3D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用.pdf

第4 9卷 第3期2 0 2 3年6月东华大学学报(自然科学版)J OUR NA L O F D ON GHUA UN I V E R S I T Y(NA TUR A L S C I E N C E)V o l.4 9,N o.3J u n.2 0 2 3 文章编号:1 6 7 1-0 4 4 4(2 0 2 3)0 3-0 0 1 7-0 9 D O I:1 0.1 9 8 8 6/j.c n k i.d h d z.2 0 2 1.0 6 9 2收稿日期:2 0 2 1-1 2-1 1基金项目:国家自然科学基金青年项目(8 1 8 0 2 5 6 9)通信作者:胡梦博,男,主治医师,研究方向为泌尿系统肿瘤的临床与基础,E-m a i l:h u m e n g b o f u d a n.e d u.c n;李超婧,女,讲师,研究方向为医用纤维基材料,E-m a i l:l c j d h u.e d u.c n引用格式:傅思佳,刘星星,胡梦博,等.3 D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用J.东华大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 9(3):1 7-2 5.F U S J,L I U X X,HU M B,e t a l.T h r e e-d i m e n s i o n a l t u m o r s c a f f o l d:r e s e a r c h a d v a n c e s a n d a p p l i c a t i o n i n d r u g s c r e e n i n g J.J o u r n a l o f D o n g h u a U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e),2 0 2 3,4 9(3):1 7-2 5.3 D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用傅思佳1 a,刘星星1 a,胡梦博2,李超婧1 a,1 b,王富军1 a,1 b,王 璐1 a,1 b(1.东华大学 a.纺织学院,b.纺织面料技术教育部重点实验室,上海 2 0 1 6 2 0;2.复旦大学附属华山医院泌尿外科,上海 2 0 0 0 4 0)摘要:3 D肿瘤支架作为新兴的肿瘤细胞培养平台,能够重现肿瘤组织的3 D结构,提供仿生微环境和降低肿瘤细胞的药物敏感性,在肿瘤生理学研究和肿瘤耐药机制研究中具有独特优势。综述了3 D肿瘤支架的类型及其优缺点,从模拟肿瘤-间质细胞相互作用和肿瘤内部梯度缺氧环境两方面介绍了3 D肿瘤支架模拟肿瘤微环境的研究进展,并对3 D肿瘤支架在药物筛选中的应用进行分析。揭示了肿瘤支架在研究肿瘤耐药性机制、开发新型抗肿瘤药物,以及作为个性化肿瘤治疗临床前平台中的重要作用。最后对肿瘤支架的构建和应用提出设想和展望,旨在为构建高仿真肿瘤模型,研究肿瘤的异质性和肿瘤治疗方法提供参考。关键词:3 D肿瘤支架;药物筛选;肿瘤微环境;肿瘤模型;3 D细胞培养中图分类号:R 3 1 8.0 8 文献标志码:AT h r e e-d i m e n s i o n a l t u m o r s c a f f o l d:r e s e a r c h a d v a n c e s a n d a p p l i c a t i o n i n d r u g s c r e e n i n gF U S i j i a1 a,L I U X i n g x i n g1 a,HU M e n g b o2,L I C h a o j i n g1 a,1 b,W AN G F u j u n1 a,1 b,W AN G L u1 a,1 b(a.C o l l ege o f T e x t i l e s,b.K ey L a b o r a t o ry o f T e x t i l e S c i e n c e&T e c h n o l og y,M i n i s t ry o f E d u c a t i o n,1.D o ngh u a U n i v e r s i ty,S h a ngh a i 