东方蜜蜂微孢子虫RCDP42基因的分子克隆与生物信息学分析.pdf

收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金面上项目()国家现代农业产业技术体系建设专项资金()福建省自然科学基金面上项目()福建农林大学硕士生导师团队项目江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室开放基金作者简介:郭睿()男 研究方向:昆虫病原互作:.通信作者陈大福()男教授博士生导师研究方向:蜜蜂保护学:.东方蜜蜂微孢子虫 基因的分子克隆与生物信息学分析郭 睿 张凯遥 张佳欣 郭思佳 张浩宇 何旭江 赵红霞 付中民 陈大福.江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室江西 南昌 .福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)福建 福州 .广东省农业科学院动物研究所广东 广州 摘要:对东方蜜蜂微孢子虫 基因进行分子克隆并通过生物信息学解析 蛋白的分子特性进而对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的 蛋白进行保守基序和结构域预测及分析 结果表明成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫 基因的 区 基因在孢子中真实表达含有 个核苷酸可编码 个氨基酸 蛋白的分子质量约为.分子式为 脂溶系数为.等电点为.包含的亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸但不含信号肽与跨膜结构域说明 可能为亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白可能包含 个磷酸化位点、个螺旋、条延长链、个 转角及 个无规则卷曲 在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的开放科学(资源服务)标识码()蛋白中均鉴定到 个保守基序(、和 )与 个结构域()关键词:东方蜜蜂微孢子虫 相关细胞分裂蛋白 样蛋白 分子克隆 分子特性 系统进化中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.).().:.().()().:福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月东方蜜蜂微孢子虫()是一种单细胞真菌寄生虫专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞对东方蜜蜂()和西方蜜蜂()的蜂王、雄蜂、工蜂和幼虫均有侵染性 东方蜜蜂微孢子虫侵染蜜蜂导致微孢子虫病影响蜂群群势和生产力对养蜂业造成较大损失 东方蜜蜂微孢子虫的参考基因组和全长转录组均已公布有力推动了相关分子生物学和组学研究 但目前成熟转基因技术平台缺失极大地限制了东方蜜蜂微孢子虫基因功能研究导致绝大多数基因的信息匮乏作为关键信号转导途径之一丝裂原活化蛋白激酶()信号通路广泛存在于真核生物且发挥重要作用 真菌通过 信号通路介导一系列磷酸化事件从而感知和传递外界环境信号 研究表明真菌的 信号通路与有性生殖、菌丝生长、应激反应、细胞完整性维持及子囊孢子形成等诸多生物学过程密切相关 是 信号通路上的基因球孢白僵菌()含有 的同源物 无效突变 导致球孢白僵菌对渗透、高温和氧化胁迫的敏感性提高同时对杀菌剂氟狄奥尼的抗性增强 已证实在绿僵菌()中 和 型 可通过协同作用促进应激反应和调节菌核发育 信号通路的上下游包含多个基因包括 相关细胞分裂蛋白 样蛋白()基因 研究表明在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂()工蜂的过程中 及其靶向的 基因表达均呈总体下降趋势且 可注释到 信号通路说明 和 在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中可能发挥重要作用 本试验利用分子生物学手段对东方蜜蜂微孢子虫 基因进行克隆并通过生物信息学解析 蛋白的分子特性进而对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的 蛋白进行保守基序和结构域的预测及分析旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫 的信息并为进一步开展 的功能研究提供依据 材料与方法.生物材料东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子由福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护课题组制备.基因 区的 扩增和 测序基于前期已获得的高质量转录组数据根据 区序列设计合成特异性扩增引物(:)通过 法提取东方蜜蜂微孢子虫的孢子样品的总 利用 引物及随机引物进行反转录得到 以其作为模板进行 扩增 反应体系和程序参照范元婵等的方法进行设置 扩增产物经 的琼脂糖凝胶电泳分离采用凝胶成像仪(上海培清科技有限公司中国)进行观察和拍照 参照郭意龙等的方法进行目的片段回收与 克隆送菌液至上海生工生物工程股份有限公司进行 测序.蛋白的生物信息学分析根据前期基于转录组数据预测出的东方蜜蜂微孢子虫 基因序列利用 网站(:/./)的 工具预测 蛋白的氨基酸序列 通过 网站(:/./)的、和 等软件分析 蛋白的理化性质、亲水性和三级结构利用 .(:/././)、.(:/./)和 (:/./.?.)及(:/./.?.)等软件预测 蛋白的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构 使用(:/./.)软件预测 蛋白的亚细胞定位.蛋白的结构基序预测利用 工具将东方蜜蜂微孢子虫 氨基酸序列比对到 数据库(:/./)以搜索序列相似性较高的其他物种的 蛋白 使用 软件(:/./)预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种 的保守基序参数按如下设置:结构福建农林大学学报(自然科学版)第 卷域最小氨基酸残基数为 个结构域最大氨基酸残基数为 个不同结构域的数量为 个其余参数为默认设置.