草豆蔻与小草蔻的比较鉴别研究.pdf

中药与天然药物草豆蔻与小草蔻的比较鉴别研究邓 静吴婷芬叶梦倩马志国曹晖张英吴孟华(暨南大学药学院暨南大学岭南传统中药研究中心国家中药现代化工程技术研究中心岭南资源分中心广东省中医药信息化重点实验室广东广州 曹晖全国名老中医药专家传承工作室广东广州 云南省曹晖专家工作站云南昆明)摘要:目的 通过比较草豆蔻和小草蔻生药学方面的特征为二者的准确区分提供参考依据方法 采用性状、显微、薄层色谱、高效液相特征图谱以及 分析方法对草豆蔻与小草蔻进行比较结果 草豆蔻种子团明显大于小草蔻每室种子数远大于小草蔻种子横切面观察可见草豆蔻色素层占种皮厚度的比值大于小草蔻可作为二者性状及显微特征的区别点草豆蔻与小草蔻成分差异显著草豆蔻中主要活性成分小豆蔻明、桤木酮、山姜素以及乔松素等均未在小草蔻中检测到草豆蔻挥发油含量在 而小草蔻挥发油含量 且二者挥发性成分的种类和相对含量亦有区别结论 该研究可为草豆蔻与小草蔻的鉴定及深入研究提供科学依据关键词:草豆蔻小草蔻鉴别高效液相特征图谱气相色谱质谱联用技术中图分类号:文献标识码:文章编号:()作者简介:邓 静女()学历:硕士 研究方向:中药质量控制研究通讯作者:张 英 职称:副教授 研究方向:中药资源、中药炮制学、中药材及饮片质量评价研究 吴孟华 职称:副教授 研究方向:岭南传统中药的质量标准与岭南特色中药炮制研究基金项目:广东省重点领域研发计划项目()国家药典委员会编药品标准制修订研究课题()国家重点研发计划项目()广东省基础与应用基础研究基金()曹晖全国名老中医药专家传承工作室(国中医药人教函号)云南省曹晖专家工作站()():海峡药学 年 第 卷 第 期 :草豆蔻为姜科植物草豆蔻 的干燥近成熟种子夏、秋二季采收主要分布在福建、广东、海南、广西、四川、贵州等地区具有燥湿行气温中止呕的功效常用于寒湿内阻脘腹胀满冷痛嗳气呕逆食欲不振等症其药用历史悠久疗效显著亦是常用香料 姜科植物种类繁多性状相近自古以来就常出现草豆蔻与同科属植物混用的情况历版中国药典中记载草豆蔻的拉丁名为 而陈细钦等通过考证发现现今植物学家已将草豆蔻的拉丁学名订正为 查阅中华本草发现其记载的另一种姜科植物小草蔻拉丁学名与修改后的草豆蔻拉丁名相同均为 小草蔻又名直穗山姜主要分布于海南、广东、广西等地性状与草豆蔻相似 年木村雄四郎根据海南本地人称谓所定的草豆蔻拉丁名 在中国植物志中已成为海南山姜 的异名同时植物分类学家将小草蔻 与草豆蔻均归于海南山姜项下 经市场调查发现市售草豆蔻有两种典型的性状一种较大种子团三室中每室种子多数香气浓郁独特来自草豆蔻 另一种较小每室种子数偏少香气较淡来自小草蔻 究其原因与植物学上品种归并有关 故本研究对草豆蔻与小草蔻的性状、显微、薄层色谱、高效液相特征图谱等方面进行比较并采用 法对表征二者香气的挥发油成分进行分析比较从多个角度探究并建立草豆蔻与小草蔻区分的方法旨在为临床用药的准确有效提供保障 仪器与材料 材料 批样品分别购自海南及广西经暨南大学吴孟华副教授鉴定序号、批的草豆蔻样品为姜科植物小草蔻 的干燥近成熟种子其他批次为姜科植物草豆蔻 的干燥近成熟种子样品信息(见表)仪器 