2 0 1 6 2 0,C h i n a;2.D epa r t m e n t o f U r o l og y,H u a s h a n H o spi t a l,F u d a n U n i v e r s i ty,S h a ngh a i 2 0 0 0 4 0,C h i n a)A b s t r a c t:A s a pr o m i s i ng pl a t f o r m f o r t u m o r r e s e a r c h,3 D t u m o r s c a f f o l d s a r e a b l e t o r epr o d u c e t h e 3 D s t r u c t u r e o f t u m o r t i s s u e,pr o v i d e a b i o n i c m i c r o e n v i r o n m e n t a n d r e d u c e t h e d r ug s e n s i t i v i ty o f t u m o r c e l l s,w h i c h h a v e u n iqu e a d v a n t age s i n t u m o r phys i o l og y a n d t u m o r d r ug r e s i s t a n c e m e c h a n i s m.T h e ty pe s o f 3 D t u m o r s c a f f o l d s a n d t h e i r a d v a n t age s a n d d i s a d v a n t age s w e r e r e v i e w e d.T h e r e s e a r c h pr ogr e s s o f 3 D t u m o r s c a f f o l d s m i m i c k i ng t u m o r m i c r o e n v i r o n m e n t w a s i n t r o d u c e d i n t e r m s o f s i m u l a t i ng t u m o r-m e s e n c hym a l c e l l i n t e r a c t i o n s a n d t u m o r i n t e r n a l gr a d i e n t hy po x i c e n v i r o n m e n t,a n d t h e ap pl i c a t i o n o f 3 D t u m o r s c a f f o l d s i n d r ug s c r e e n i ng w a s a n a lyz e d.T h i s r e v i e w d e m o n s t r a t e s t h e i mpo r t a n c e o f t u m o r s c a f f o l d s i n u n d e r s t a n d i ng t u m o r d r ug r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s,d e v e l opi ng n o v e l a n t i t u m o r d r ugs,a n d s e r v i ng a s a pr e c l i n i c a l pl a t f o r m f o r pe r s o n a l i z e d t u m o r t h e r ap y.T h e c o n s t r u c t i o n a n d ap pl i c a t i o n o f 东华大学学报(自然科学版)第4 9卷 t u m o r s c a f f o l d s a r e e n v i s i o n e d a n d pr o spe c t e d,a i m i ng t o pr o v i d e a r e f e r e n c e f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f h igh s i m u l a t i o n t u m o r m o d e l s a n d t h e s t u dy o