玻璃内包材界面修饰对机械应力诱导的单克隆抗体聚集体形成的影响.pdf

化工学报 2023年 第74卷 第6期|,2023,74(6):2580-2588 CIESC Journal玻璃内包材界面修饰对机械应力诱导的单克隆抗体聚集体形成的影响王新悦1，王俊杰1，曹思贤1，王翠1，李灵坤1，吴宏宇1，韩静2，吴昊1（1 沈阳药科大学制药工程学院，辽宁 沈阳 110179；2 沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，辽宁 沈阳 110179）摘要：利用十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS）对中硼硅玻璃管制注射剂瓶内表面进行化学改性，使用接触角仪（水接触角从 501增加至 902）、原子力显微镜（表面粗糙度从 0.4480.086 增加至 1.2820.117）、红外（出现CH2和CH3特征峰）对表面进行验证，成功制备了具有疏水性能的玻璃表面。给玻璃瓶中的单克隆抗体施加机械应力，使用微流成像技术、尺寸排阻-高效液相色谱法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC）、外源荧光对单抗制剂的稳定性进行全面表征。结果表明，OTS处理的疏水性界面可以减少机械应力诱导的蛋白质聚集体的产生。由于疏水表面与蛋白质强的疏水相互作用，OTS处理的疏水表面可有效抑制机械应力诱导的抗体分子的聚集。关键词：表面化学；内包材；吸附；抗体；聚集中图分类号：TQ 464.9 文献标志码：A文章编号：0438-1157（2023）06-2580-09Effect of glass primary container surface modification on monoclonal antibody aggregates induced by mechanical stressWANG Xinyue1,WANG Junjie1,CAO Sixian1,WANG Cui1,LI Lingkun1,WU Hongyu1,HAN Jing2,WU Hao1(1 School of Pharmaceutical Engineering,Shenyang Pharmaceutical University,Liaoning 110179,Shenyang,China;2School of Functional Food and Wine,Shenyang Pharmaceutical University,Liaoning 110179,Shenyang,China)Abstract:The inner surface of middle borosilicate glass tubing was modified by octadecyltrichlorosilane(OTS).The contact angles of modified surfaces which were measured by contact angle goniometer increased from 501 to 902.The surface roughness which was measured by atomic force microscope increased from 0.4480.086 to 1.2820.117,and the result of Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)indicated that the OTS was successfully coated on the glass surfaces.The monoclonal antibody in glass containers were subjected to mechanical stress.Microflow imaging,size exclusion-high performance liquid chromatography(SE-HPLC)and extrinsic fluorescence dye were used to characterize the stability of monoclonal antibody.The results showed that the OTS-treated hydrophobic interface could reduce the generation of mechanical stress-induced protein aggregates.Due to the strong hydrophobic interaction between hydrophobic surface and protein,the hydrophobic surface could effectively reduce the aggregation of antibody molecules induced by mechanical stress.DOI：10.11949/0438-1157.20230201收稿日期：2023-03-07 修回日期：2023-05-08通信作者：吴昊（1990），男，博士，副教授，第一作者：王新悦（1997），女，硕士研究生，基金项目：辽宁省科技厅省博士科研启动基金计划项目（2021-BS-131）引用本文：王新悦,王俊杰,曹思贤,王翠,李灵坤,吴宏宇,韩静,吴昊.