生物显微镜(奥林巴斯工业有限公司)平面色谱点样仪(南京迈科理特科学仪器有限公司)型万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)十万 分 之 一 天 平(奥 豪 斯 仪 器 有 限 公 司)型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)液相色谱仪(赛默飞公司)型气相色谱仪(美国安捷伦公司)型质谱仪(美国安捷伦公司)试剂对照品小豆蔻明(批号)、山姜 素(批 号 )、乔 松 素(批 号)、桤木酮(批号)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司含量均 高效硅胶 薄层板(烟台华阳新材料科技有限公司)香草醛(上海麦克林生化科技有限公司)乙腈(赛默飞世尔科技有限公司)为色谱纯、水(华润怡宝饮料(中国)有限公司)为纯净水其余水合氯醛、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、浓硫酸、无水乙醇等均为分析纯表 草豆蔻与小草蔻样品信息表批次名称产地草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南草豆蔻海南小草蔻广西小草蔻广西草豆蔻海南文昌草豆蔻海南文昌草豆蔻海南文昌小草蔻广西小草蔻广西小草蔻广西小草蔻广西小草蔻广西小草蔻广西 方法与结果 性状鉴定 草豆蔻:种子团类球形表面灰绿色至灰褐色直径 黄白色的隔膜将种子团分成 瓣每瓣表面可见种子不少于 粒粘连紧密种子团较光滑 种 子长 直径约 为卵圆状多面体外被淡棕色膜质假种皮种脊为一条纵沟一端有种脐种子沿种脊纵剖两瓣纵断面观呈斜心形 种皮沿种脊向内伸入部分约占整个表面积的/胚乳灰白色 气芳香味辛、辣小草蔻:性状与草豆蔻相似种子团较草豆蔻小类球形直径 种子数较少黄白色的隔膜将种子团分成 瓣每瓣表面可见种子 余粒种子长 直径 气香味辛凉对其中 批草豆蔻及 批小草蔻每瓣表面可见种子数的统计(见表)性状图(见图)由实验结果可知草豆蔻种子团明显大于小草蔻草豆蔻每瓣表面可见种子数基本为 粒以上最高可至 而小草蔻大多为 余粒草豆蔻明显多于小草蔻以剩余 批草豆蔻样品作为验证该方法可准确区分草豆蔻与小草蔻图 样品性状图注:、草豆蔻、小草蔻表 草豆蔻及小草蔻样品种子团每瓣(一个分室)表面可见种子数目统计表()批次每瓣种子数目第一瓣第二瓣第三瓣最大值最小值 显微鉴定 粉末显微特征:取草豆蔻药材粉碎过四号筛 取少量置于载玻片上水合氯醛试液透化后滴加 滴稀甘油置显微镜下观察 可见粉末黄棕色种皮表皮细胞无色或淡黄色表面观呈长条状下皮细胞表面观长多角形或类长方形下层常连有种皮表皮细胞 色素层细胞黄棕色至红棕色易碎裂成不规则色素块 油细胞常散在于色素细胞类圆形或长圆形 内种皮细胞黄棕色或红棕色表面观多边形或类圆形内含硅质块侧面观栅栏状内壁及侧壁极厚胞腔位于一端内含硅质块 外胚乳细胞长方形或多边形充满淀粉粒有的包埋有细小草酸钙方晶 小草蔻与之类似粉末的显微鉴定法无法区分草豆蔻和小草蔻 粉末显微图见图 图 草豆蔻药材粉末显微特征图()注:含硅质块的内种皮细胞(表面观 