产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品的研制.pdf

p a n s i o n o f T r e g s C e l l s i n t h e T u m o r E n v i r o n m e n t-H o w t o T a r g e t T h e m?J.C a n c e r s(B a s e l),2 0 2 1,1 3(8):1 8 5 0.2 5GAO Y,WAN G J,Z HOU Y,e t a l.E v a l u a t i o n o f S e r u m C E A,C A 1 9-9,C A 7 2-4,C A 1 2 5 a n d F e r r i t i n a s D i a g n o s t i c M a r k e r s a n d F a c t o r s o f C l i n i c a l P a r a m e t e r s f o r C o l o r e c t a l C a n c e rJ.S c i R e p 2 0 1 8,8:2 7 3 2.2 6 N C M,S E R I LME Z M,S A R I M,e t a l.T h e D i a g n o s t i c S i g-n i f i c a n c e o f P D G F,E p h A 7,C C R 5,a n d C C L 5 L e v e l s i n C o l o r e c t a l C a n c e rJ.B i o m o l e c u l e s,2 0 1 9,9(9):4 6 4.2 7M I E L C A R S KA S,KU L A A,D AW I D OW I C Z M,e t a l.A s s e s s-m e n t o f t h e R AN T E S L e v e l C o r r e l a t i o n a n d S e l e c t e d I n f l a mm a-t o r y a n d P r o-A n g i o g e n i c M o l e c u l e s E v a l u a t i o n o f T h e i r I n f l u e n c e o n C R C C l i n i c a l F e a t u r e s:A P r e l i m i n a r y O b s e r v a t i o n a l S t u d yJ.M e d i c i n a(K a u n a s),2 0 2 2,5 8(2):2 0 3.2 8NO R A J,L UQMAN M,I S MA I L S,e t a l.P r o f i l i n g o f c y t o k i n e s,c h e m o k i n e s a n d o t h e r s o l u b l e p r o t e i n s a s a p o t e n t i a l b i o m a r k e r i n c o l o r e c t a l c a n c e r a n d p o l y p sJ.C y t o k i n e.2 0 1 7,9 9:3 5-4 2.论 著产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品的研制*刘茹凤,陈 驰,石继春,李 康,王 斌,王春娥,叶 强,李茂光中国食品药品检定研究院生物制品检定所细菌多糖和结合疫苗室,北京 1 0 2 6 2 9 摘 要:目的 研制产气荚膜梭菌(C P)核酸检测试剂国家参考品。方法 通过对5株产气荚膜梭菌和7株非产气荚膜梭菌的菌种检定、培养、灭活及分装,组建产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品。对参考品进行样品均匀性以及稳定性评估验证,组织3家实验室协作标定。结果 参考品由5份阳性参考品、7份阴性参考品、3份重复性参考品以及1份最低检出限参考品样本组成,均匀性和稳定性良好。协作标定结果显示:5份阳性参考品检测结果均为产气荚膜梭菌阳性;7份阴性参考品检测结果均为产气荚膜梭菌阴性;重复性参考品检测结果全部为气荚膜梭菌阳性(n=1 0,C V5.0 0%);参考品最低检出限为1.01 03个菌/m L。结论 建立了产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品,建立的国家参考品可用于产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒的质量控制。关键词:产气荚膜梭菌;核酸检测;验证;国家参考品D e v e l o p m e n t o f a n a t i o n a l r e f e r e n c e f o r n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sL I U R u f e n g,CHEN C h i,SH I J i c h u n,L I K a n g,WANG B i n,WANG C h u n e,Y E Q i a n g,L I M a o g u a n gD i v i s i o n o f B a c t e r i a l P o l y s a c c h a r i d e a n d C o n j u g a t V a c c i n e s,I n s t i t u t f o r B i o l o g i c a l P r o d u c t C o n t r o l,N a t i o n a l I n s t i t u t e s f o r F o o d a n d D r u g C o n t r o l,B e i j i n g 1 0 2 6 2 9,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T o d e v e l o p a n a t i o n a l r e f e r e n c e f o r n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n-g e n s(C P).M e t h o d s F i v e s t r a i n s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s a n d 7 s t r a i n s o f n o n-C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s w e r e t e s t e d,c u l t u r e d,i n a c t i v a t e d a n d p r e p a r e d t o e s t a b l i s h a n a t i o n a l r e f e r e n c e f o r n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s.T h e u n i f o r m i t y a n d s t a b i l i t y o f r e f e r e n c e w e r e e v a l u a t e d a n d v e r i f i e d,a n d c o l l a b o r a-t i v e c a l i b r a t i o n i n v o l v i n g 3 l a b o r a t o r i e s w a s o r g a n i z