玻璃内包材界面修饰对机械应力诱导的单克隆抗体聚集体形成的影响J.化工学报,2023,74(6):2580-2588Citation：WANG Xinyue,WANG Junjie,CAO Sixian,WANG Cui,LI Lingkun,WU Hongyu,HAN Jing,WU Hao.Effect of glass primary container surface modification on monoclonal antibody aggregates induced by mechanical stressJ.CIESC Journal,2023,74(6):2580-2588研究论文第6期Key words:surface chemistry;primary container;absorption;antibody;aggregation引言单克隆抗体由于其优秀的靶向性和较小的副作用被广泛应用在临床治疗、疫苗等领域1-2。然而，蛋白质是生物大分子，极容易受外界因素的影响而发生空间构象的改变，产生蛋白质聚集体和不溶性微粒3，它们的形成不仅会影响蛋白质药物的药效，还有可能引起严重的不良反应4-5。例如，在静脉输液中，较大的不溶性微粒可能引起血管堵塞、肉芽肿、肺动脉高压、过敏样和热源样反应等严重不良反应6，Joubert等7研究表明搅拌制备的单克隆抗体聚集体通过刺激TLR-2和TLR-4受体，诱导细胞因子的分泌引起免疫反应。美国药典（United States Pharmacopoeia，USP）及欧 洲 药 典（European Pharmacopeia，EP）2.9.19规定使用光遮蔽法测量的10 m和25 m颗粒应分别保持在6000和600粒/容器以下8。所以有效控制和减少蛋白质聚集体和不溶性微粒的产生对药品的生产和管理过程非常重要。蛋白质制剂一般通过添加特殊辅料来提高稳定性。例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80是生物制剂中使用最广泛的表面活性剂，常被用于与蛋白质竞争吸附在界面上，从而可以显著减少蛋白质的吸附和聚集9-11。此外，Perevozchikova 等12通过改变蛋白质处方中的 pH和离子强度来调节蛋白质与玻璃表面之间的静电相互作用，从而减少蛋白质吸附和聚集。也有研究通过改变蛋白质直接接触的材料表面的性质来稳定蛋白质。例如，材料表面和蛋白质之间带有相同电荷时可以抑制蛋白质吸附13。Wu等14对柱塞泵不锈钢表面进行改性，发现带正电的 IVIG与带正电的泵表面接触时产生的蛋白质聚集体更少。Movafaghi等15对玻璃表面进行 PEG 化学修饰，增加玻璃表面的亲水性，减少蛋白质吸附，发现PEG修饰的表面可以减少由空化引起的IVIG聚集体的产生。以上减少蛋白质聚集的策略是从减少蛋白质吸附的角度进行的。蛋白质在表面的吸附是常见的现象，与表面接触时，很容易发生吸附作用导致蛋白质的空间构象发生改变，产生蛋白质聚集体12，如预填充式注射器中颗粒的形成与蛋白质分子在玻璃-硅油界面的吸附和解吸有关16。此外，在运输过程中，剪切力也是聚集体产生的诱因17-19，例如吸附在固-液-气三相界面上的变性蛋白质在经历剪切应力时，容易从界面上脱附下来进入溶液中，进一步形成聚集体20。中硼硅酸盐玻璃制成的亲水注射瓶是抗体制剂较常见的储存容器21，与亲水表面相比，蛋白质更容易吸附在疏水表面上，如与亲水性的SiO2表面相比，mAb1和mAb2更容易吸附在聚苯乙烯和特氟龙疏水表面上，并且疏水性更强的mAb2在疏水表面上吸附更多22。但是也有研究表明，贻贝蛋白在疏水表面的吸附力约为 320 kJ/mol，在亲水表面的吸附力约为180 kJ/mol。疏水表面与贻贝蛋白质分子作用力更强，吸附在疏水表面上的贻贝蛋白质很难分离23。乳球蛋白在疏水表面上不可逆吸附的比例高于亲水表面，显示出乳球蛋白可以更强地与疏水表面结合24。假设在运输过程中，吸附在疏水表面上的特定蛋白质难以脱附下来，那么疏水表面在一定程度上可以抵抗流体剪切力诱导的蛋白质聚集体的产生。而且蛋白质直接接触的材料很多都是疏水表面，如输液袋、注射器、过滤器滤膜25。所以研究疏水表面与稳定蛋白质的联系尤为重要。本文对中硼硅玻璃表面进行化学处理，成功制备了疏水性的玻璃表面，对在疏水性玻璃瓶中应激后的单抗制剂的稳定性进行全面研究，讨论了疏水表面在运输过程中对IgG2产生不溶性微粒的影响及其机制。研究结果将对深入研究在运输过程中，控制运输条件，疏水表面保护IgG2免受流体剪切力的影响具有重要的研究价值。1 实验材料和方法1.1 实验材料7 ml中硼硅玻璃管制注射剂瓶，肖特药品包装（浙江）有限公司。