干扰素等基因工程菌产物天然抗氧剂等植物细胞代谢物等都存在细胞内。为了将这些物质提取出来，很多时候都需要把细胞壁破坏或者除去。介绍 TRANSITION PAGE PAGE 二 原生质体制备：除去细胞壁后由细胞膜和胞内物质组成微球体成为原生质体。在制备原生质体或者提取一些稳定性较差活性物质时候，既要除去细胞壁，又不能损伤其它成份。这么就不能采取激烈破碎方法，而只能利用各种含有专一性酶。6/747 去除植物细胞壁细胞壁组分是纺织、造纸、木材、胶片、增稠剂及其它工业产品主要原料。植物细胞壁生物合成过程是植物生长发育中最主要合成代谢之一，也是植物光合作用产物主要贮积方式。破除植物细胞壁主要采取纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶组成混合酶。这几个酶大多数由霉菌发酵产生。7/74细菌细胞壁由一些化学成份不一样物质组成，如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、磷脂、外膜蛋白等，在这些组成成份中对细胞壁生理功效起主要作用是肽聚糖，除少数细菌如产甲烷细菌这类古细菌细胞壁是由其它化学物质组成外，几乎全部细菌细胞壁都含有肽聚糖，在G+细菌中肽聚糖含量高达30%95%，G 细菌也有5%20%含量。细菌细胞壁 TRANSITION PAGE PAGE 8/74细菌细胞壁 TRANSITION PAGE PAGE 除去细菌细胞壁是采取从蛋清中分离溶菌酶。除去细菌细胞壁是采取从蛋清中分离溶菌酶。9/74细菌细胞壁 TRANSITION PAGE PAGE 合成溶菌酶工艺流程图10/74溶菌酶能专一地作用于细菌细胞壁肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间a-1，4-键。而对于革兰氏阴性菌需要由溶霉菌和EDTA共同作用才能到达很好除去细胞壁效果。这是因为EDTA可作用于脂多糖。细菌细胞壁 TRANSITION PAGE PAGE 11/7412 酵母细胞壁厚度为0.10.3m，重量占细胞干重18%30%，主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖两类多糖组成，含有少许蛋白质、脂肪、矿物质。酵母细胞壁去除12/7413 葡聚糖酶：-葡聚糖酶（-1,3-1,4 葡聚糖酶）。它是采取 Bacillus Lichenifomis 菌株经过液态深层发酵制得，该酶是一个内切酶，专一作用于-葡聚糖 1,3 及 1,4 糖苷键，产生 3-5 个葡萄糖单位低聚糖及葡萄糖。葡聚糖酶葡聚糖酶13/7414 霉菌细胞壁霉菌细胞壁结构比较复杂。不一样种属霉菌，其细胞壁组分和结构有较大差异。所以，若要除去霉菌细胞壁，需要搞清属于什么霉菌，再选取适宜几个酶共同作用，才能到达很好破壁效果。14/7415 藻菌纲霉菌半知菌纲霉菌毛酶，根霉等细胞壁主要由几丁质和壳多糖等各种物质组成。破壁主要采取放线菌或细菌产生克多糖酶和几丁质以及蛋白酶等各种酶混合物。这些混合多酶试剂普通称为细胞壁溶解酶。米曲霉，黑曲霉等细胞壁主要由几丁质，葡聚糖组成。破壁时主要采取几丁质酶和葡聚糖酶混合物。15/74Chapter.2酶在蛋白质测序上应用羧肽酶A过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 16/7417 羧肽酶 Carboxypeptidase，CP1、羧肽酶介绍 羧肽酶是一个专一性地从肽链端逐一降解、释放游离氨基酸一类肽链外切酶。依据反应底物不一样，可分为A、B、C和Y四类。17/7418 羧肽酶 A18/7419 2、羧肽酶A 1、外形紧密，是一个5.0nm4.2nm3.8nm椭圆形球体，大约含有38%螺旋，17%折叠片；2、分子量约为35kD；3、由307个氨基酸残基组成；4、等电点为6.0；5、存在于哺乳动物胰脏；6、是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基消化酶。19/7420 3、羧肽酶A活性中心 精氨酸残基金属Zn2+酪氨酸残基20/7421 3、羧肽酶A活性中心 精氨酸残基金属Zn2+酪氨酸残基21/7422 3、羧肽酶A活性中心 22/7423 4、催化机理羧肽酶催化机制1、促进水解离机制2、Glu-270亲和机制23/7424 24/7425 25/7426 5、锌离子作用1、被裂解肽键羰基指向锌离子，锌离子起吸电子作用，使C=O键比正常更为极化，使羰基C原子更易接收亲核进攻；2、锌离子处于非极性环境促进了诱导偶极子产生，增加了它有效电荷；3、Glu270负电荷迫近也对羰基上产生一个大偶极子做出了贡献。