蛋白的结构域预测通过 .软件对东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫()和肠脑炎微孢子虫()的 进行氨基酸序列多重比对 利用 的 和 软件对 结构域进行预测 结果与分析.基因 区的分子克隆琼脂凝胶电泳结果表明通过 扩增出约 的目的片段与预期相符(图)上述目的片段的 测序结果为:与基于转录组预测出的 区序列一致 说明本试验成功克隆了东方蜜蜂微孢子虫的 区 在东方蜜蜂微孢子虫的孢子中得到真实表达.蛋白的分子特性 区共含有 个核苷酸可编码 个氨基酸()蛋白的分子质量约.分子式为 脂溶系数.等电点.中含量最低和最高的氨基酸分别为组氨酸和异亮氨酸(表)另外 含有 个负电荷氨基酸包括 个天冬氨酸和 个谷氨酸 个正电荷氨基酸包括 个精氨酸和 个赖氨酸(表)图 东方蜜蜂微孢子虫 基因的扩增产物.表 蛋白的氨基酸组成 氨基酸 数量个频率氨基酸 数量个频率丙氨酸.亮氨酸.精氨酸.赖氨酸.天冬酰胺.蛋氨酸.天冬氨酸.苯丙氨酸.半胱氨酸.脯氨酸.谷氨酰胺.丝氨酸.谷氨酸.苏氨酸.甘氨酸.色氨酸.组氨酸.酪氨酸.异亮氨酸.缬氨酸.的平均亲水系数.亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸(图)说明其可能为亲水性蛋白 在 中鉴定到 个丝氨酸磷酸化位点、个酪氨酸磷酸化位点和 个苏氨酸磷酸化位点(图)中不存在典型的信号肽与跨膜结构域(图)说明其可能为胞内蛋白和非跨膜蛋白 第 期张凯遥等:东方蜜蜂微孢子虫 基因的分子克隆与生物信息学分析:亲水性:磷酸化位点:信号肽:跨膜结构域图 东方蜜蜂微孢子虫 的生物信息学分析.蓝色表示 螺旋红色表示延长链绿色表示 转角紫色表示无规卷曲图 东方蜜蜂微孢子虫 蛋白的二级结构()与三级结构().()().二级结构分析结果表明 含有 个(.)螺 旋、个(.)延 长 链、个(.)转角、个(.)无规则卷曲(图)三级结构分析结果表明 与模板.之间的同源性为.(图)同时定位于细胞质、细胞核、线粒体和细胞膜占比分别为.、.、.和.蛋白的保守基序与结构域将东方蜜蜂微孢子虫 蛋白的氨基酸序列比对到 数据库发现仅蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫含有同源的 蛋白 氨基酸序列多重比对结果显示东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的 序列具有较高的一致性(图)相同颜色表示属于同一类氨基酸具有相似的结构和功能表示保守氨基酸图 种微孢子虫的 氨基酸序列多重比对.另外东方蜜蜂微孢子虫 含有 个保守基序分别是 、和 (图)在蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫中也鉴定到上述 个保守基序(图)福建农林大学学报(自然科学版)第 卷图 种微孢子虫 含有的保守基序.在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的 中均鉴定到 个保守结构域:同源家族()(图)其属于小 超家族图 种微孢子虫的 含有的结构域.结论与讨论本试验中 扩增与 测序结果证实在东方蜜蜂微孢子虫孢子中扩增出约 的目的片段这与前期转录组测序预测出的 序列一致(图)说明成功克隆到 的 区为进一步开展 的功能研究提供依据 生物信息学分析结果表明 可能为亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白此外 可同时定位于细胞质、细胞核、线粒体和细胞膜体现出 功能的广泛性和重要性 上述结果丰富了东方蜜蜂微孢子虫 的基本信息为开展相关研究提供了依据 本试验结果表明东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的 序列具有较高的一致性(图)此外在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫中均鉴定到 个保守基序(、和 )和 个保守结构域()(图)表明 在上述 种微孢子虫中具有高度保守性 小 超家族包括、和 亚家族作为鸟嘌呤核苷酸依赖性分子开关参与调节众多细胞生命活动 亚家族是肌动蛋白组织、基因表达和细胞周期进程的关键调节因子在真菌的形态发生和发育中起到重要作用 在白色念珠菌()和禾谷镰刀菌()中小 超家族基因的抑制或缺失会导致真菌毒力降低 本研究表明东方蜜蜂微孢子虫 含有属于小 超家族的 结构域(图)推测 通过影响能量代谢调节东方蜜蜂微孢子虫的毒力和侵染过程经搜索数据库发现东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫均含有 蛋白但除上述 种微孢子虫外其他微孢子虫均不含 说明有些微孢子虫在进化过程中发生了 基因的丢失 鉴于仅上述 种微孢子虫保留了 推测 在上述 种微孢子虫中发挥重要作用 蜜蜂微孢子虫()是东方蜜蜂微孢子虫的姐妹种二者之间具有很近的亲缘关系但蜜蜂微孢子虫不含 而东方蜜蜂微孢子虫的毒力较蜜蜂微孢子虫强因此需进一步研究 对毒力的影响 可以通过对东方蜜蜂微孢子虫侵染的蜜蜂宿主饲喂特异性 或 的 以明确 在侵染中的功能参考文献 .().():.梁勤陈大福.蜜蜂保护学.版.北京:中国农业出版社.第 期张凯遥等:东方蜜蜂微孢子虫 基因的分子克隆与生物信息学分析 .():.:./.():.陈华枝杜宇范小雪等.基于第三代纳米孔测序技术的东方蜜蜂微孢子虫全长转录组构建及注释.昆虫学报():.:?.:.()():.():.():.:.:./.张凯遥张文德王紫馨等.东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中 及其靶基因表达谱.昆虫学报():.张文德赵浩东孙明会等.东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小 的鉴定与分析.昆虫学报():.:.范元婵王杰孙明会等.东方蜜蜂微孢子虫蓖麻毒素 凝集素基因的分子克隆及生物信息学分析.中国农业大学学报():.郭意龙余岢骏赵萧等.意大利蜜蜂工蜂幼虫 基因的生物信息学分析及功能研究.微生物学报():.:.():.:.():.():.:.():.():.():.:./.():.:./.():.(责任编辑:吴显达)福建农林大学学报(自然科学版)第 卷