单克隆抗体（简称单抗，IgG2，75 mg/ml）,中国食品药品检定研究所。山梨醇，石家庄瑞雪药业有限公司。醋酸钠、醋酸，湖南尔康药业有限公司。Tergazyme 酶，美国 Alconox 公司。4,4-二苯氨基-1,1-联萘-5,5-二磺酸二钾盐（Bis-ANS）、十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS，分析纯）、2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）、酒石酸钠，购自阿拉丁。98%H2SO4、H2O2、甲苯、乙2581第74卷化 工 学 报醇（分析纯），购自利安隆博。1.2 实验仪器微 流 成 像 仪（fluid imaging technologies,FIM,FlowCAM 8000），Yokogawa Fluid Imaging Technologies。多 功 能 酶 标 仪（Infinite F500），Tecan。原 子 力 显 微 镜（atomic force microscope,AFM,Dimension ICON），Bruker。带有衰减全反射(attenuated total refraction,ATR)附件的傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR,Nicolet iS 10），Thermo。全自动接触角测量仪（OCA20），Dataphysics。旋转混匀仪，力辰科技有限公司。高效液相色谱仪（Primaide），日立高新技术公 司。全 自 动 比 表 面 积 孔 隙 率 分 析 仪（BET，ASAP2460），美国麦克公司。油浴锅（DF-101S），巩义市予华仪器有限公司。高速离心机（H3-20K），可成仪器有限公司。微孔板恒温孵育器（ST60-4），杭州米欧仪器有限公司。1.3 实验方法1.3.1 表面改性及界面表征方法 在表面改性之前，用去离子水和无水乙醇依次将玻璃瓶进行冲洗，在 25下自然晾干。配制食人鱼溶液 H2SO4H2O2=3 1(体积比)，向玻璃西林瓶中灌满食人鱼溶液，置于120油浴锅中，反应3 h，反应结束后用大量去离子水冲洗，用过0.22 m聚四氟乙烯（PTFE）滤膜的无水乙醇进行冲洗，在25下自然晾干，使玻璃瓶内表面富集OH，即得 OH化玻璃瓶，立即进行下一步反应。用甲苯配制浓度为 0.17、0.85、3.4、17 mol/L OTS 溶液，将配制好的溶液灌满 OH化玻璃瓶，室温下反应12 h，分别用甲苯、乙醇、去离子水超声清洗30 min，再使用过滤的无水乙醇冲洗玻璃瓶，在24下自然晾干，即得OTS玻璃瓶。为了观察 OTS改性后玻璃表面的亲疏水性变化，使用接触角仪对未经处理、OTS处理的相同材质玻璃片进行表征，样品在测试之前用过滤的无水乙醇和去离子水冲洗，并用氮气流吹干，然后测试，每个样品表面测试 3 次，取平均值。使用 FTIR 表征OTS 改性后玻璃表面的官能团信息，收集 20004000 cm-1 谱图。为了表征 OTS改性前后表面粗糙度的变化，使用AFM观察玻璃片表面形貌。1.3.2 OTS修饰的表面稳定性考察 为了考察OTS修饰的表面稳定性，将上述17 mol/L OTS改性的玻璃表面在25室温下保存6个月后，对其进行接触角和FTIR的表征。1.3.3 IgG2在亲疏水表面的吸附 为了比较IgG2在亲疏水表面及不同浓度修饰的 OTS表面的饱和吸附量，使用直径为 0.5 mm的玻璃微珠进行研究15，估算玻璃微珠表面积为 0.005 m2/g，参照 1.3.1节对玻璃微珠进行OTS改性。使用BCA的方法测定蛋白质的含量26。首先，配制BCA工作试剂，它是由A B=50 1（体积比）的两种溶液组成，A 溶液（pH=11.25）由 0.03 mol/L BCA、0.19 mol/L Na2CO3、8.3 mol/L 酒 石 酸 钠、0.1 mol/L NaOH、0.11 mol/L NaHCO3组成，B 溶液由0.016 mol/L CuSO45H2O组成。然后，配制不同浓度的蛋白质溶液，将 75 mg/ml IgG2原液精密稀释到10 mg/ml，再从 10 mg/ml 的母液中精密吸取 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.2 ml于 10 ml容量瓶中，用过0.22 m 聚醚砜（PES）滤膜的辅料定容至刻度线，对应的浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.2 mg/ml。用含量损失法测定单抗吸附在玻璃表面的含量27，将1.0 g未改性的玻璃微珠和不同浓度改性的OTS玻璃微珠放入 0.5 ml浓度为 0.021.2 mg/ml IgG2溶液中。在24下，以10 r/min的速度在旋转混匀仪上以头对头方式混合 10 min。样品以 20000g离心10 min，使玻璃粉与溶液分离。