26/7427 27/74Chapter.3过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 酶在大分子切割和拼接方面应用以自我剪切酶和自我剪接酶为例28/7429 Chp1 知识概述1.3酶在大分子切割和拼接方面应用以自我剪切酶和自我剪接酶为例核酶核酶自我剪切酶自我剪切酶自我剪接酶自我剪接酶应用应用Part1Part2Part3Part429/74Chapter.1核酶过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 30/7431 20世纪30年代酶定义：酶定义：酶是一类含有生物催化作用酶是一类含有生物催化作用蛋白质。蛋白质。31/7432 1982年Cech等发觉四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体含有自我剪接功效，并于1986年证实其内含子L-19IVS含有各种催化功效。1984年Altman等发觉RNaseP核酸组分M1RNA含有该酶活性，而该酶蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发觉Ribozyme而取得1989年度诺贝尔化学奖。切赫切赫Thomas Robert Cech32/7433 为何RNA有这种功效？凡是含有催化功效分子，大多与其构象相关它会折叠成一定构型，并可辨识其所要切开序列，其反应也需要金属离子帮助，都很像是酶行为。DNA是双股核酸，而且其分子量非常巨大，所以无法自由卷绕成特定构象，都只是形成长长双螺旋结构。33/7434 至于RNA分子结构，就其化学组成上看，也是由四种核苷酸组成多聚体。它与DNA不一样，首先在于以U代替了T，其次是用核糖代替了脱氧核糖，另外，还有一个主要不一样点，就是绝大部分RNA以单链形式存在，但能够折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内，凡互补碱基对间能够形成氢键(图)。但有一些以RNA为遗传物质动物病毒含有双链RNA。34/7435 RNA分子因为是单股核酸，且其分子通常不会很长，所以能够卷绕成一定分子构象，可能因而含有催化能力；此种含有催化力RNA，统称之为 核酶。核酶是唯一非蛋白酶。它是一类特殊RNA，能够催化RNA分子中磷酸酯水解及其逆反应。35/7436 核酶核酶剪切型核酶剪接型核酶依据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP36/74Chapter.2自我剪切酶过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 37/7438 T.R.Cech 1981年，Thomas Cech和他同事在研究原生动物嗜热四膜虫26srRNA基因中有一段内含子，该基因转录产物前体rRNA中对应于这段内含子核苷酸次序是一个有413个核苷酸居间序列(IVS)。在前体rRNA加工过程中去除基因内含子时这个IVS可自我催化除去,并最终使5外显子与3外显子连接成成熟rRNA分子38/7439 由此取得一个惊奇发觉内含子切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂溶液中，可能解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体本身催化，而不是蛋白质。结论：IVS含有类似蛋白酶功效，能够打断及重建磷酸二脂键。39/7440 为了证实剪接过程中，确实没有蛋白质参加，切赫用重组DNA技术得到四膜虫rRNA基因中413bP连同两侧DNA克隆片段，将其离体DNA克隆到细菌中而且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子，再进行SDS-酚抽提，以确保转录产物前体rRNA不与酶蛋白结合，在电泳图谱上可看到环状IVS，线状IVS和缺失15个核苷酸线状物3条谱带，结合其它一些试验结果，能够充分必定前体rRNA可在非酶蛋白质存在条件下进行自我剪接。思索：为何有这么试验结果？40/7441 前体RNA 生物刚开始转录出来RNA是不成熟,能够称为前体RNA。对于原核生物，当前体RNA经过加工,mRNA 由RNA 聚合酶合成后，将里面内含子转录部分切掉。这么才能形成有功效mRNA，然后从细胞核中出来。Click me41/7442 剪切型核酶特点：这类核酶作用是只剪不接，催化本身RNA或不一样RNA分子，切下特异核苷酸序列。