鼻咽癌组织中Tim-3和Galectin-9蛋白表达及其对临床疗效和预后的影响.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023Jul.40（7）鼻咽癌组织中Tim-3和Galectin-9蛋白表达及其对临床疗效和预后的影响*王启俊1，苏赓2，邹昂儒3，杜杨君2，吴可嘉2（广西壮族自治区民族医院1.耳鼻喉科；2.病理科；3.体检科，南宁530001）摘要目的：探讨鼻咽癌组织中Tim-3和Galectin-9蛋白表达及其对临床疗效和预后的影响。方法：收集2016年10月至2019年10月本院收治的60例鼻咽癌患者，所有患者接受调强放射治疗方案。采用免疫组化SP法检测60例鼻咽癌患者癌组织及癌旁组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白的表达情况，分析蛋白表达与临床特征、放疗疗效及预后的关系。结果：鼻咽癌组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（58.33%vs 31.67%，71.67%vs 33.33%，均P0.05）；肿瘤组织中Tim-3和 Galectin-9的表达与临床分期、是否远处转移相关（P0.05），与患者性别、肿瘤大小、年龄和血清EB病毒无明显关联（P0.05）；Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性患者放疗敏感性均显著高于Tim-3和 Galectin-9阴性患者（均P0.05）；Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达率与鼻咽癌复发率呈正相关关系（r=0.345，r=0.287，均P0.05）。结论：Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白在鼻咽癌中的侵袭与转移中发挥着重要作用，Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白高表达患者预后较差，Tim-3和 Galectin-9蛋白组阳性患者放射抗性较低，联合检测Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白对鼻咽癌的治疗及预后有一定的指导意义。关键词Tim-3；Galectin-9；放射治疗；鼻咽癌；放射抗性中图分类号：R739.63文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）07-1195-05DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.07.017Protein expressions of Tim-3 and Galectin-9 in nasopharyngeal carcinoma tissues and theirimpact on clinical efficacy and prognosisWang Qijun1,Su Geng2,Zou Angru3,Du Yangjun2,Wu Kejia2.(1.Department of Otorhinolaryngology;2.Depart-ment of Pathology;3.Department of Physical Examination,Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Re-gion,Nanning 530001,China)AbstractObjective:To explore the protein expressions of Tim-3 and Galectin-9 in nasopharyngeal carcinomatissues and their impact on clinical efficacy and prognosis.Methods:60 patients of nasopharyngeal carcinoma ad-mitted to our hospital from October 2016 to October 2019 were collected,and all patients received intensity mod-ulated radiation therapy.Immunohistochemical SP method was used to detect the protein expressions of Tim-3and Galectin-9 in carcinoma tissues and adjacent tissues of 60 patients with nasopharyngeal carcinoma,and therelationship between protein expressions and clinical features,radiotherapy efficacy and prognosis was analyzed.Results:The positive expression rates of Tim-3 and Galectin-9 proteins in nasopharyngeal carcinoma tissueswere significantly higher than those in adjacent tissues(58.33%vs 31.67%,71.67%vs 33.33%,allP0.05);theexpressions of Tim-3 and Galectin-9 in