侧面观)色素层细胞(箭头示油细胞)内胚乳细胞 种皮表皮细胞 油细胞 横切面显微特征:草豆蔻假种皮偶见种皮表皮细胞类圆形下皮为 列薄壁细胞切向延长色素层由数列细胞组成其间散有类圆形油细胞内种皮为 列栅状厚壁细胞内壁与侧壁极厚胞腔小内含硅质块 外胚乳细胞含有淀粉粒有的含有草酸钙方晶小草蔻组织结构与草豆蔻十分类似通过统计色素层(含散在油细胞)占种皮厚度的比值发现草豆蔻色素层(含散在油细胞)占种皮厚度约 平均值为 小草蔻色素层(含散在油细胞)占种皮厚度约 平均值为 结果表明两者有显著性差异草豆蔻色素层(含散在油细胞)占种皮厚度的比值大于小草蔻 横切面图见图 薄层鉴定 草豆蔻薄层鉴定:取草豆蔻和小草蔻样品粉末 (过三号筛)置 离心管中加甲醇 超声(频率 功率 )处理 离心 用 微孔滤膜过滤得供试品溶液 另取草豆蔻对照药材 同法制成对照药材溶液 再取山姜素对照品、乔松素对照品、小豆蔻明对照品与桤木酮对照品加甲醇分别制成浓度为 海峡药学 年 第 卷 第 期的溶液作为对照品溶液 照薄层色谱法(年版中国药典四部通则)试验分别吸取上述溶液各 点于同一硅胶 薄层板上 以正己烷乙酸乙酯甲醇()为展开剂展开取出晾干后置紫外灯()下检视草豆蔻供试品色谱中与对照品及对照药材色谱相应的位置上显相同的条带取出喷以 香草醛硫酸乙醇溶液 加热显色 结果草豆蔻供试品色谱中在与小豆蔻明对照品色谱相应的位置上显相同的橙色条带在与乔松素对照品色谱相应的位置上显相同的红色条带在与桤木酮对照品色谱相应的位置上显相同的黄色条带小草蔻色谱图中未见与对照品相对应的条带 薄层色谱结果见图 图 草豆蔻及小草蔻横切面组织图()注:草豆蔻 小草蔻 假种皮 种皮表皮 下皮细胞 油细胞 色素层 硅质块 内种皮 外胚乳 草豆蔻高效液相特征图谱分析 色谱条件:色谱柱:柱()以乙腈()水()为流动相梯度洗脱()流速 检测波长 柱温 进样量为 对照品溶液的制备:取山姜素对照品、乔松素对照品、小豆蔻明对照品、桤木酮对照品适量精密称定加甲醇分别制成每 含山姜素、桤木酮各 小豆蔻明、乔松素各 的溶液即得 供试品溶液的制备:取样品粉末(过三号筛)置 离心管中加甲醇 超声(频率 功率)处理 离心 取上清液转移于 量瓶中重复提取 次残渣用适量甲醇洗涤离心 合并上清液加甲醇至刻度用 微孔滤膜过滤即得图 草豆蔻及小草蔻代表性薄层色谱图注:紫外灯 检视 日光灯检视 小豆蔻明对照品 乔松素对照品 山姜素对照品 桤木酮对照品 草豆蔻样品()小草蔻样品()草豆蔻对照药材 草豆蔻 特征指纹图谱的建立及评价:分别精密称取 批样品粉末各 按“”项下制备供试品溶液按“”项下制备对照品溶液照“”项下色谱条件进行测定样品及混合对照品色谱图(见图)采用国家药典委员会编“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版)”以草豆蔻样品 的图谱为参照图谱选择多点校正进行匹配 批草豆蔻特征指纹图谱见图 将 批草豆蔻样品色谱峰与参照图谱进行自动匹配生成对照特征图谱(见图)批草豆蔻的指纹图谱中共确定共有峰 个通过与混合对照品色谱图进行比较指认出 号峰为山姜素 号峰为乔松素 号峰为小豆蔻明 号峰为桤木酮 