分别取180 l BCA工作试剂和20 l样品的上清液于白色96孔板中，混合均匀，在37的孵育器上孵育30 min，然后将样品冷却至24，使用酶标仪在562 nm处读取吸光度值。用同样的方法测量上述浓度下单抗溶液的吸光度值，确定单抗的饱和吸附量，并将数据拟合Langmuir吸附等温线，估算单抗在玻璃表面的饱和吸附量。1.3.4 机械应力处理 为了模拟运输过程中，流体剪切力对在亲疏水两种表面的玻璃瓶中的单抗制剂稳定性的影响，使用旋转混匀仪对未处理、0.17 mol/L OTS、17 mol/L OTS玻璃瓶中的IgG2施加机械应力。首先，配制不含IgG2的缓冲溶液，它由4.6%山梨醇、17 mmol/L 醋酸钠组成，使用0.1 mol/L 醋酸调节pH至5.2。然后使用缓冲溶液将75 mg/ml的IgG2母液精密稀释到1 mg/ml。分别向未处理的玻璃瓶、OTS 玻璃瓶中加入 3 ml 浓度为 1 mg/ml 的IgG2溶液、不含IgG2的缓冲溶液。在4条件下，将玻璃瓶固定于旋转混匀仪上，以头对头的方式进行旋转，设定转速为10 r/min，转动时间为12 h，并设置静置组，每组实验设置三组。1.3.5 微流成像法用于亚可见颗粒物的分析 使第6期用 FlowCam 测量机械应力处理后玻璃瓶中直径 2 m的颗粒浓度及形态参数。将来自玻璃瓶中的300 l的样品注入流通池中，流速为 0.2 ml/min，使用超高速相机连续观察和统计直径 2 m的亚可见颗粒数。每个样品测试之间，使用0.22 m聚醚砜（PES）材 质 的 滤 膜 过 滤 后 的 去 离 子 水 和Tergazyme 酶清洗流通池，在每个样品测试前必须用去离子水冲洗干净。1.3.6 尺寸排阻-高效液相色谱法 使用SE-HPLC测定机械应力处理前后玻璃瓶中的可溶性IgG2单体的 含 量 及 可 溶 性 聚 集 体。将 含 IgG2的 样 品 在20000g 的条件下离心 10 min，以去除不溶性聚集体，取上清液进行分析。使用保护柱和G3000SWxL柱；流动相为 0.1 mol/L 硫酸钠、0.05 mol/L 磷酸二氢钠、0.05 mol/L 磷酸氢二钠；流速为 0.8 ml/min；检测波长为 280 nm；采集时间为 20 min。为了量化可溶性蛋白质的水平，与单峰下的总面积进行比较。1.3.7 外源荧光染料法 极性响应型外源荧光染料Bis-ANS可以非常灵敏地检测聚集和结构改变的蛋白质分子，当荧光染料与疏水性位点结合时，染料的荧光发射强度增加28。在黑色 96孔板中加入150 l待测样品及50 l Bis-ANS，Bis-ANS终浓度为2 mol/L。在24条件下，使用酶标仪进行测试，激发波长为390 nm，发射波长为490 nm。以静置的IgG2为对照，计算机械应力处理后的IgG2样品的荧光增加量。2 实验结果与讨论2.1 界面表征图1为OTS表面功能化的流程图，首先食人鱼溶液使玻璃表面富集OH，OTS 尾端水解暴露的 OH 与玻璃片上的OH 脱水以 SiO 键连接在玻璃片上，在玻璃表面生成了由一端带有18个碳原子组成的单分子层，增加了玻璃表面的疏水性。如图2所示，未处理的玻璃表面接触角为501，经食人鱼溶液处理后表面水接触角为 182，OH是亲水性基团，所以水接触角很小，经OTS处理的表面接触角增加到902，表明OTS处理的玻璃表面疏水性明显增加。通过FTIR可以看出OTS处理的玻璃在2850.27、2919.69 cm-1处有明显的甲基（CH3）和亚甲基（CH2）的特征吸收峰，随着 OTS浓度增加，玻璃表面的甲基和亚甲基的峰也增加，表明 OTS 在玻璃表面的修饰量增加（图 3）。通过AFM可以看出17 mol/L OTS处理的玻璃表面更粗糙（图 4），未经处理的玻璃表面粗糙度为 0.4480.086，经OTS处理后的表面粗糙度为1.2820.117。因此，成功制备了疏水性的玻璃表面。图1 OTS在玻璃表面化学处理的流程图Fig.1 Flow chart of chemical reaction of OTS on glass surface图2 接触角检测结果Fig.2 Results of water contact angle2583第74卷化 工 学 报2.2 OTS修饰的表面稳定性17 mol/L OTS 处 理 的 玻 璃 表 面 接 触 角 为 922，表明仍然为疏水性表面。并且 FTIR 在2850.27、2919.69 cm-1处有明显的甲基（CH3）和亚甲基（CH2）的特征吸收峰。2.3 蛋白质在亲疏水表面的吸附IgG2在亲疏水玻璃表面的吸附均符合Langmuir吸附模型（图 5）。如图 5 所示，在蛋白质浓度为 1 mg/ml时，IgG2在未处理的玻璃表面饱和吸附量约为8.1 mg/m2，曲线 b 和 c 分别为 0.17 mol/L OTS 和0.85 mol/L OTS修饰的玻璃表面，与IgG2在未改性的玻璃表面的Langmuir吸附模型类似，表明IgG2在这两种浓度修饰的玻璃表面上的吸附现象与未改性的表面相似，说明这两种浓度的OTS在表面修饰量很低。