carcinoma tissues were correlated with clinical stages and distant metasta-sis(P0.05),but not with patient gender,tumor size,age and serum EB virus(P0.05);the radiosensitivity ofTim-3 and Galectin-9 protein positive patients was significantly higher than that of Tim-3 and Galectin-9 nega-tive patients(allP0.05);the positive expression rates of Tim-3 and Galectin-9 proteins were positively correlat-ed with the recurrence rate of nasopharyngeal carcinoma(r=0.345,r=0.287,allP0.05).Conclusion:Tim-3 pro-tein and Galectin-9 protein play an important role ininvasion and metastasis of nasopharyngeal carcino-ma,patients with high expressions of Tim-3 proteinand Galectin-9 protein have poor prognosis,patients*基金项目：广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题资助项目（No.Z20211162）通信作者，E-mail：SUGENGL收稿日期：2023-02-01 1195广西医科大学学报2023 Jul.40（7）with positive Tim-3 and Galectin-9 protein have low radiation resistance and the combined detection of Tim-3protein and Galectin-9 protein has certain guiding significance for the treatment and prognosis of nasopharyngealcarcinoma.KeywordsTim-3;Galectin-9;radiation therapy;nasopharyngeal carcinoma;radiation resistance鼻咽癌具有明显的地域、种族和遗传差异1。目前，鼻咽癌尚无准确有效的早期诊断、有效评估或预后预测的方法。因此，大量鼻咽癌患者在初次就诊时已经有局部晚期症状。放疗是鼻咽癌的主要治疗方法，然而放射抗性限制了鼻咽癌患者的治疗效果和预后。放射抗性是鼻咽癌放射生物学研究的重点，其分子机制的研究备受关注2。放射抗性跟肿瘤免疫逃逸相关，而在介导肿瘤免疫应答过程中，Tim-3 蛋白和 Galectin-9 蛋白发挥重要作用3-4。本研究通过对60例鼻咽癌患者肿瘤组织的Tim-3和 Galectin-9蛋白进行检测，分析Tim-3、Ga-lectin-9蛋白表达与临床疗效及预后的关系，以期为制定个体化放疗方案，提高放疗效果提供依据。1资料与方法1.1一般资料收集2016年10月至2019年10月在广西壮族自治区民族医院经病理诊断并接受调强放射治疗的60例鼻咽癌患者的临床资料，其中男32例，女28例；年龄2270岁，中位年龄45岁；病理标本为鼻咽镜活检组织，经病理专家会诊后确诊为鼻咽癌，并且均为初次就诊患者。依据血清学结果，EB病毒阳性的42例，阴性18例；肿瘤组织1 cm的31例，1 cm的29例；临床分期+期33例，+期27例；有远处转移的患者28例，无远处转移的患者32例。经放射治疗后，随诊发现，其中3年内复发24例，无复发36例。本研究中的所有患者均签署知情同意书，并获得了医院伦理委员会的批准。1.2标本采集和放疗通过鼻咽镜活检获取病理标本和癌旁组织，所有标本同时备制HE染色切片和进行免疫组化，根据检测结果分组，分为Tim-3、Galectin-9蛋白表达阳性组和阴性组。所有患者均接受调强放射治疗，采用直线加速器6MV-X线照射，处方剂量：PGTVnX（原发肿瘤）69.3074.09Gy，PGTVnd（淋巴结转移瘤）6674.09 Gy，PCTV1（高危区域）（6065.1Gy），PCTV2（预防区域）（51.6257.60 Gy），分割次数3033次。1.3免疫组化Tim-3和 Galectin-9单克隆抗体和S-PKits均购自北京中山生物技术公司产品，所有组织均采用免疫组织化学S-P法处理，Tim-3和 Galec-tin-9阳性对照以已知阳性片及内对照为主，以PBS液代替一抗和内对照作为阴性对照。结果判断：Tim-3阳性细胞表现为细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒，Galectin-9阳性细胞表现为细胞质内出现棕黄色颗粒。根据细胞染色强度评分：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。根据阳性细胞率计分：0分为阴性，阳性细胞10%为1分，阳性细胞11%50%为2分，阳性细胞50%为3分。两者的乘积2分以上判定为阳性。1.4疗效评价与随访所有患者放疗结束后每3个月进行随访，复查CT，按RECIST 1.1标准分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。