f t u m o r h e t e r oge n e i ty a n d t u m o r t r e a t m e n t m e t h o d s.K e y w o r d s:3 D t u m o r s c a f f o l d;d r ug s c r e e n i ng;t u m o r m i c r o-e n v i r o n m e n t;t u m o r m o d e l;3 D c e l l c u l t u r e 世界卫生组织(WHO)发布的数据1显示,2 0 2 0年全球新发肿瘤病例数为1 9 2 9万,预计未来2 0年全球肿瘤患者人数将增加6 0%2。肿瘤临床前模型的研究对阐明肿瘤进展、转移相关的复杂机制十分重要,并且能够为肿瘤药物筛选提供验证和预测的平台。构建肿瘤模型主要有2 D肿瘤细胞培养、3 D肿瘤细胞培养和动物体内肿瘤培养3种方法。2 D肿瘤细胞培养系统和动物模型已辅助开展了部分肿瘤学研究,但这两种模型存在一些缺陷,因此不能完全转化为临床试验。2 D培养体系能够为肿瘤病理研究提供信息,但是肿瘤细胞在2 D模型中以单层形式增殖,缺乏细胞-细胞、细 胞-细 胞 外 基 质(e x t r a c e l l u l a r m a t r i x,E CM)的相互作用关系3,导致基因表达、蛋白质合成与体内环境存在明显差异4。此外,2 D培养体系的物质交换方式无法模拟体内肿瘤组织的氧气、营养物质和代谢废物的转运梯度5。因此,2 D培养无法模拟生理肿瘤微环境(t u m o r m i c r o e n v i r o n m e n t,TME),这限制了它在药物筛选中的应用。携带肿瘤的动物模型是监测药物利用度、治疗效果和剂量毒性的重要工具。但是种间差异导致结果重现性差,使用动物模型测试抗肿瘤药物并转化为临床试验的比例不到8%6。出于伦理及成本考虑,利用动物进行疾病研究或药物试验时应符合3 R(r e d u c t i o n,r e p l a c e m e n t,r e f i n e m e n t)原 则7。因此,资助机构建议使用细胞培养模型替代动物模型,从而减少用于肿瘤研究和药物评估的动物数量。为弥补2 D培养和动物模型的缺陷,研究者们开发了多种3 D肿瘤细胞培养技术,主要是利用不同材料、成型技术构建具有3 D结构的细胞载体及细胞团。相比2 D培养,3 D培养能够通过重建细胞-细胞、细胞-E CM相互作用的3 D通信网络,重现体内肿瘤微环境和肿瘤细胞生物学行为8-1 0。通过调控环境因素或添加额外的刺激,可用3 D肿瘤模型模拟更真实的肿瘤微环境,从而减小体外细胞模型与体内肿瘤间的差异。现有3 D培养技术主要包含多细胞肿瘤球体和3 D肿瘤支架两种类型。多细胞肿瘤球体存在尺寸/形态不均匀、可重复性低等不足之处。基于3 D支架的肿瘤模型能够提供更接近E CM的结构,因此与肿瘤生理环境具有更强的相关性,是研究肿瘤病理学和对肿瘤药物进行临床前筛选的重要工具。基于以上背景,本文重点关注基于支架的3 D肿瘤模型及其应用领域,综述了3 D肿瘤支架的类型,探讨基于支架的3 D肿瘤模型模拟TME的研究进展,以 及 这 类 肿 瘤 支 架 在 药 物 筛 选 方 面 的应用。1 3 D肿瘤支架的类型 3 D肿瘤支架可为肿瘤细胞培养提供理想的结构和环境,因为其较高的比表面积有利于细胞黏附增殖,多孔结构可为营养物质和代谢废物提供运输途径。构建3 D肿瘤支架的材料分为天然材料(如胶原1 1、丝素蛋白1 2、透明质酸1 3、藻酸盐1 4等)和合成材料(如聚己内酯1 5、聚乙二醇及其衍生物1 6、聚丙交酯乙交酯1 7等)。此外,加入生长因子、蛋白质或矿物质可以模拟肿瘤微环境和增强细胞活性,如在聚己内酯静电纺丝支架上涂覆磷酸钙来模拟乳腺肿瘤骨转移环境1 8。3 D肿瘤支架的类型主要包括静电 纺 丝 支 架1 9-2 1、水 凝 胶 支 架(水 合 态/冻 干态)1 1,1 3,2 2-2 4、脱细胞基质支架2 5-2 7、3 D打印支架2 8-3 0等(见表1)。1.1 静电纺丝支架 静电纺丝技术利用电流体动力学原理,使聚合物溶液/熔体在高压下克服表面张力被拉伸,然后沉积到收集装置上形成随机或取向的微纳米纤维3 1。由微纳米纤维堆积成的静电纺丝支架形成了孔隙率较高的互连网络,具有类似天然细胞外基质的结构2 1,3 2。静电纺丝支架可为肿瘤细胞活动提供物理结构支持,有利于细胞重现体内形态,还可通过改变工艺参数调整孔隙率、纤维形态和组成成分等,以满足不同细胞的培养要求,因此被认为是一种理想的3 D肿瘤细胞培养支架。