以共有模式为参照通过国家药典委员会编中药指纹图谱相似度评价系统 版计算得到 批草豆蔻药材相似度除 为 、为 、为 、为 外其余相似度均在 表明各批次草豆蔻样品相似度比较高质量较为稳定 同时 批小草蔻与草豆蔻对照图谱的相似度为 可见小草蔻与草豆蔻的成分差异较大 挥发性成分 分析 检测条件:色谱柱()载气 流量 进样口 进样量 分流比为 程序升温初始温度 以 /升至 保持 再以 /升至 保持 最后以 /升至 保持 电离源离子源温度 电子能量 溶剂延迟 质量扫描范围:/图 混合对照品及供试品溶液高效液相色谱图注:空白溶剂 混合对照品 草豆蔻 小草蔻 山姜素 乔松素 小豆蔻明 桤木酮、未知峰图 批草豆蔻药材高效液相色谱图图 草豆蔻高效液相特征图谱共有模式图表 批草豆蔻及 批小草蔻挥发油含量批次油量()挥发油含量()图 草豆蔻与小草蔻挥发性成分的总离子流色谱图注:草豆蔻 小草蔻 水蒸气蒸馏法提取挥发油成分:精密称取药材粉末(过二号筛)加蒸馏水 按 年版中国药典一部附录 挥发油测定法(甲法)提取挥发性成分加热提取 草豆蔻与小草蔻挥发油提取结果统计如表 乙酸乙酯溶解无水 除水后定容至 得供试品溶液冷藏待用 挥发性成分 测定:草豆蔻及小草蔻挥发性成分的总离子流图如图 经 数据库匹配并参考有关文献对检出成分进行定性利用峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对含量结果见表 海峡药学 年 第 卷 第 期表 草豆蔻及小草蔻挥发性成分相对含量比较序号保留时间()化合物分子式相对百分含量()草豆蔻小草蔻()蒎烯()莰烯()()蒎烯()番茄红素()水芹烯()邻聚伞花素()()柠檬烯()桉叶油素()葑酮()芳樟醇()右旋樟脑()异龙脑()冰片()异蒲勒醇()松油醇()羟基月桂酸()松油醇()紫菌红素乙()苄基丙酮()甘油三亚油酸酯()香叶醇()癸醇()乙酸冰片酯()反式苯亚甲基丙酮()()异喇叭烯()反式肉桂酸甲酯()六氢二甲基异丙基薁()乙酸癸酯()()异丁香烯()石竹烯()二十二碳六烯酸甘油三酯()()律草烯()杜松烯()橙花叔醇()()愈创醇()()()()环氧化蛇麻烯()()法尼醇()乙酸法尼酯()注:“”为未检测到 根据实验结果可知草豆蔻挥发油含量在 而小草蔻挥发油含量 草豆蔻挥发油含量明显高于小草蔻以剩余 批草豆蔻样品作为验证证明该鉴别点能准确区分草豆蔻与小草蔻 对挥发油成分进行 分析草豆蔻挥发油中共鉴定出 种化合物(仅统计相对含量高于 的化合物)其中法尼醇()、六氢 二 甲 基异 丙 基 薁()、桉 叶 油 素()、律草烯()为主要特征成分小草蔻挥发 油中共鉴定出 种化合物其中 律草烯()、反式肉桂酸甲酯()、芳樟醇()为主要特征成分草豆蔻与小草蔻中均检测到的化合物仅有 种可见二者挥发性成分种类和相对含量存在较大差异 讨论 性状及显微鉴定 年版中国药典对于草豆蔻种子团表面颜色性状描述为灰褐色而在实际的性状鉴别中发现其表面呈灰绿色至灰褐色药典的描述与实际样品有所不同目前已完成药典性状修订的研究和复核工作将向药典委员会提出修改建议建议下一版将现有描述“灰褐色”修订为“灰绿色至灰褐色”根据性状鉴别及显微鉴别的结果可知种子团的大小及草豆蔻每瓣表面可见种子数是区分草豆蔻与小草蔻的主要鉴别点 