有效率为RR（CR+PR），随访截止时间2022年10月，并以3年内复发率作为反映预后的指标。1.5统计学方法采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用2检验，采用Spearman 等级相关分析法分析Tim-3和Galectin-9蛋白阳性表达与肿瘤预后关系的相关性，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Tim-3和 Galectin-9蛋白在鼻咽癌组织及癌旁组织的表达鼻咽癌组织组中Tim-3和Galectin-9蛋白阳性表达率均高于癌旁组织组（均P0.05），见表1和图1。1196A：Tim-3在癌旁组织阴性表达；B：Tim-3在鼻咽癌组织阳性表达；C：Galectin-9在癌旁组织阴性表达；D：Galectin-9在鼻咽癌组织阳性表达。图1Tim-3和 Galectin-9蛋白在鼻咽癌组织及癌旁组织的表达（SP法，200）2.2鼻咽癌组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白的表达与临床特征的关系鼻咽癌组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白的阳性表达率与患者性别、肿瘤大小、年龄和血清EB病毒无明显关联（P0.05）；与临床分期、是否远处转移相关；及期肿瘤组织Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达率高于期和期（P0.05）；有远处转移者的Tim-3和 Galectin-9蛋白的阳性表达率高于无远处转移者（P0.05），见表2。2.3鼻咽癌中Tim-3和 Galectin-9蛋白的阳性表达与患者放疗疗效的关系Tim-3及Galectin-9蛋白阳性表达患者放疗有效率均高于Tim-3和Galectin-9蛋白阴性表达患者（P0.05）；而Tim-3/Galectin-9蛋白阳性表达患者放疗有效率高于Tim-3/Galectin-9蛋白阴性表达患者（P0.05），见表3。表2鼻咽癌组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白的表达与临床特征的关系临床特征性别男女肿瘤大小/cm11年龄/岁4545EB病毒阴性阳性临床分期+期+期远处转移无有n322831292337184233273228Tim-3n19161817152082713221322阳性率/%59.3857.1458.0658.6265.2254.0544.4464.2939.3981.4840.6378.57P0.8610.9650.3940.1530.0010.003Galectin-9n232022211627113219241924阳性率/%71.8871.4370.9772.4169.5772.9761.1176.1957.5888.8959.3885.71P0.9690.9010.7760.2350.0170.024表3 鼻咽癌中Tim-3和 Galectin-9蛋白的表达与患者放疗疗效的关系蛋白表达Tim-3蛋白表达阳性阴性Galectin-9蛋白表达阳性阴性Tim-3/Galectin-9蛋白表达阳性阴性n352543172614CR+PR2611307205SD+PD914131069RR/%71.4344.0069.7741.1876.9235.71P0.0170.0400.0102.4鼻咽癌组织中Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达与肿瘤预后关系组别鼻咽癌组织组癌旁组织组n6060Tim-3阴性阳性阳性率/%P2541351958.3331.670.003Galectin-9阴性阳性 阳性率/%P1740432071.6733.330.001表1Tim-3和 Galectin-9蛋白在鼻咽癌组织及癌旁组织的表达王启俊,等.鼻咽癌组织中Tim-3和Galectin-9蛋白表达及其对临床疗效和预后的影响 1197广西医科大学学报2023 Jul.40（7）60例鼻咽癌患者随诊调查发现，其中3年内复发24例，无复发36例。Spearman 等级相关分析显示，Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达率与鼻咽癌复发率呈正相关关系（r=0.345，r=0.278,均P0.05），Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达率越高，肿瘤预后越差，见表4。表4Tim-3和 Galectin-9蛋白阳性表达与肿瘤预后关系的相关分析指标Tim-3蛋白表达阳性阴性Galectin-9蛋白表达阳性阴性n352543173年内复发1952133年内无复发16202214复发率/%54.2920.0048.8417.65r0.3450.287P0.0070.0263讨论随着放射抗性研究的深入，从细胞生物学角度探讨癌细胞抗辐射的分子机制，以提高肿瘤的放射敏感性，改善预后，在制定肿瘤治疗计划中起着重要作用。Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白在肿瘤免疫细胞定位、功能性免疫细胞分化和凋亡以及炎症因子释放中起着重要作用，本研究就Tim-3蛋白和Ga-lectin-9蛋白的表达情况与临床疗效及预后的关系进行分析。Tim-3包括免疫球蛋白结构、细胞外糖蛋白、细胞内C和跨膜区短尾。Tim-3通过细胞外球蛋白结构域与其配体关联5-6。研究表明，不同的组织细胞类型Tim-3的表达水平也不尽相同，更多研究表明，在宫颈癌及胃癌中，Tim-3高表达促进肿瘤的浸润及转移7-8。