研究证实,纤维形态(纤维直径和纤维取向)会对肿瘤细胞的行为产生直接影响3 3。此外,用E CM衍生的蛋白质或多肽对微纳米纤维进行表面修饰可以提高支架与肿瘤E CM的相似性3 4。然而静电纺丝支架中纤维堆砌紧密,呈二维膜状结构3 5,限制了细胞在支架上的三维渗透及迁移。因此,需要将微纳米纤维膜制备成具有大孔结构的3 D支架。81 第3期傅思佳,等:3 D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用表1 肿瘤细胞3 D培养支架类型及其优缺点T a b l e 1 T y p e s o f 3 D c u l t u r e s c a f f o l d s f o r t u m o r c e l l s a n d t h e i r a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s支架类型支架形态优点缺点静电纺丝支架1 9-2 1由纳 米 或 微 米 尺 寸 的纤维密集堆积的网络具有E CM仿生结构;纤维直径、尺寸可调纤维堆砌致密影响细胞浸润;纺丝溶剂具有细胞毒性水凝胶支架(水合态)1 3,2 2-2 3纤维 状 的 致 密 凝 胶 交联网络类似天然E CM的生物活性、黏 弹 性;可 封 装 生 物 活 性分子力学性能差;无法形成精确可重复的结构;孔隙小水凝胶支架(冻干态)1 1,2 4类似 泡 沫 的 多 孔 互 连网络孔径的大 小 和取 向可 调;高孔隙率交联前力学性能差;冷冻过程可能引起结构差异;耗时长脱细胞基质支架2 5-2 7柔软的半透明支架能较好地保留E CM交 联 前 力 学 性 能 差;存 在 批 次 间差异3 D生物打印支架2 8-3 0具有 明 确 的 孔 隙 形 状和尺寸的多层结构可准确沉积不同类型的细胞和材料;自 动 化、通 量 高、适用性广泛技术要求和成本高;对热敏或压敏材料不适用;挤压产生的剪切力影响细胞活性 现有的策略主要有以下几种:一是利用外力将静电纺丝支架制备成短纤维分散到液体中,冷冻干燥得到高度多孔(9 9%)的三维纳米纤维海绵3 6;二是气体发泡,例如将不同形状的2 D静电纺丝支架浸入N a B H4水溶液中,利用反应产生的气体使其膨胀,控制反应时间可以得到不同厚度和形状的3 D支架3 7;三是使用双喷嘴和多层静电纺丝方法制备高孔隙率的复合3 D纳米纤维支架3 8;四是将静电纺丝与3 D打印技术相结合以获得具有精确形状、可控大孔结构和纤维表面的支架3 9。然而,这些方法制备的均是短纤维支架,抗压缩性能不足,在外部压力下易产生碎屑。此外,气体发泡是一种随机的过程,通常会在纤维网络内产生非常不均匀的孔径分布;多层结构的支架则孔径相对较小,不利于细胞浸润;3 D打印技术的工艺较为复杂,需要先实现单根短纤维的高效黏合和纤维基墨水的均匀挤出。1.2 水凝胶支架 水凝胶是由共价键或分子内和分子间的吸引力组成的含水率较高的聚合物交联网络4 0。这种独特的三维黏弹性网络可为氧气、营养物质和代谢废物的扩散和交换提供支持,并且展现出良好的生物相容性和模拟肿瘤E CM能力4 1。同时,细胞也可通过分泌E CM重塑水凝胶结构,因此水凝胶也常用于肿瘤侵袭和转移的研究4 2。水凝胶的另一项优点是能够封装和释放生物活性剂,为体外肿瘤细胞培养提供生长因子以研究肿瘤基质中生长因子的化学动力学4 3-4 4。由常规方法制得的水凝胶的孔径通常在几纳米到几十纳米之间,这种尺寸限制了细胞在水凝胶中的迁移,因此研究者们开发了添加致孔剂、气体发泡、相分离等技术以制备大孔径水凝胶,但仍然难以控制孔径、孔的取向排列和孔隙网络的互连性4 5。冷冻干燥后的水凝胶支架(简称冻干支架)具有更明确的互连圆形/椭圆形多孔结构2 3。通常将溶液冷冻到冰点以下,然后在真空中干燥,使冰晶升华而形成具有互连多孔结构的干燥海绵状支架。冻干支架的孔隙结构受冷冻速度、冷冻温度分布和模具尺寸的影响。较低的冷冻速度有利于形成大尺寸的冰晶,冰晶升华后可获得具有大孔径的均质结构4 6;较低的 冷 冻 温 度 导 致 冰 晶 尺 寸 和 形 成 的 孔 径 较小4 7;使用不同尺寸的模具(细胞培养板)制备冻干支架时,由6孔模具制得的冻干水凝胶的孔径分布最不均匀,而1 2孔和2 4孔模具制得的冻干水凝胶中观察到各向同性的孔,由最小尺寸模具(4 8孔)制得的冻干水凝胶的孔径分布最均匀,这是因为小尺寸模具中水凝胶冻干时为单向凝固4 8。