实验过氧化物酶活性的测专家讲座.pptx

2024/11/1 周五一、试验目标一、试验目标1.学习红薯过氧化物酶制备方法。学习红薯过氧化物酶制备方法。2.掌握过氧化物酶反应原理及测掌握过氧化物酶反应原理及测定方法。定方法。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第1页页2024/11/1 周五二、试验原理二、试验原理 1、过氧化物酶（简称、过氧化物酶（简称POD)介绍介绍 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高一个酶。它与呼吸作用、光合作用及生长较高一个酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素氧化等都相关系。在植物生长发育过程中它素氧化等都相关系。在植物生长发育过程中它活性不停发生改变。普通老化组织中活性较高，活性不停发生改变。普通老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含一些碳水化合物转化成木质素，使组织中所含一些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发觉早衰减产水稻根系增加木质化程度，而且发觉早衰减产水稻根系中过氧化物酶活性增加，所以过氧化物酶可作中过氧化物酶活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化一个生理指标。另外，过氧化物同为组织老化一个生理指标。另外，过氧化物同工酶在遗传育种中主要作用也正在受到重视。工酶在遗传育种中主要作用也正在受到重视。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第2页页2024/11/1 周五2酶活力测定酶活力测定(1)酶活力酶活力 表示酶量多少不能像普通物质那样，用重量表示酶量多少不能像普通物质那样，用重量(g)或体积或体积(ml)。因为酶是一个生物催化剂。酶存。因为酶是一个生物催化剂。酶存在和含量多少应表达在催化能力大小，即用酶在和含量多少应表达在催化能力大小，即用酶活力活力(活性活性)表示。表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应能力。催化能力强能力。催化能力强(大大)，酶活力就高，酶活力就高(大大)，也表，也表示酶量多。酶本身重量不能说明酶实际含量多示酶量多。酶本身重量不能说明酶实际含量多少。一样重量酶，酶活力能够不一样，活力高，少。一样重量酶，酶活力能够不一样，活力高，价值就大。价值就大。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第3页页2024/11/1 周五(2)酶促反应速度酶促反应速度酶活力详细用它所催化某一化学反应反应速度来酶活力详细用它所催化某一化学反应反应速度来表示，即在最适条件下表示，即在最适条件下(最适最适pH、最适、最适T)酶催化酶催化反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶活反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶活力就愈低。所以测定酶活力力就愈低。所以测定酶活力(实质上就是酶定量实质上就是酶定量)测定就是测定酶促反应速度测定就是测定酶促反应速度(用用v表示表示)。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物降低许或产物增加量来表示。单位：浓度降低许或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时单位时间间惯用产物增加量表示，因为它从无到有，改变显惯用产物增加量表示，因为它从无到有，改变显著。酶促反应随时间增加，产物增加。著。酶促反应随时间增加，产物增加。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第4页页2024/11/1 周五若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应速度曲线。速度曲线。Vmax时间时间产产物物生生成成量量斜率浓度斜率浓度/时间时间V实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第5页页2024/11/1 周五从图可知，反应速度只在最初一段时间内保从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，伴随反应时间延长，酶反应速度逐持恒定，伴随反应时间延长，酶反应速度逐步下降。引发下降原因很多，如底物浓度降步下降。引发下降原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应进行，产低，产物浓度增加而加速了逆反应进行，产物对酶有抑制作用等。所以研究酶反应速度物对酶有抑制作用等。所以研究酶反应速度以酶促反应初速度为准，即酶促反应最初一以酶促反应初速度为准，即酶促反应最初一段时间，产物呈线性增加时反应速度。详细段时间，产物呈线性增加时反应速度。详细指酶促反应速度曲线斜率。指酶促反应速度曲线斜率。即从原点对曲线即从原点对曲线作切线，求切线斜率作切线，求切线斜率(v)=浓度浓度/时间时间实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第6页页2024/11/1 周五因为产物从无到有，只要方法灵敏，可因为产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量方法很多：准确测定。