类型：自体催化剪切型：RNA前体异体催化剪切型书本28342/7443 剪 切 机 制转酯化过程：由靠近位点3端2OH或氧原子对切割位点磷原子实施亲核攻击，产生5-OH 和2，3-环磷酸二酯。43/7444 一、锤头型核酶a中N,N代表任意核苷酸；X 能够是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中双螺旋区；箭头指向切割位点。b 是锤头型核酶立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物RNA分子，在磷酸骨架上结合有镁离子 PS:书本15144/7445 二、发夹型核酶 50个碱基核酶和14个碱基底物形成了发夹状二级结构，包含4个螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对)由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物结合。核酶识别次序是NGUC，其中N代表任何一个核苷酸，这个次序位于螺旋1和2之间底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。45/7446 剪接型核酶 自我剪接酶是在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接反应R酶。类型：I类内含子（IVS）自我剪接类内含子自我剪接PS：书本28546/7447 一、I类内含子 I型IVS是与四膜虫26srRNA前体IVS结构相同间隔序列，含有环状结构。经过转磷酸酯反应，生成成熟26srRNA及G-IVS.G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参加。剪接机制47/7448 48/7449 49/7450 Click mePS：书本14750/7451 51/7452 二、类内含子 型IVS是与细胞核mRNA前体IVS结构相同间隔序列。经过转磷酸酯反应，生成成熟RNA及套环状IVS。催化剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)。剪接机制52/7453 53/7454 54/7455 类型自我拼接内含子分布很广，存在于真核生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因，细菌和噬菌体个别基因中。类型内含子只见于一些真菌线粒体和植物叶绿体基因。55/7456 利用核酶进行基因工作治疗策略包含5个步骤即:1)选择适当核酶及其载体;2)核酶与载体连接并转导细胞;3)核酶转录,在细胞内不停产生大量核酶分子;4)核酶经过共有序列识别与异常基因转录产物结合;5)异常产物被核酶剪切并被RNase降解,核酶循环利用。1医学应用应用核酶作为基因工程药品含有两个显著优点:1)核酶本质是RNA,其引发免疫应答可能性比外源蛋白小得多;2)普通核酶分子比较小,易于操作。56/7457 基因突变有时会在内含子中生成新剪接点，当然也是异常剪接点。它们与左邻右舍原来不起作用隐匿剪接点搭配起来，就会形成错误剪接。因为原有正常剪接点并未丧失功效，只是作用被异常剪接抑制，所以用反义核酸经过碱基互补，封闭异常剪接点或其它剪接元件，就可堵住异常剪接路径，迫使剪接系统选择正确路径，形成正常RNA。这就间接地对RNA缺点作了“修复”。恢复正常剪接路径恢复正常剪接路径57/7458 防治动、植物病毒侵害：构建锤头型核酶对烟草花叶病毒(TMV)RNA片段进行体外剪切,马铃薯纺锤形块茎类病毒负链多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链突变核酶克隆等。2植物植物病毒病毒防治防治应用58/74Chapter.4氢化酶在生物制氢中应用氢化酶在生物制氢中应用过渡页 TRANSITION PAGE PAGE 59/7460 4.1 氢化酶是什么？1931年科学家将微生物体内能够分解甲酸产生氢气物质称为氢化酶，广泛存在于原核生物及低等真核生物体内。氢化酶（英语；Hydrogenase）也称氢酶，是一个能够可逆地催化氢气氧化还原酶，以下方程式：（1）H2+Aox 2H+Ared （2）2H+Dred H2+Dox60/7461 4.1 氢化酶分类氢化酶分类。镍铁类双铁类单铁类双铁类氢化酶产氢活性最高，是其它二者10100倍，NIFE）类氢化酶在自然界中含量最丰富，人们对其研究最广泛最深入。