曲线 d 和 e 分别为 3.4 mol/L OTS 和 17 mol/L OTS修饰的玻璃表面，IgG2在这两种表面的Langmuir吸附模型类似，与未改性的玻璃表面相比，IgG2在这两种 OTS 修饰的表面吸附量更高，表明OTS在表面修饰量越高，蛋白质在表面吸附量越高。相对于亲水性表面，蛋白质更容易吸附在疏水表面上29-30。疏水性材料表面无法与水分子形成氢键，这使得疏水性表面周围的水分子与水分子之间通过自组合而形成一种较为有序、疏松的排列结构，当溶液中的蛋白质与疏水表面接触时，蛋白质的结构发生改变，蛋白质分子链中疏水部分与疏水表面相互接触，原本在疏水表面周围相对有序的水分子释放出一部分，增大了体系的熵值，在热力学上是有利的。亲水性材料表面可以与水分子形成氢键，从而与溶液中的水分子自身的氢键相互竞争，因此破坏了水分子的自组合，导致水分子在亲水性材料表面上采取一种无序的、致密的排列结构，称为水化层，在水溶液中，蛋白质分子一般采取疏水部分向内，亲水部分向外的天然结构，因此，在蛋白质分子的周围也存在着一层致密的水化层，所以蛋白质在亲水材料表面上不易吸附31。2.4 亚可见颗粒物的分析IgG2在未处理的玻璃瓶、0.17 mol/L OTS 和17 mol/L OTS处理的玻璃瓶中受到机械应力刺激后，产生了大量的亚可见颗粒，亚可见颗粒浓度分别为 73593285821、69040179508、43046689504 particles/ml图 6(a)。在高浓度 17 mol/L OTS 修饰的玻璃瓶中产生的颗粒浓度显著低于未处理的玻璃瓶，OTS修饰的表面可以减少一半的亚可见颗粒的产生。低浓度0.17 mol/L OTS修饰的玻璃瓶中产生的亚可见颗粒浓度和未处理的玻璃瓶产生的图3 玻璃表面的FTIR谱图a未处理的玻璃表面；b0.17 mol/L OTS处理的玻璃表面；c0.85 mol/L OTS处理的玻璃表面；d3.4 mol/L OTS处理的玻璃表面；e17 mol/L OTS处理的玻璃表面Fig.3 FTIR spectrum of glass surfaces图4 原子力显微镜表面形貌三维图Fig.4 Three-dimensional surface topography of AFM图5 IgG2在玻璃表面的Langmuir吸附模型a未处理的玻璃表面;b0.17 mol/L OTS处理的玻璃表面;c0.85 mol/L OTS处理的玻璃表面;d3.4 mol/L OTS处理的玻璃表面;e17 mol/L OTS处理的玻璃表面Fig.5 Langmuir adsorption model of IgG2 on glass 第6期亚可见颗粒浓度没有区别，表明OTS在表面修饰量很低时，无法降低IgG2不溶性聚集体的产生。蛋白质聚集体产生的原因可能是蛋白质在界面的吸附引起蛋白质空间构象的改变和疏水位点的暴露，并在界面发生聚集，形成了一层类似胶体性质的薄膜，当经历机械应力时，这些膜破裂，在界面上吸附的蛋白质聚集体脱附进入溶液中进一步形成聚集体14,19,32。OTS修饰的玻璃表面可以减少蛋白质聚集体产生的原因可能是蛋白质与疏水表面更强的结合，吸附在疏水表面上的变性蛋白质很难脱附到溶液中。因此，猜想由于蛋白质与疏水表面强的疏水相互作用，在本文机械应力条件下，吸附在疏水表面上的IgG2很难脱附下来，所以在OTS玻璃瓶中，经过应力刺激的蛋白质溶液检测出的蛋白质聚集体含量低。因此，OTS处理的疏水表面在一定的应力作用范围内可有效抑制IgG2分子的聚集。在未处理和 OTS处理的玻璃瓶中产生的粒子颗粒直径图6(a)及粒径分布（图7）没有显著区别，粒径主要分布在15 m。然而从颗粒形态角度观察，在未处理和OTS处理的玻璃瓶中产生的颗粒形态有区别（图8）。为了表征两种瓶中产生的颗粒，分析了FlowCAM给出的粒子的形态参数12，圆度是由周长和填充的区域计算的形状参数，圆的值为1.0。强度指的是组成粒子的像素的平均灰度值，图9给出了直径和圆度的等高线图及直径和强度的等高线图，可以明显看出在未处理和OTS处理的玻璃瓶中产生的粒子形态参数不同。蛋白质在亲水表面的吸附一般由静电相互作用介导，当蛋白质和表面带有不同的电荷时，吸附增加，当带相同符号的电荷时，吸附就会减少33。Mathes等34研究发现IgG在亲水性硼硅酸盐玻璃表面的吸附受配方的pH和离子强度影响，是由静电相互作用介导的，静电作用力是短程的，比较弱。蛋白质与疏水表面的相互作用是强的疏水相互作用，吸附在疏水表面上的蛋白质伴随着显著的构象变化30,35。2.5 可溶性蛋白质单体及寡聚体的分析SE-HPLC 结果显示 IgG2单体的出峰时间约为10.6 min，在两种玻璃瓶中机械应力处理后的蛋白质出峰时间与IgG2单体一致，并且没有出现可溶性寡聚体的峰，单体含量也没有明显损失，剩余的单体含量接近100%（图10）。