此外草豆蔻色素层(含散在油细胞)占种皮厚度的比值大于小草蔻草豆蔻含有更丰富的油细胞这可能是草豆蔻挥发油含量明显高于小草蔻的原因之一 薄层鉴定 在薄层色谱鉴别研究中参考 年版中国药典以及相关文献分别比较了甲苯 乙酸乙酯 甲醇()、甲苯:乙酸乙酯:甲醇:丙酮()以及正己烷乙酸乙酯甲醇()展开系统结果表明正己烷 乙酸乙酯甲醇()展开条件下斑点清晰且分离度较好对不同的点样量、进行考察发现点样量为 时斑点清晰且不拖尾 此外比较了 三氯化铁乙醇溶液和 香草醛硫酸乙醇溶液两种显色剂的显色效果结果表明 香草醛硫酸乙醇溶液显色效果更佳斑点区分更明显根据薄层鉴定的结果可知草豆蔻中小豆蔻明、山姜素、乔松素、桤木酮等重要成分均未在小草蔻中检测到 草豆蔻 特征图谱结果分析本研究建立 批草豆蔻药材的特征图谱绝大部分样品相似度可达 以上表明草豆蔻各批次药材质量较为稳定其中有 批草豆蔻相似度为 推测可能是近缘种的花粉污染所导致有待进一步的研究 此外比较草豆蔻和小草蔻的高效液相色谱图可知草豆蔻与小草蔻的色谱图完全不同二者成分迥异 草豆蔻与小草蔻挥发性成分比较分析草豆蔻挥发油含量明显高于小草蔻该鉴别点能准确区分草豆蔻与小草蔻对挥发油成分进行 分析发现草豆蔻与小草蔻挥发性成分种类和相对含量存在较大差异 此外本研究中鉴定出的草豆蔻挥发性成分大部分与文献报道相一致但有文献中含量较高的成分如聚伞花烃、苯基丁酮等未检出可能与挥发性成分的提取方法样品产地不同等因素有关综上所述本研究通过性状、显微、薄层、指纹图谱、分析等手段对草豆蔻与小草蔻进行了比较研究为区分二者建立了全面、有效、直观的检测方法 根据薄层鉴定及高效液相指纹图谱分析的结果可知草豆蔻含有的在抗炎抗菌、镇吐、抗肿瘤方面具有较好药理活性的成分如山姜素、小豆蔻明、桤木酮等并未在小草蔻中检测到 二者成分差异显著功效亦会有所不同 此外挥发油亦是草豆蔻的重要药效成分之一而草豆蔻与小草蔻在挥发油含量及成分种类上均有显著差别可见从生药学的角度来看小草蔻并不具备草豆蔻的药学特性植物学家将二者归为同一项下可能造成品种混用存在用药安全的隐患缺乏合理性参考文献国家药典委员会编 中国药典(一部)北京:中国医药科技出版社吴孟华郭平陈虎彪等 豆蔻类中药的本草新析 中国中药杂志():陈细钦冯剑詹志来等 经典名方中豆蔻类中药的本草考证 中国实验方剂学杂志():国家中医药管理局中华本草编委会 中华本草 上海:上海科学技术出版社:中国科学院中国植物志编辑委员会 中国植物志(第 卷)北京:科学出版社于萍崔兆杰邱琴等 草豆蔻挥发油化学成分的/研究 中国现代应用药学():王睿张雨佳冯雪松 /法测定草豆蔻中桤木酮的含量 时珍国医国药():王萍石海莲吴晓俊 中药草豆蔻抗肿瘤化学成分和作用机制研究进展 中国药理学与毒理学杂志():吴秀丽段红叶李建玲等 草豆蔻主要活性成分与人血浆作用的差异蛋白鉴定 中医药导报():申德堰陈永顺 草豆蔻挥发油的抗炎作用研究 中国药业():吴珍陈永顺杜士明等 草豆蔻挥发油对大鼠醋酸性胃溃疡的影响 中国医院药学杂志():海峡药学投稿网址:.海峡药学 年 第 卷 第 期