然而,水合态水凝胶支架和冻干支架的力学性能都不足以为细胞提供机械支持,更难以模拟肿瘤组织刚度。研究者们通过创建双/互穿网络、添加纳米复合材料、提高交联密度、纤维增强等方法提高水凝胶支架力学性能4 9-5 1。例如:S u n等4 9通过设计聚乙二醇二丙烯酸酯(P E G D A)/硫醇化壳聚糖双交联网络,提高了水凝胶的力学性能和耐疲劳性能,但交联网络的增加也会在一定程度上减小水凝胶的孔径和溶胀率,从而影响细胞的浸润。K o n g等5 0将G e l MA水凝胶灌注到正交排列的聚己内酯-聚乙二醇(P E C L)网格纤维中,网格纤维的加入可以将纵向压缩力转移为纤维支架的横向张力,进而显著提高G e l MA的压缩模量和力学稳定性;但加入的网格纤维抑制了水分子在水凝胶中的渗透,致使水凝胶支架的溶胀率降低,因此需要调控纤维的排布以寻找最合适的纤维间距。91东华大学学报(自然科学版)第4 9卷 1.3 脱细胞基质支架 肿瘤微环境中最丰富的成分是E CM。脱细胞策略即在不影响E CM的结构和组成的前提下去除器官或组织中的细胞以制备脱细胞基质支架2 7,因此制备脱细胞基质也是构建3 D肿瘤支架的有效方法。现有的脱细胞方法包括物理脱细胞、酶促脱细胞、化学脱细胞和组合法脱细胞。脱细胞基质支架因含有部分蛋白和可溶性因子,可在体外重建复杂的肿瘤微环境,并且能较好地保留E CM。但是采用的脱细胞方法和组织成分的不同将导致批次间存在差异,因此,必须对脱细胞基质的成分、生长因子和结构进行检测以保证其质量稳定性2 5。研究者们常采用细胞衍生的脱细胞基质。因为这种脱细胞基质具有高度可重复的生化特性和结构特性,并且可通过基因工程技术对其进行修饰,常用于分析肿瘤细胞-E CM相互作用中单一生物成分的影响5 2。然而,脱细胞基质衍生的水凝胶的刚度(0.14.0 k P a)远低于实体瘤E CM的刚度(如乳腺肿瘤,1 04 2 k P a2 5)。通常将该水凝胶与E CM中的大分子基团进行化学交联以提高脱细胞基质支架的刚度,但使用化学交联剂会引起高细胞毒性、活性成分变性和钙化等副作用。使用天然交联剂虽能降低细胞毒性和免疫原性,但交联后的支架通常带有颜色,不利于光镜观察且交联耗时较长。1.4 3 D生物打印支架 3 D生物打印技术通过打印负载细胞的水凝胶基质或生物墨水将细胞和生物材料结合起来,使得细胞、生物材料、生物分子可在时间和空间上通过逐层沉积来创建模拟肿瘤组织的成分和结构5 3。该技术的优点在于能够有效实现间质细胞和肿瘤细胞的共同培养,可用于研究肿瘤血管生成、转移和侵袭中涉及的细胞间相互作用5 4,并且打印过程中将细胞混合到支架里面,细胞可以分散在整个3 D支架中,能够改善在支架表面人工接种细胞时造成的细胞浸润不良的问题。为了提高3 D生物打印技术的适用性,通常联合使 用3 D生 物 打 印 与 其 他 支 架 制 备 技 术。如K o r t-M a s c o r t等5 5在脱细胞基质中加入藻酸盐、明胶以增强其力学特性,通过3 D生物打印技术制备了头颈部鳞状细胞肿瘤支架。采用3 D生物打印技术制备水凝胶支架也是目前常采用的技术,通过简单的模板法、凝胶挤出或立体光刻等手段可以精确控制孔的形状、尺寸和排列形式,但也要求水凝胶能够快速实现凝胶化从而维持其原有的特性4 5。此外,3 D生物打印需要专业设备和专业人员指导,并且选用的生物材料必须具有较高的可打印性和生物相容性。2 3 D肿瘤支架对肿瘤微环境的模拟 恶性肿瘤的发生和进展与肿瘤细胞周围微环境的变化息息相关8,5 6。肿瘤细胞基于肿瘤微环境维持其增殖和通信能力,肿瘤-微环境的相互作用显著影响肿瘤的进展与转移。肿瘤微环境中除肿瘤细胞以外,还包含大量的间质细胞、丰富的E CM和可溶性生长因子等(见图1)5 7。研究者们致力于构建能够模拟肿瘤微环境的3 D支架,以期为研究肿瘤细胞-间质细胞相互作用及模拟肿瘤微环境中的梯度提供合适的平台。图1 肿瘤微环境示意图F i g.1 S c h e m a t i c o f t h e t u m o r m i c r o e n v i r o n m e n t2.1 模拟肿瘤细胞-间质细胞的相互作用 研究表明,间质细胞参与肿瘤的侵袭/外渗、迁移、血管生成并影响疾病的发展5 8,因此有必要构建肿瘤细胞与间质细胞的共培养体系,以研究不同类型间质细胞和肿瘤细胞间的通信机制。肿瘤免疫机制是一种重要的细胞间通信机制。采用3 D肿瘤支架可以对与肿瘤免疫相关的间质细胞和肿瘤细胞进行共培养,从而研究肿瘤的免疫特征。