2.6 外源荧光分析蛋白质聚集体的结构从 Bis-ANS 荧 光 数 据 可 知 图 6(b)，由 于图6 在未处理、0.17 mol/L OTS和17 mol/L OTS处理的玻璃瓶中，经过机械应力处理的 IgG2产生的蛋白质聚集体Fig.6 IgG2 protein aggregates produced by mechanically stressed in untreated and OTS glass vials图7 机械应力处理后的单抗溶液产生的亚可见颗粒的粒径分布Fig.7 Size distribution of subvisible particles in monoclonal antibody after mechanical stress treatment2585第74卷化 工 学 报17 mol/L OTS瓶中产生的聚集体含量只有未处理瓶中的一半，荧光强度与蛋白质聚集体水平成线性关系36，但OTS瓶中聚集体产生的荧光强度达到了未处理瓶，表明两种瓶中产生的聚集体结构不同，OTS瓶中产生的聚集体疏水位点暴露更多。由于蛋白质与亲疏水表面的吸附相互作用力不同，所以导致产生的蛋白质聚集体结构也不相同。3 结论（1）17 mol/L OTS处理的玻璃表面疏水性明显增加，AFM结果显示表面粗糙度增加，并且红外光谱显示有CH2和CH3特征峰，表明OTS改性成图9 IgG2亚可见颗粒的粒径和圆度之间的等高线图Fig.9 Contour plots of IgG2 subvisible particle size and circularity图8 在未处理和OTS处理的小瓶中经过机械应力处理后的单抗溶液产生的亚可见颗粒的形态Fig.8 Morphology of subvisible particles in monoclonal antibody solution after mechanical stress treatment in untreated glass vials and glass vials coated by 17 mol/L OTS第6期功。FlowCAM 数据显示 OTS修饰的表面可以减少一半的IgG2亚可见颗粒的产生。（2）IgG2与疏水表面具有强的疏水相互作用，疏水表面在一定应力范围内可以抵抗流体剪切力诱导的IgG2聚集体的产生。（3）在运输过程中稳定蛋白质，可以根据蛋白质的性质选择相应的内包材。并且疏水表面也可以作为内包材的涂层，保护特定蛋白质免受机械应力诱导的蛋白质聚集体的产生。参考文献1Nuvalos M,Garca-Ros E,Mancebo F J,et al.Novel monoclonal antibody-based therapies:implications for the treatment and prevention of HCMV diseaseJ.Trends in Microbiology,2023,31(5):480-497.2Chen Y,Zhang G L,Yang Y W,et al.The treatment of inflammatory bowel disease with monoclonal antibodies in AsiaJ.Biomedicine&Pharmacotherapy,2023,157:114081.3Chi E Y,Krishnan S,Randolph T W,et al.Physical stability of proteins in aqueous solution:mechanism and driving forces in nonnative protein aggregationJ.Pharmaceutical Research,2003,20(9):1325-1336.4Kosloski M P,Miclea R D,Balu-Iyer S V.Role of glycosylation in conformational stability,activity,macromolecular interaction and immunogenicity of recombinant human factor J.The AAPS,Journal,2009,11(3):424-431.5Johann F,Wll S,Winzer M,et al.Miniaturized forced degradation of therapeutic proteins and ADCs by agitation-induced aggregation using orbital shaking of microplatesJ.Journal of Pharmaceutical Sciences,2022,111(5):1401-1413.6金鹤.静脉输液中不溶性微粒对人体的危害及控制J.上海护理,2007,7(5):55-57.Jin H.Harm and control of insoluble particles in intravenous infusion to human bodyJ.Shanghai Nursing,2007,7(5):55-57.7Joubert M K,Hokom M,Eakin C,et al.Highly aggregated antibody therapeutics can enhance the in vitro innate and late-stage T-cell immune responsesJ.Journal of Biological Chemistry,2012,287(30):25266-25279.8郭莎,贾哲,吴昊,等.