测定产物增加量方法很多：化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。化学等。物理方法：物理方法：UV吸收、荧光等。吸收、荧光等。同位素方法等。同位素方法等。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第7页页2024/11/1 周五(3)酶活力单位酶活力单位表示酶活力大小，也就是酶量大小单位称酶表示酶活力大小，也就是酶量大小单位称酶活力单位活力单位(U)。国际单位国际单位(IU)定义：定义：1个酶活力单位，是指个酶活力单位，是指在特定条件下，在在特定条件下，在1分钟内能转化分钟内能转化1微摩尔微摩尔(mol)底物酶量，或是转化底物酶量，或是转化1微摩尔底物中相微摩尔底物中相关基团酶量。关基团酶量。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第8页页2024/11/1 周五3、测定原理、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类反应，过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类反应，产物为醌类化合物，此化合物深入缩合或产物为醌类化合物，此化合物深入缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深化合物。与其它分子缩合，产生颜色较深化合物。本试验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为本试验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶底物，在此酶存在下，过氧化物酶底物，在此酶存在下，H2O2可可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色4-邻甲氧基苯邻甲氧基苯酚，其反应为：酚，其反应为：实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第9页页2024/11/1 周五本试验用紫外吸收法测定产物本试验用紫外吸收法测定产物4邻甲氧基苯酚在邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收-时间速度曲时间速度曲线，求出曲线斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活线，求出曲线斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活力。力。4实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第10页页2024/11/1 周五2134567800 2 4 6 8反应时间（分钟）生成物光吸收0.400.300.200.10实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第11页页2024/11/1 周五2.pH对酶促反应速度影响对酶促反应速度影响(1)影响酶促反应速度原因影响酶促反应速度原因*底物浓度底物浓度 米氏公式米氏公式*温度温度*酶浓度酶浓度*激活剂、抑制剂激活剂、抑制剂*pH实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第12页页2024/11/1 周五(2)pH对酶促反应速度影响对酶促反应速度影响大多数酶活力受其环境大多数酶活力受其环境pH影响。这是因为影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些基团解离，影响底物分子和酶分子中一些基团解离，这些基团离子化状态关系到底物与酶结合、这些基团离子化状态关系到底物与酶结合、酶专一性和酶活性中心构象。通常各种酶酶专一性和酶活性中心构象。通常各种酶只有在一定只有在一定pH范围内才含有活性，并在一范围内才含有活性，并在一定定pH下，酶促反应含有最大反应速度，此下，酶促反应含有最大反应速度，此pH称最适称最适pH，高于或低于此值反应速度都，高于或低于此值反应速度都下降。下降。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第13页页2024/11/1 周五如将反应速度对如将反应速度对pH作曲线，经典呈钟罩形，作曲线，经典呈钟罩形，但不一样酶受但不一样酶受pH影响是不一样，所以会有影响是不一样，所以会有不一样形状，有只有钟罩形二分之一，有则不一样形状，有只有钟罩形二分之一，有则是一直线，即受是一直线，即受pH影响不大。影响不大。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第14页页2024/11/1 周五木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胆碱脂酶胆碱脂酶实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第15页页2024/11/1 周五不一样酶最适不一样酶最适pH也不一样，如胃蛋白酶为也不一样，如胃蛋白酶为pH 1.5-2.5、胰蛋白酶为、胰蛋白酶为pH 8。但应注意。