Xiao 等9研究发现，Tim-3 在鼻咽癌CD8、CD11b细胞和CD33上的表达升高，Tim-3的表达与淋巴结转移关联；此外，复发性鼻咽癌和鼻咽癌患者在化疗或放疗前Tim-3的表达也会增加。Tim-3的高表达与鼻咽肿瘤高侵袭能力和低分化趋势有一定的相关性。它可以独立作为潜在鼻咽癌发病机制、侵袭和转移的重要指标。Galectin-9已证明在肿瘤免疫学中发挥重要作用。它能促进免疫活性细胞增殖和活化，增强其抗肿瘤免疫力。Ga-lectin-9可以诱导人树突状细胞成熟，促进表达肿瘤抗原的能力，进而诱导Th1介导的免疫效应。Ko-bayashi等10评估了Galectin-9在体外对胆管癌细胞增殖的影响，发现半乳糖凝集素-9通过caspase依赖或独立途径介导的内部凋亡途径诱导癌细胞凋亡。研究表明，在许多肿瘤中，如肝细胞癌、乳腺癌和结肠腺癌，半乳糖凝集素-9 可通过 JNK 和 p38MAP激酶途径诱导癌细胞凋亡11-13。Galectin-9与肿瘤细胞黏附、迁移、侵袭、肿瘤免疫逃逸有关。本研究中，Tim-3和 Galectin-9高表达的鼻咽癌具有较高的侵袭性及早期远处转移的特点，并且具有较高的复发率，与Tim-3和 Galectin-9低表达组相比，差异有统计学意义，这与De等14在其他肿瘤如乳腺癌中的研究结果类似。Tim-3配体和Tim-3球蛋白之间的生物相互作用中，Galectin-9 是第一个被认可的 Tim-3 天然配体。糖化Tim-3结构域可与Galectin-9相互作用，导致结合到Tim-3细胞内段的HLA-B相关转录因子-3解离，刺激钙离子进入活化的T细胞，通过诱导T细胞凋亡抑制 T 细胞介导的免疫应答。因此，推测Tim-3/Galectin-9信号通路可通过调节细胞因子分泌和巨噬细胞极化参与肿瘤生长、侵袭和转移15-16。此外，通过Tim-3/Galectin-9信号通路的相互作用，可刺激单核细胞和树突状细胞等天然免疫细胞分泌少量TNF。肿瘤细胞表面的Galectin-9可直接导致肿瘤细胞凋亡，进而产生颗粒酶B，穿孔素和干扰素-通过与Tim-3结合在DC和CD8+T细胞上杀死肿瘤细胞17。鼻咽癌外显体可通过Tim-3/Galectin-9途径诱导EBV特异性CD4+T细胞凋亡。通过使用阻断Tim-3的抗体或直接使用阻断Galec-tin-9的抗体，可以提高CD4+T细胞的长期存活率；阻断Tim-3/Galectin-9通路可以降低Th1细胞的抑制作用，增强抗肿瘤免疫反应18。本研究发现，Tim-3阳性表达患者放疗有效率显著高于阴性表达组，Galectin-9阳性表达患者放疗有效率显著高于阴性表达组，Tim-3、Galectin-9均阳性表达患者放疗有效率显著高于Tim-3、Galectin-9均阴性表达组，提示鼻咽癌中Tim-3、Galectin-9高表达可促进肿瘤细胞的放射抵抗。细胞的放疗敏感性与其周期密切相关。G1/S期细胞的放疗敏感性较低，而G2期细胞的放疗敏感性较高。放射治疗可能抑制Tim-3、Ga-lectin-9表达显著上调，从而导致肿瘤凋亡率增加。综上所述，Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白在鼻咽癌中侵袭及转移中发挥着重要作用，Tim-3和 Ga-lectin-9高表达的鼻咽癌患者具有较差的预后；Tim-3、1198Galectin-9表达上调的鼻咽癌患者具有较低放射抗性。进一步证实Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白在鼻咽癌发展中的确切作用机制、探讨放射抗性与Tim-3蛋白和Galectin-9蛋白的内在分子机制，可能为临床放疗方案的研究提供新的思路。参考文献：1 ZHU Q W,ZHANG Q C,GU M,et al.MIR106A-5p upreg-ulation suppresses autophagy and accelerates malignantphenotype in nasopharyngeal carcinomaJ.Autophagy,2021,17(7)：1667-1683.2CHAISWING L,WEISS H L,JAYSWAL R D,et al.Pro-files of radioresistance mechanisms in prostate cancerJ.Crit rev oncog,2018,28(2)：39-67.3 DAS M,ZHU C,KUCHROO V K,et al.Tim-3 and its rolein regulating anti-tumor immunityJ.Immunol rev,2017,276(1)：97-111.4DALEY D,MANI V R,MOHAN N,et al.Dectin 1 activa-tion on macrophages by galectin 9 promotes pancreaticcarcinoma and peritumoral immune toleranceJ.Nat med,2017,23(5)：556-567.5 ANDERSONAC,JOLLER N,KUCHROO V K,et al.Lag-3,Tim-3,and TIGIT:co-inhibitory receptors with special-ized functions in immune regulationJ.Immunity,2016,44(5):989-1004.6DATAR I,SANMAMED M F,WANG J,et al.Expressionanalysis and significance of 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