肿瘤相 关 巨 噬 细 胞(t u m o r-a s s o c i a t e d m a c r o p h a g e s,T AM)是一种典型的间质细胞,具有M 1型(参与炎症反应和抑制肿瘤发生)和M 2型(抑制炎症反应和促进肿瘤免疫逃逸)两种表型。3 D生物打印肿瘤支架可以整合巨噬细胞和胶质母细胞瘤(g l i o b l a s t o m a,G B M)细胞。研究5 9发现,肿瘤微环境能使巨噬细02 第3期傅思佳,等:3 D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用胞优先向M 2型极化,同时巨噬细胞的加入也会促进肿瘤细胞表现出缺氧和侵袭特征。肿瘤相关成纤维细胞(c a n c e r-a s s o c i a t e d f i b r o b l a s t s,C A F s)也是一种常见的间质细胞,通过分泌促炎细胞因子抑制T细胞的抗肿瘤功能。P h a n-L a i等6 0在使用壳聚糖-海藻酸钠制备的3 D肿瘤支架中发现,C A F s通过分泌免疫抑制细胞因子I L-1 0和T G F-帮助乳腺肿瘤细胞进行免疫调节。R e b e l o等6 1采用海藻酸盐水凝胶肿瘤支架实现了肿瘤细胞、C A F s和单核细胞的三重培养,肿瘤细胞分泌的细胞因子证实了免疫抑制环境的形成。F r a n c h i-m e n d e s等5 8据此提出了C A F s靶向治疗剂,这些药物可通过靶向C A F s衍生因子(I L-6或C X C L 1 2)、阻断T G F-来抑制表型的活化,或直接靶向C A F s亚群发挥作用。肿瘤血管生成是肿瘤细胞能够无限增殖的基础,肿瘤细胞系本身不能诱导血管生成,但其中的信号传导(如旁分泌因子、蛋白表达)可以诱导内皮细胞发生表型和基因型变化,引导E CM重塑和血管新生6 2。3 D肿瘤支架为在体外研究肿瘤血管生成提供了一种更接近体内实 际环境的模 型。W a n g等6 3利用图案化仿生水凝胶肿瘤支架模拟G BM-内皮 细 胞 的 相 互 作 用,发 现 血 管 内 皮 生 长 因 子(V E G F)分泌显著增加,内皮细胞形成了血管样结构。但要形成稳定和功能性的血管,还需额外的间质细胞,如周细胞和成纤维细胞。L a n g e r等2 9基于体外3 D打印肿瘤支架对MC F-7细胞系、乳腺成纤维细胞和内皮细胞进行共培养,观察到完整的毛细血管网络和多个横穿组织的分支点(见图26 4)。此外,研究者通过3 D肿瘤支架研究了肿瘤细胞对间质细胞的影响。C u i等6 5在基于纳米羟基磷灰石-G e l MA的3 D肿瘤支架中共培养内皮细胞(E C)、乳腺肿瘤细胞系和人胎儿成骨细胞(h F O B)时发现,E C s和肿瘤细胞的增殖率显著增大,而h F O B细胞的增殖率显著减小,印证了乳腺肿瘤细胞对成骨细胞的黏附和分化的抑制作用6 6。综上所述,共培养体系已经从肿瘤细胞-间质细胞的双重共培养发展成两种以上细胞类型的肿瘤共培养物。但用于共培养研究的肿瘤支架是以特定研究目标为导向进行设计,因此全面重现肿瘤微环境的复杂性仍是一项挑战6 7。复杂的肿瘤支架虽然更贴近真实的肿瘤微环境,但在分析单一因素对细胞行为的影响时,复杂的相互作用导致不同因素的作用更难以区分6 8。因此,需制定共培养的标准方案并密切监测细胞的行为变化,以便清楚地表征不同因素(材料、外加生长因子、共培养细胞等)对细胞图2 内皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞共培养诱导毛细血管形成6 4F i g.2 C o-c u l t u r e o f e n d o t h e l i a l c e l l s,f i b r o b l a s t s a n d t u m o r c e l l s i n d u c e c a p i l l a r y f o r m a t i o n6 4行为的影响并分析其影响机制。2.2 模拟缺氧微环境 缺氧是肿瘤微环境的典型特征之一。在氧气可控水凝胶中发现氧梯度存在于肉瘤的早期阶段6 9。当血液供应无法满足快速生长的肿瘤时,肿瘤局部就会发生缺氧,并影响肿瘤的发展和转移。因此,利用3 D肿瘤支架建立氧梯度对于模拟肿瘤真实微环境必不可少。L i v e r a n i等2 4通过构建型胶原3 D肿瘤支架诱导产生缺氧环境,结果表明,支架中的低氧生态位可诱导胶原纤维迁移,并上调与肿瘤侵袭有关的基质金属蛋白酶。