单克隆抗体颗粒表征的现状与挑战J.中国药事,2022,36(2)161-169.Guo S,Jia Z,Wu H,et al.Current status and challenges of particle characterization in monoclonal antibody formulationJ.Chinese Pharmaceutical Affairs,2022,36(2)161-169.9Patapoff T W,Esue O.Polysorbate 20 prevents the precipitation of a monoclonal antibody during shearJ.Pharmaceutical Development and Technology,2009,14(6):659-664.10Bam N B,Cleland J L,Yang J,et al.Tween protects recombinant human growth hormone against agitation-induced damage via hydrophobic interactionsJ.Journal of Pharmaceutical Sciences,1998,87(12):1554-1559.11Wang W,Wang Y J,Wang D Q.Dual effects of Tween 80 on protein stabilityJ.International Journal of Pharmaceutics,2008,347(1/2):31-38.12Perevozchikova T,Nanda H,Nesta D P,et al.Protein adsorption,desorption,and aggregation mediated by solid-liquid interfacesJ.Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,104(6):1946-1959.13Kaivosoja E,Barreto G,Levn K,et al.Chemical and physical properties of regenerative medicine materials controlling stem cell fateJ.Annals of Medicine,2012,44(7):635-650.14Wu H,Randolph T W.Aggregation and particle formation during pumping of an antibody formulation are controlled by electrostatic interactions between pump surfaces and protein moleculesJ.Journal of Pharmaceutical Sciences,2020,109(4):1473-1482.15Movafaghi S,Wu H,Francino Urdniz I M,et al.The effect of container surface passivation on aggregation of intravenous immunoglobulin induced by mechanical shockJ.Biotechnology Journal,2020,15(9):e2000096.16Yoneda S,Maruno T,Mori A,et al.Influence of protein adsorption on aggregation in prefilled syringesJ.Journal of Pharmaceutical Sciences,2021,110(11):3568-3579.17Biddlecombe J G,Craig A V,Zhang H,et al.Determining antibody stability:creation of solid-liquid interfacial effects within a high shear environmentJ.Biotechnology Progress,2007,23(5):1218-1222.18Oliva A,Santovea A,Faria J,et al.Effect of high shear rate on stability of proteins:kinetic studyJ.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2003,33(2):145-155.19Sediq A S,van Duijvenvoorde R B,Jiskoot W,e