但应注意最适最适pH不是特征常数，对于同一个酶，其不是特征常数，对于同一个酶，其最适最适pH因底物种类、浓度及缓冲液成份不因底物种类、浓度及缓冲液成份不一样而有差异，所以酶最适一样而有差异，所以酶最适pH并不是一个并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。普通常数，只是在一定条件下才有意义。普通最适最适pH在在6-8之间。之间。因为酶活力受因为酶活力受pH影响很大，所以在测定酶影响很大，所以在测定酶活力时，活力时，pH必须恒定，所以测活反应最好必须恒定，所以测活反应最好在缓冲液体系中进行。在缓冲液体系中进行。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第16页页2024/11/1 周五本试验测定三亇不一样本试验测定三亇不一样pH下过氧化物酶下过氧化物酶时间光吸收关系曲线，比较三亇不一时间光吸收关系曲线，比较三亇不一样样pH(6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力条件对过氧化物酶活力影响。影响。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第17页页2024/11/1 周五三、试验操作三、试验操作1、过氧化物酶粗品液制备、过氧化物酶粗品液制备称取红薯材料称取红薯材料1g，加少许石英砂及，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（2ml左右左右)，于研钵中研磨成匀浆。于研钵中研磨成匀浆。再加入再加入3ml磷酸缓冲液浸提磷酸缓冲液浸提20分钟后，以分钟后，以6000r/min离心离心15分钟。分钟。倾出上清液并过滤，然后转入倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。定容，摇匀后，贮于冷处备用。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第18页页2024/11/1 周五2、酶活力测定酶活力测定 (1)取取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作：只比色杯洗净控干，按以下步骤操作：用移液管吸收用移液管吸收0.1 mol/L反应液反应液(pH 6.0)2.9mL 加入比色杯中。加入比色杯中。放入紫外分光光度计比色杯架内，按放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按，出现插入空白，按ok，仪器自动调零。调零，仪器自动调零。调零完成后按完成后按start，出现插入样品。，出现插入样品。(2)取出比色杯，取出比色杯，1人加酶液人加酶液(L)，先加，先加20 L，另另1人同时按人同时按ok开始计时，加酶后盖上硫酸纸，开始计时，加酶后盖上硫酸纸，按紧混匀，按紧混匀，30秒内放入比色杯架内，仪器每秒内放入比色杯架内，仪器每30秒自动统计光吸收值秒自动统计光吸收值A470nm。(3)按数据处理中数据打印，显示按数据处理中数据打印，显示8个数据，统个数据，统计数据。计数据。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第19页页2024/11/1 周五(4)操作关键点：操作关键点：*关键是酶稀释倍数和酶量多少要适当，使关键是酶稀释倍数和酶量多少要适当，使A470nm在在0.20.4/min，即第，即第1个个30秒秒A470nm在在0.1-0.2。过低过高都应增加或降。过低过高都应增加或降低酶量重新做。低酶量重新做。*加酶后应快速摇匀，马上计算时间，加酶后应快速摇匀，马上计算时间，2人人要配合好，计时不能提前或推后，不然曲要配合好，计时不能提前或推后，不然曲线不是从原点开始。线不是从原点开始。*每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水冲洗冲洗5遍以上，确保不残留上次溶液，不然遍以上，确保不残留上次溶液，不然影响测定。影响测定。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第20页页2024/11/1 周五四四.数据处理数据处理1.用坐标纸作出时间用坐标纸作出时间 A470nm曲线，过原曲线，过原点在直线部分作切线，求斜率点在直线部分作切线，求斜率A470nm/min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 时间时间/min 10.80.60.40.2A470nm实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第21页页2024/11/1 周五2.代入下式计算酶活力代入下式计算酶活力 A470nm/minVPOD活力单位（活力单位（mol/min）=L A470nm/min3 mL =26.6 mL/mol cmcm A470nm 3 =(mol/min)26.6V 反应液体积反应液体积(mL)产物产物4邻甲氧基苯酚摩尔消光系数邻甲氧基苯酚摩尔消光系数26.6 L/mmolcm 即即26.6 mL/molcm)L 比色杯光径比色杯光径(1cm)实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第22页页2024/11/1 周五试验三试验三 POD蛋白浓度测定蛋白浓度测定 和比活力计算和比活力计算 实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第23页页2024/11/1 周五一一.