实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座.pptx

试验目标试验目标能够说出蛋白质变性、凝固反应原理及试验方法能够说出蛋白质变性、凝固反应原理及试验方法能够说出蛋白质沉淀反应原理及试验方法能够说出蛋白质沉淀反应原理及试验方法能够利用盐析法及重金属沉淀法能够利用盐析法及重金属沉淀法实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第1页主要试验内容主要试验内容蛋白质加热变性凝固蛋白质加热变性凝固蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应蛋白质盐析蛋白质盐析重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质生物碱试剂沉淀蛋白质生物碱试剂沉淀蛋白质实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第2页蛋白质变性蛋白质变性(denaturation)在一些理化原因作用下，蛋白质严格空间结构被破在一些理化原因作用下，蛋白质严格空间结构被破坏（不包含肽键断裂），从而引发若干理化性质和生物坏（不包含肽键断裂），从而引发若干理化性质和生物学性质改变现象。学性质改变现象。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第3页 变性后蛋白质称变性后蛋白质称变性蛋白变性蛋白,能使蛋白质变性物能使蛋白质变性物质叫质叫蛋白质变性剂蛋白质变性剂。变性原因变性原因物理原因物理原因高温高温、高压、高压紫外线、紫外线、X射线、射线、电离辐射和超声波等电离辐射和超声波等化学原因化学原因强酸、强碱强酸、强碱有机溶剂、有机溶剂、重金属盐重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、分子量不变）。分子量不变）。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第4页变性可逆性变性可逆性可逆变性：除去变性原因，蛋白质空间结构能可逆变性：除去变性原因，蛋白质空间结构能够恢复原状。够恢复原状。不可逆变性：除去变性原因，蛋白质空间结构不可逆变性：除去变性原因，蛋白质空间结构不能恢复原状。不能恢复原状。利用利用毁灭病原微生物毁灭病原微生物蛋白质制剂保留蛋白质制剂保留保护体内蛋白质保护体内蛋白质防止防止实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第5页 蛋白质分子颗粒大小蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间之间,属胶体属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定胶体。颗粒范围，在溶液中能形成稳定胶体。原因原因蛋白质胶体性质及沉淀蛋白质胶体性质及沉淀:表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷斥力表面同种电荷斥力 除去这两个原因，就会发生沉淀。蛋白质分除去这两个原因，就会发生沉淀。蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出现象称为子相互聚集而从溶液中析出现象称为沉淀沉淀。+实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第6页+-蛋白质胶体颗粒沉淀 带正电荷蛋白质带负电荷蛋白质在等电点蛋白质酸酸酸酸碱碱碱碱脱水脱水脱水脱水脱水脱水不稳定蛋白质颗粒 （沉淀）带正电荷蛋白质 （疏水胶体）带负电荷蛋白质 （疏水胶体）碱碱酸酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）-实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第7页可逆沉淀可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀结构和性质都不变结构和性质都不变适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解是分离和纯化基本方法是分离和纯化基本方法结构和性质都发生改变结构和性质都发生改变沉淀不再溶解于水沉淀不再溶解于水蛋白质沉淀蛋白质沉淀实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第8页蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固凝固。不可逆变性状态不可逆变性状态蛋白质凝固蛋白质凝固实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第9页蛋白质变性、沉淀与凝固关系蛋白质变性、沉淀与凝固关系变性属于蛋白质本质改变，沉淀和凝固属于一变性属于蛋白质本质改变，沉淀和凝固属于一个现象个现象变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀才沉淀变性蛋白易于沉淀，变性蛋白易于沉淀，沉淀蛋白不一定变性沉淀蛋白不一定变性沉淀变性蛋白质也不一定凝固沉淀变性蛋白质也不一定凝固实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第10页蛋白质加热变性凝固蛋白质加热变性凝固蛋白质分子受蛋白质分子受热热作用，分子空间结构改变，疏作用，分子空间结构改变，疏水基团暴露于分子表面，溶解度降低。水基团暴露于分子表面，溶解度降低。当蛋白质分子当蛋白质分子不带电荷不带电荷（处于（处于等电点等电点条件下），条件下），则蛋白质发生聚集则蛋白质发生聚集出现沉淀；出现沉淀；当蛋白质当蛋白质分子带电分子带电（处于（处于非等电点非等电点条件下），条件下），则蛋白质因静电排斥作用而则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀不出现沉淀；实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第11页试验内容试验内容 取三只小玻璃试管，各加入取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液蛋白质溶液10d，分别标识为分别标识为1、2和和3号管；号管；1.向向1号管号管中加入：中加入：pH4.8缓冲液缓冲液10d。混匀，于酒精灯。混匀，于酒精灯上迟缓加热至沸点，观察改变（上迟缓加热至沸点，观察改变（）；）；高温下，蛋白质发生不可逆变性并凝固。