与实体肿瘤中存在缺氧核心一样,在直径为2 0 05 0 0 m的肿瘤团中可以观察到化学和氧梯度(见图3)。S i n g h等7 0通过设计不同孔径的水凝胶微孔肿瘤支架获得不同直径的微肿瘤,在大型微肿瘤核心中观察到缺氧核心的形成以及缺氧诱导因子表达增加的现象,但小型微肿瘤中不存在上述现象,说明控制微肿瘤的直径可以自然产生空间氧气/养分扩散梯度。但目前许多研究仅利用缺氧室来创建缺氧微环境7 1,应致力于在肿瘤支架中创建具有可重复性和可控性的氧梯度,且便于实时缺氧监测。图3 肿瘤内部化学梯度和氧梯度F i g.3 T h e c h e m i c a l a n d o x y g e n g r a d i e n t s o f s o l i d t u m o r3 3 D肿瘤支架在药物筛选中的应用 2 D培养缺乏物理-生化屏障和真实的肿瘤微环12东华大学学报(自然科学版)第4 9卷 境,通常高估了化疗药物的疗效7 2。而3 D肿瘤支架因减少了药物的渗透并沉积了更多的E CM,能够模拟体内药物输送的生理屏障7 3。经3 D肿瘤支架培养的肿瘤细胞的基因表达和蛋白合成明显不同于2 D培养的肿瘤细胞6 8,使得3 D培养的肿瘤细胞具有更高的耐药性。因此,3 D载细胞肿瘤支架作为肿瘤模型能够提供更可靠的药物疗效预测,并且可满足高通量筛选、个性化治疗及减少临床前试验阶段所需的动物数量,从而显著降低药物测试成本。化疗药物通常会导致严重的不良反应和细胞耐药性,甚至是多耐药的情况7 4,3 D载细胞肿瘤支架能重现体内肿瘤细胞耐药性特征。C h e n等7 5使用聚己内酯结直肠肿瘤支架培养后的肿瘤细胞表现出较强 的 耐 药 性、抗 凋 亡 性 和 更 高 的 细 胞 活 力。C u r t i n等7 6在胶原肿瘤支架上测试了顺铂对神经母细胞瘤的治疗效果,获得了与异种移植小鼠一致的药物敏感性,证实了基于3 D肿瘤支架的药物筛选模型的生理意义。3 D载细胞肿瘤支架能够表现出耐药性特征的原因有两点:一是3 D支架可在一定程度上阻碍药物的渗透;二是经3 D肿瘤支架培养的肿瘤细胞具有类似体内肿瘤细胞的耐药性。R i j a l等7 7在脱细胞支架上测试了他莫昔芬和紫杉醇(P T X)的疗效,发现脱细胞支架限制了药物的渗透,因此肿瘤细胞增殖受到的药物抑制作用较小,停止给药时肿瘤细胞又恢复生长。不仅如此,肿瘤支架内沉积的E CM也可以阻碍药物的输送7 8。因此,借助3 D肿瘤支架,可以建立药物浓度梯度以研究药物代谢动力学。传统的化疗对于快速增殖的肿瘤细胞有效,但对于休眠期的肿瘤细胞治疗效果不佳。F a r i n o等7 9通过聚乙二醇水凝胶诱导细胞处于生长或休眠状态,研究发现,处于休眠期的细胞对化疗药物表现出更小的反应,表明3 D肿瘤支架能够对不同时期的肿瘤细胞的药物敏感性进行差异化评估。然而,大部分3 D肿瘤支架由于细胞增殖区域有限,难以长期保持细胞活力,仅能模拟肿瘤发生的单个时间节点或某个阶段。通常使用较短的治疗期(15 d)和预处理培养时间(57 d)进行体外药物试验,但研究肿瘤耐药性的发展和治疗需要长期培养。因此,仍需开发能提供仿生微环境和足够空间的3 D肿瘤支架,从而为长期动态变化的肿瘤行为提供支持。药物开发在很大程度上依赖用于预测临床治疗效果的肿瘤模型,3 D载细胞肿瘤支架成为评估药物疗效的有效工具。天然化合物是新型抗肿瘤药物的一个开发方向。为探究京尼平苷(G E N)对MC F-7的抑制作用,L u等2 8制备了3 D打印的壳聚糖/明胶支架,研究发现,G E N能够基于时间依赖性和剂量依赖性方式抑制MC F-7细胞的增殖,并且3 D支架中肿瘤细胞对药物的敏感性低于2 D培养,但具体的细胞凋亡机制还需做进一步研究。M e n g等8 0在3 D打印支架上测试了免疫毒素靶向效果,研究发现肿瘤细胞数量显著降低,且与异种移植小鼠模型上的药物测试结果一致,证实了3 D肿瘤支架在药物开发中替代动物模型的可行性。T a m等4 2在透明质酸水凝胶平台上同时评估了8 0种激酶抑制剂对细胞侵袭和活力的抑制性,从而确定了潜在的候选药物和靶向治疗基因。然而,用于药物开发的3 D支架仍亟待开发,这些模型不仅要能概括肿瘤的基本要素,还要能以高通量方式实现自动化测试和结果分析。肿瘤治疗还受到肿瘤异质性的挑战,在疾病发展过程 中 还 会 进 一 步 增 加 肿 瘤 间 和 肿 瘤 内 异 质性8 1。设计能够反映不同患者特定临床情况的个性化平台对于治疗方法的开发至关重要。