试验目标试验目标1.学习学习Folin酚法（酚法（Lowry法）测法）测定定POD蛋白浓度原理和方法蛋白浓度原理和方法2.掌握比活力计算方法掌握比活力计算方法实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第24页页2024/11/1 周五二二.试验原理试验原理1Folin酚法原理酚法原理 Folin酚试剂由两种试剂组成：酚试剂由两种试剂组成：甲试剂：双缩脲试剂甲试剂：双缩脲试剂 尿素加热至尿素加热至180左右，两分子尿素缩左右，两分子尿素缩合放出一分子氨，而形成双缩脲。合放出一分子氨，而形成双缩脲。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第25页页2024/11/1 周五 NH2 NH2 C=O C=O NH2 180 NH +NH3 NH2 C=O C=O NH2 NH2实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第26页页2024/11/1 周五双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒石酸钾钠石酸钾钠-CuSO4）络合生成复杂）络合生成复杂紫红色化合物。紫红色化合物。蛋白质分子中肽键（蛋白质分子中肽键（CONH）与双缩脲结构相同，也有双缩脲）与双缩脲结构相同，也有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质含量成反应，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，所以全部蛋白质或二肽以上正比，所以全部蛋白质或二肽以上多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白质定性、定量分析。质定性、定量分析。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第27页页2024/11/1 周五 甲试剂实质是利用蛋白质中肽甲试剂实质是利用蛋白质中肽键反应进行定量测定，它与蛋键反应进行定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸特异性影响即受蛋白质氨基酸特异性影响较少。但灵敏度较低，较少。但灵敏度较低，mg级水级水平，平，010 mg/mL作标准曲线。作标准曲线。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第28页页2024/11/1 周五 乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠（钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生。（钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生。钼酸钠（钨酸钠）钼酸钠（钨酸钠）HCl 碱性碱性 H3PO4 +钼酸（钨酸）钼酸（钨酸）磷钼酸磷钼酸 钼兰（钨兰）钼兰（钨兰）（磷钨酸）还原剂（磷钨酸）还原剂 实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第29页页2024/11/1 周五 H3PO4 +12H2MoO4 H3Mo12PO40+12H2O 碱性还原剂 Mo2O3MoO3 兰色实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第30页页2024/11/1 周五 Folin酚试剂最初由酚试剂最初由Folin等于等于1912年年提出，当初只有乙试剂应用于酚类提出，当初只有乙试剂应用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。因测定，以后才用于蛋白质测定。因为为Tyr酚基也能起还原剂作用，呈兰酚基也能起还原剂作用，呈兰色反应，因而被利用于测定蛋白质，色反应，因而被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是利用正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋白质中蛋白质中Tyr、Try、Cys等含有还原等含有还原性氨基酸残基作用进行测定，灵敏性氨基酸残基作用进行测定，灵敏度高，不过以后发觉有些缺点，出度高，不过以后发觉有些缺点，出现不少改良方法。现不少改良方法。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第31页页2024/11/1 周五 1951年年Lowry（劳里）在（劳里）在 Folin酚试剂酚试剂 中中引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为如今广泛被使用如今广泛被使用Lowry法。法。为何要作这么改良？为何要作这么改良？Folin酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质中中Tyr、Trp等氨基酸残基反应，而对于等氨基酸残基反应，而对于不一样种类蛋白质，因为它们之间氨基不一样种类蛋白质，因为它们之间氨基酸组成不一样，在呈色反应中就会有差酸组成不一样，在呈色反应中就会有差异，影响试验准确度，即受蛋白质特征异，影响试验准确度，即受蛋白质特征影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反应，不受氨基酸组成影响。