高温下，蛋白质发生不可逆变性并凝固。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第12页2.向向2号管号管中加入：中加入：H2O 8d,0.1mol/L HCl 2d。混匀，。混匀，于酒精灯上迟缓加热至沸点，观察改变（于酒精灯上迟缓加热至沸点，观察改变（）停顿加热，向停顿加热，向2号管号管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/L NaCO3。摇匀后继续滴加，摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停顿。一旦出现絮状物即停顿。将将2号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）冷却后，再加入：冷却后，再加入：0.1mol/L HCl 2d。观察现象（。观察现象（）蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀；沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第13页3.向向3号管号管中加入：中加入：H2O 8d,0.1mol/L NaOH 2d。混匀，。混匀，于酒精灯上迟缓加热至沸点，观察改变（于酒精灯上迟缓加热至沸点，观察改变（）；）；停顿加热，向停顿加热，向3号管号管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/L HAC。一。一旦出现絮状物即停顿。旦出现絮状物即停顿。继续滴加：继续滴加：0.1mol/L HAC 1d。观察现象（。观察现象（）将将3号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）向向3号管中加入：号管中加入：0.1mol/L NaOH。一旦出现絮状物。一旦出现絮状物即停顿。即停顿。将将3号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）冷却后，再加入：冷却后，再加入：0.1mol/L NaOH 2d。观察现象（。观察现象（）蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第14页蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应蛋白质蛋白质盐析盐析一定浓度中性盐一定浓度中性盐（(NH4)2SO4、Na2SO4等）可去等）可去除蛋白质分子所带电荷及其表面水化层，从而使蛋除蛋白质分子所带电荷及其表面水化层，从而使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白质从溶液中沉淀出来方法为质从溶液中沉淀出来方法为盐析盐析。不一样蛋白质盐析时所需盐浓度不一样，能够经过不一样蛋白质盐析时所需盐浓度不一样，能够经过不一样浓度盐溶液分离不一样蛋白质，就是不一样浓度盐溶液分离不一样蛋白质，就是分段盐分段盐析析。大部分蛋白质都可用大部分蛋白质都可用饱和饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。溶液盐析出来。一些蛋白质在一些蛋白质在半饱和半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。溶液中析出。盐析是一个盐析是一个可逆沉淀反应可逆沉淀反应。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第15页试验内容试验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入等体积加入等体积饱和饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置溶液，混匀后静置3min。观察现象（观察现象（）对该溶液进行过滤，将滤液搜集于一只洁净试管中，对该溶液进行过滤，将滤液搜集于一只洁净试管中，取部分转入另一只试管中；取部分转入另一只试管中；向一只试管中加入向一只试管中加入结晶结晶(NH4)2SO4粉末粉末，直到粉末不，直到粉末不再溶解（成为再溶解（成为饱和饱和(NH4)2SO4溶液）；溶液）；比较两只试管现象（比较两只试管现象（）实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第16页蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶性在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。蛋白盐而沉淀。试验内容试验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀；，混匀；逐滴加入逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。，摇匀，直至出现沉淀为止。实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第17页蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应生物碱试剂沉淀蛋白质生物碱试剂沉淀蛋白质在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、如苦味酸、钨酸、鞣酸钨酸、鞣酸)以及一些酸以及一些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝如三氯醋酸、过氯酸、硝酸酸)结合成不溶性盐沉淀，此时蛋白质带正电荷易结合成不溶性盐沉淀，此时蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。于与酸根负离子结合成盐。试验内容试验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入饱和苦味酸加入饱和苦味酸 6d，观察现象（，观察现象（）；）；注意：注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第18页 试验统计与试验汇报试验统计与试验汇报 试验目标；试验目标；试验原理；试验原理；仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂；试验步骤；试验步骤；结果讨论（含数据处理）；结果讨论（含数据处理）；实验蛋白质变性凝固和沉淀WT专家讲座第19页