61/7462 氢化酶产生菌氢化酶产生菌氢化酶产生菌绿藻绿藻浑球红细菌浑球红细菌巴氏杆菌巴氏杆菌脱硫弧菌脱硫弧菌62/7463 氢化酶应用氢化酶应用1自从1939年Gaffron发觉绿藻含有产氢功效以来，生物制氢技术逐步受到植物界、微生物界、能源界以及相关专业研究人员广泛关注，人们在发酵原料、发酵条件、发酵动力学、产氢机制等方面做了大量研究。生物制氢以其原料起源丰富、价格低廉、低能耗、反应条件温和等特点，是当前研究最快，并有望进行规模化生产一个制氢方法。生物生物制氢制氢63/7464 氢化酶应用氢化酶应用2生物生物制氢制氢依据所选取微生物、产氢底物及其产氢机理，生物制氢能够分为蓝细菌和绿藻制氢、光合细菌制氢和厌氧发酵制氢等3种类型。其中厌氧发酵制氢采取是产氢菌厌氧发酵，它优点是产氢速度快，反应器设计简单，且能够利用可再生资源和废弃有机物进行生产，相对于其它两种方法更轻易在短期内实现。64/7465 绿藻制氢厌氧发酵制氢And厌氧细菌在黑暗、厌氧条件下分解有机物产生氢气，通常称为厌氧发酵产氢或黑暗（暗）发酵产氢。当前，绿藻产氢代谢路径主要能够分为直接生物光解路径和间接生物光解路径。氢化酶应用氢化酶应用65/7466 4.3生物生物制氢制氢厌氧发酵制氢 厌厌氧氧发发酵酵底底物物利利用用范范围围很很广广泛泛(包包含含垃垃圾圾、废废品品),能能更更有有效效地地制制氢氢。另另外外 ,发发酵酵制制氢氢通通常常有有较较高高收收益益率且不依赖光源率且不依赖光源碳碳水水化化合合物物主主要要是是葡葡萄萄糖糖，是是发发酵酵过过程程首首选选碳碳源源 ,主主要要产产生生乙乙酸酸、丁丁酸酸与与氢氢气气 ,详详细细反反应应如如式式(1)(1)、式式(2)(2)。C C6 6H H1212O O6 6+2H+2H2 2O 2CHO 2CH3 3COOH+2COCOOH+2CO2 2+4H+4H2 2（1 1）C C6 6H H1212O O6 6+2H2H2 2OCHOCH3 3CHCH2 2COOH+2COCOOH+2CO2 2+2H+2H22（2 2）66/7467 产氢细菌直接产氢过程均发生于丙酮酸脱羧作用中，其中两方式。一为梭状芽孢杆菌型。二是肠道杆菌型该过程中丙酮酸脱羧后形成甲酸，然后甲酸全部或部分裂解转化为H2和CO2。厌氧发酵制氢67/7468 n依据氢酶催化特征，氢酶能够分为吸氢酶、放氢酶和双向氢酶三类。n放氢酶主要表现为催化产氢反应n吸氢酶主要表现催化吸氢反应n双向氢酶表现出催化性质则依氢酶所处环境而定，既能催化吸氢反应又能催化放氢反应。n当前已经有许多学者经过基因改造氢酶来提升生物制氢产量。68/7469 在直接生物光解路径中，绿藻经过捕捉太阳光，利用光能经由光合反应将水分子光解，取得低电位还原力，并最终还原Fe氢化酶释放出氢气（图1）绿藻制氢69/7470 间接生物光解路径能够分为两间接生物光解路径能够分为两个阶段，在第一个阶段中，绿个阶段，在第一个阶段中，绿藻细胞在有氧条件下经过光合藻细胞在有氧条件下经过光合作用固定二氧化碳，合成细胞作用固定二氧化碳，合成细胞物质物质。而在第二个阶段中，在无氧条而在第二个阶段中，在无氧条件下，这些细胞物质会经过酵件下，这些细胞物质会经过酵解产生还原力，用于解产生还原力，用于FeFe氢化酶氢化酶还原和氢气释放（图还原和氢气释放（图2 2）绿藻制氢70/7471 世界首例生物制氢生产线在我国开启71/7472 1 黄国荣,朱俊东,糜漫天,郎海滨.啤酒酵母多糖提取工艺研究J.第三军医大学学报.(06).2 张玉香,尹卓容.甘露糖蛋白提纯及分子量测定J.酿酒科技.(04)3 刘景圣,蔡丹,孙涛.嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖分离提取J.吉林农业大学学报.(04).4 温晓庆,托娅,段智变,张和平.Lb.casei.Zhang肽聚糖体内外抗肿瘤作用J.山西农业大学学报(自然科学版).(03).5 李刚,徐芳杰,蒋思丝,章永松,林咸永.铝对小麦根尖细胞壁过氧化物酶活性和过氧化氢含量影响J.植物营养与肥料学报.(04).6吴静,闵柔,邬敏辰等.羧肽酶研究进展J.食品与生物技术报.,31(8):793-7997 孙杨,陈颖洁.肥大细胞羧肽酶A研究进展J.科技信息.:500-501.8 高彦飞,王飞霞.蛋白质及多肽C端测序研究进展J.分析化学.,35(12):1820-1826.参考文件72/7473 9王镜岩，朱圣庚等王镜岩，朱圣庚等.生物化学第三版生物化学第三版 下册下册J高等教育出版社，高等教育出版社，：472-481.10文重文重,介英介英.RNA自我剪接自我剪接R N A机制机制 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