因此,3 D肿瘤支架开发的另一个重点是推进个性化肿瘤治疗,通过概括个体患者肿瘤的遗传和表型异质性,解释影响疾病进展和耐药异质性的关键机制,并为患者提供更具个性化的治疗方案。培养源自患者的肿瘤细胞或肿瘤碎片,要求保持细胞完整性和生物特征,H r i b a r等8 2证明了V e r s a G e l水凝胶支持从人源肿瘤异种移植样本或患者组织中分离出的细胞和肿瘤碎片的生长,且药物治疗反应与患者的临床反应相关。此外,结合来源于患者的G BM肿瘤细胞、血管内皮细胞和来源于脑组织E CM的3 D打印支架,再现了临床上观察到的患者对放化疗的特异性治疗抗性,通过此模型还找到了针对患者的药物组合8 3。另一项研究结合来源于患者的结直肠肿瘤构建3 D水凝胶支架,通过比较对不同化疗药物的敏感性,确定了最适宜该患者的个性化药物及剂量8 4。作为临床前药物开发的有效工具,个性化肿瘤研究 可 借 助 合 适 的3 D肿 瘤 支 架 得 到 进 一 步发展。4 结 语 3 D肿瘤支架有助于理解未知的肿瘤发展和进展过程中的具体机制和影响因素,阐明肿瘤与其微环境之间的相互作用,在药物筛选方面表现出巨大潜力。但目前的3 D肿瘤支架都有各自的局限性,如支架间的性能差异、不透明和厚度对成像带来的挑战,脱细胞基质支架难以进行蛋白质分析。暂时22 第3期傅思佳,等:3 D肿瘤支架的研究进展及其在药物筛选中的应用没有可以解决所有问题的理想型支架。此外,3 D肿瘤支架在制造方案上(如规格和材料)缺乏标准化,这也在一定程度上限制了3 D肿瘤支架的推广应用。而联用不同的3 D肿瘤支架构建技术,以及采用能够模拟真实肿瘤微环境的生物材料构建创新肿瘤支架,有望为肿瘤的异质性研究带来新的发现。同时,应致力于使用患者来源的细胞/肿瘤碎片,以期获得针对特定患者的个性化临床前平台,这对于研究个 体 肿 瘤 进 展 和 实 现 个 性 化 医 疗 具 有 重 要意义。参 考 文 献1W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n.E s t i m a t e d n u m b e r o f n e w c a s e s i n 2 0 2 0,w o r l d w i d e,b o t h s e x e s,a l l a g e sE B/O L.(2 0 2 0-1 2-0 1)2 0 2 1-0 8-1 7.h t t p s:/g c o.i a r c.f r/t o d a y/h o m e.2W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n.G l o b a l h e a l t h e s t i m a t e s(GHE)D B/O L.(2 0 2 0-1 2-0 1)2 0 2 1-0 8-1 7.h t t p s:/w w w.w h o.i n t/h e a l t h i n f o/g l o b a l_b u r d e n_d i s e a s e/e n/.3D E ME L O B A G,J O D A T Y A,C RU Z E M,e t a l.S t r a t e g i e s t o u s e f i b r i n o g e n a s b i o i n k f o r 3 D b i o p r i n t i n g f i b r i n-b a s e d s o f t a n d h a r d t i s s u e sJ.A c t a B i o m a t e r i a l i a,2 0 2 0,1 1 7:6 0-7 6.4KA P A L C Z YN S KA M,KO L E N D A T,P R Z Y B Y L A W,e t a l.2 D a n d 3 D c e l l c u l t u r e s:a c o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t t y p e s o f c a n c e r c e l l c u l t u r e sJ.A r c h i v e s o f M e d i c a l S c i e n c e,2 0 1 8,1 4(4):9 1 0-9 1 9.5L AN GHAN S S A.T h r e e-d i m e n s