应，不受氨基酸组成影响。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第32页页2024/11/1 周五 引入双缩脲试剂后，含有两种试剂双重引入双缩脲试剂后，含有两种试剂双重作用，相互补充，结果大大增加了反应作用，相互补充，结果大大增加了反应灵敏度和准确度。灵敏度和准确度。Lowry法较双缩脲灵法较双缩脲灵敏度提升敏度提升100倍，较倍，较UV法灵敏法灵敏1020倍。倍。Folin酚（酚（Lowry）法，灵敏度高，操）法，灵敏度高，操作简单，快速，不需要特殊仪器，惯用作简单，快速，不需要特殊仪器，惯用作蛋白质定量测定，文件引用最多。作蛋白质定量测定，文件引用最多。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第33页页2024/11/1 周五 方法方法 灵敏度灵敏度 时间时间 原理原理 干扰物质干扰物质 说明说明凯氏定氮法凯氏定氮法（Kjedahl法）法）灵敏度低，适灵敏度低，适用于用于0.21.0mg/ml氮，误差为氮，误差为 2费时费时 810小时小时蛋白质（平均含氮蛋白质（平均含氮量量16）经过硫酸）经过硫酸消化，强碱碱化，消化，强碱碱化，吸收并滴定，准确吸收并滴定，准确测定氮量测定氮量非蛋白氮（可用非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）白质而分离）用用 于于 标标 准准蛋白质蛋白质含含 量量 准准 确确测测定定；干干 扰扰少；费少；费时太长时太长双缩脲法双缩脲法（Biuret法）法）灵敏度低灵敏度低310nm比色比色0.11.0mg/ml540nm比色比色110mg/ml中速中速 2030分钟分钟多肽键碱性多肽键碱性Cu2紫色络合紫色络合物物硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；一一 些些 氨氨 基基酸酸用于快速测定，用于快速测定，但不太灵敏；不但不太灵敏；不同蛋白质显色相同蛋白质显色相似似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏0.11.0mg/ml快速快速 510分钟分钟蛋蛋白白质质中中酪酪氨酸氨酸和和色色氨氨酸酸残残基在基在280nm处处光吸收光吸收各种嘌吟和嘧各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸啶；各种核苷酸用用 于于 层层 析析柱流出柱流出液液 检检 测测；核酸核酸吸吸 收收 能能 够够校正校正Folin酚试剂酚试剂法（法（Lowry法）法）灵敏度高灵敏度高0.035 g慢速慢速 4060分钟分钟双缩脲反应；磷钼双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被酸磷钨酸试剂被Tyr和和Phe还原还原硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；甘氨酸；甘氨酸；各种硫醇各种硫醇花花 费费 时时 间间长；操长；操作作 要要 严严 格格计时；计时；颜颜 色色 深深 浅浅随不一样随不一样蛋蛋 白白 质质 改改变变考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法(Bradford法法)灵敏度最高灵敏度最高15 g快速快速515分钟分钟考马斯亮蓝染料与考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其蛋白质结合时，其 max由由465nm变变为为595nm强碱性缓冲液；强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好方法；最好方法；干干扰扰物物质质少；少；颜色稳定；颜色稳定；颜颜色色深深浅浅随不一样随不一样蛋蛋 白白 质质 改改变变2、蛋白质定量测定、蛋白质定量测定实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第34页页2024/11/1 周五3.比活力概念比活力概念比较不一样重量或不一样蛋白含量酶活力并无实比较不一样重量或不一样蛋白含量酶活力并无实际意义，不一样酶或同一个酶在不一样情况下比际意义，不一样酶或同一个酶在不一样情况下比较应有一个重量标准，于是产生出另一个酶主要较应有一个重量标准，于是产生出另一个酶主要参数参数比活力。比活力。比活力比活力 指单位质量酶蛋白所含有酶活力指单位质量酶蛋白所含有酶活力单位单位 酶活力单位酶活力单位/mg酶蛋白酶蛋白 (IU/mg酶蛋白酶蛋白)比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用数据，用来比较单位重量酶蛋白催化能力数据，用来比较单位重量酶蛋白催化能力(即酶活即酶活力大小力大小)。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第35页页2024/11/1 周五 比活力实际意义比活力实际意义 能够说明酶质量好坏，纯度高低。能够说明酶质量好坏，纯度高低。不一样酶比较时，比活力高，说明其质量好，纯不一样酶比较时，比活力高，说明其质量好，纯度高；对同一个酶，能够比较不一样批次质量和度高；对同一个酶，能够比较不一样批次质量和纯度。在酶生产制备过程，考查比活力尤为主要，纯度。在酶生产制备过程，考查比活力尤为主要，伴随该酶不停被提纯，它比活力升高，说明酶逐伴随该酶不停被提纯，它比活力升高，说明酶逐步被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含步被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含量也很高量也很高(杂蛋白多杂蛋白多)，比活力低。纯化后即使总活，比活力低。纯化后即使总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而降低，使比活力升高。酶愈纯，比活力愈高，比降低，使比活力升高。酶愈纯，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，所以比活力用以活力不再升高，酶就相当纯了，所以比活力用以衡量生产工艺优劣、生产效率高低。它是一个很衡量生产工艺优劣、生产效率高低。它是一个很有实际用途参数，是经常要测定数据。有实际用途参数，是经常要测定数据。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第36页页2024/11/1 周五三、操作步骤三、操作步骤每人取每人取1 16 6支试管，按下表平行操作支试管，按下表平行操作：12345678标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液/mL 00.10.20.30.40.5待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液/mL 0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲试剂甲试剂/mL 2.52.52.52.52.52.52.52.5混匀，于室温放置混匀，于室温放置10min 乙试剂乙试剂/mL 0.250.250.250.250.250.250.250.25快快速速混混匀匀，室室温温放放置置30min后后，以以dH2O为为空空白白，在在640nm处处比色比色 A640nm(1)A640nm(2)A640nm 实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第37页页2024/11/1 周五*标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白(150g/mL)。*侍测样品侍测样品x为为POD酶原液，轻轻倒置摇匀后酶原液，轻轻倒置摇匀后用注射器加用注射器加50L(0.050 mL)，去离子水加，去离子水加0.450 mL。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第38页页2024/11/1 周五2.注意事项：注意事项：*定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使用移液管。用移液管。*乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条件下与蛋白质反应，生成碱性铜件下与蛋白质反应，生成碱性铜-蛋白质络合物蛋白质络合物溶液，所以在加入乙试剂后，应快速摇匀溶液，所以在加入乙试剂后，应快速摇匀(用振用振荡器荡器)，使还原反应发生在磷钼酸，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂被破坏之前。加一管摇一管，直接取被破坏之前。加一管摇一管，直接取0.25mL吹吹下，二人可合作，乙试剂比重大，一定要摇起下，二人可合作，乙试剂比重大，一定要摇起来。来。*待测样品所取体积应使其浓度在标准曲线范围待测样品所取体积应使其浓度在标准曲线范围内。内。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第39页页2024/11/1 周五四四.数据处理数据处理1.制作标准曲线制作标准曲线以标准蛋白质含量以标准蛋白质含量(15,30,45,60,75g)作横座标，每管减空白光吸收值作横座标，每管减空白光吸收值(A640nm)作纵座标，过原点作直线。作纵座标，过原点作直线。实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第40页页2024/11/1 周五 2.计算样品计算样品(POD)蛋白质浓度蛋白质浓度 依据依据7号待测样品管光吸收值从曲线上查出对号待测样品管光吸收值从曲线上查出对应蛋白质含量代入下式：应蛋白质含量代入下式：7号样品对应蛋白质含量号样品对应蛋白质含量(g)103C POD (mg/mL)=样品体积样品体积(0.050 mL)实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第41页页2024/11/1 周五3.计算比活力计算比活力 POD比活力（比活力（mol/min/mg蛋白质）蛋白质）酶活力单位酶活力单位 =酶活力测定所用酶蛋白量酶活力测定所用酶蛋白量 酶活力单位酶活力单位(IU)=C POD(mg/mL)(0.020 0.200)mL 实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第42页页2024/11/1 周五注意：注意：用用Folin酚法测出是酚法测出是酶原液酶原液蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mL），），而计算比而计算比活力时所用酶蛋白量应是酶原液蛋活力时所用酶蛋白量应是酶原液蛋白质浓度（白质浓度（mg/mL）实际测定时实际测定时用该酶体用该酶体(0.0200.200)mL 实验过氧化物酶活性的测专家讲座实验过氧化物酶活性的测专家讲座第第43页页