e d.R e s u l t s T h e r e f e r e n c e w a s c o m p o s e d o f 5 p o s i t i v e r e f-e r e n c e s a m p l e s,7 n e g a t i v e r e f e r e n c e s a m p l e s,3 r e p e a t a b l e r e f e r e n c e s a m p l e s a n d 1 m i n i m u m d e t e c t i o n l i m i t r e f e r e n c e s a m p l e,w i t h g o o d u n i f o r m i t y a n d s t a b i l i t y.T h e r e s u l t s o f c o l l a b o r a t i v e c a l i b r a t i o n s h o w e d t h a t a l l t h e 5 p o s i t i v e r e f e r e n c e s a m p l e s w e r e C P p o s i t i v e,a l l t h e 7 n e g a t i v e r e f e r e n c e s a m p l e s w e r e C P n e g a t i v e,t h e m i n i m u m d e t e c t i o n l i m i t o f r e f e r e n c e w a s 1.01 03 b a c t e r i a s/m L.T h e r e s u l t s o f r e p e a t a b l e r e f e r e n c e w e r e a l l C P p o s i t i v e(n=1 0,C V 5.0 0%).C o n c l u s i o n A n a t i o n a l r e f e r e n c e f o r n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s o f C l o s-t r i d i u m p e r f r i n g e n s i s e s t a b l i s h e d a n d c a n b e u s e d f o r q u a l i t y c o n t r o l o f n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n k i t s f o r C l o s t r i d-i u m p e r f r i n g e n s.K e y w o r d s:C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s;n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n;v a l i d a t i o n;n a t i o n a l r e f e r e n c e01国际检验医学杂志2 0 2 3年第4 4卷Z*基金项目:国家科 技重大专项课题(2 0 1 8 Z X 1 0 1 0 2-0 0 1-0 0 2、2 0 1 8 Z X 0 9 7 3 8 0 0 6-0 0 6);国 家 科 技 基 础 条 件 平 台-国 家 菌 种 资 源 库 课 题(NMR C-2 0 2 0-2)。通信作者,E-m a i l:q i a n g y e e n i f d c.o r g.c n。产气荚膜梭菌(C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s)是一种能够形成芽胞的革兰阳性厌氧菌,可通过毒素诱导机体发病,不仅可以导致多种动物坏死性肠炎和肠毒血症,还会引起人类食物中毒、坏死性小肠结肠炎和气性坏疽1-5。目前,发现的产气荚膜梭菌毒素至少有1 9种,其中、和为主要致死毒素6-7,根据这4种主要毒素可将产气荚膜梭菌分为A()、B(、)、C(、)、D(、)、E(、)5个类型8-1 2。不同型的产气荚膜梭菌可以导致不同的疾病,但都具有发病急、死亡快、病死率高的特点,病死率高达4 0%1 0 0%1 3。因此,快速、准确的诊断,有助于重症患者的及时治疗。目前,产气荚膜梭菌核酸检测逐渐发展,特别是基于荧光定量P C R方法研发的核酸检测试剂盒已成为主流产品。但是,目前尚无统一的产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品用于核酸检测试剂盒的质量控制和评价。本研究就研制产气荚膜梭菌国家参考品及验证进行探讨。1 材料与方法1.1 菌株 产气荚膜梭菌CMC C(B)6 4 6 0 1、6 4 7 0 1、6 4 7 2 2、6 4 7 2 3、6 4 7 2 4,生孢梭菌CMC C(B)6 4 9 4 1、溶组织梭菌CMC C(B)6 4 8 0 1、单增李斯特菌CMC C(B)5 4 0 2 3、金黄色葡萄球菌CMC C(B)2 6 0 0 1、伤寒沙门菌CMC C(B)5 0 0 7 1、福氏志贺氏菌CMC C(B)5 1 5 7 2 和大肠埃希菌CMC C(B)4 4 1 1 3 均来源于中国医学细菌保藏管理中心。1.2 主要仪器与试剂1.2.1 主要仪器 V i t e k 2 C o m p a c t 全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司);恒温培养箱(美国NUA I R E公司);二氧化碳培养箱(美国NUA I R E公司);恒温水浴箱(莱伯泰科);生物安全柜(美国NU-A I R E公司);高压灭菌器(日本H i r a y a m a公司);显微镜(O L YMP U S B X 5 1);基 因 扩 增 仪T 1 0 0(美 国B i o-R a d公司);水平电泳仪(美国B i o-R a d公司);凝胶成像分析系统(美国B i o-R a d公司);高速冷冻离心机(E p p e n d o r f 公司);A B I 7 5 0 0荧光定量P C R 仪(美国A B I公司)均由中国食品药品检定研究院提供。1.2.2 主要试剂 P r e m i x T a q 试剂、D NA m a r k e r-D L-2 0 0 0来源于大连宝生物公司;琼脂糖来源于美国P r o m e g a公司,生理盐水来源于石家庄四药;普通琼脂培养基、肉汤、T S C 琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基购自北京三药公司;B C Y E培养基购自青岛海博生物技术有限公司;D N e a s y B l o o d&T i s s u e K i t购 自Q I AG E N公 司;P C R引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成;S a n-g e r测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。标准细菌比浊管由中国食品药品检定研究院提供。用于验证和协作标定的核酸检测试剂盒有A:上海之江生物科技股份有限公司生产的产气荚膜梭状芽孢杆菌核酸测定试剂盒(荧光P C R法),货号D D-0 1 6 7-0 2,批号P 2 0 2 1 0 1 0 1;B:中山大学达安基因股份有限公司生产的产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒(P C R-荧光探针法),货号D A 3 5 7 0,批号2 0 2 0 1 1 2 6。1.3 参考菌株的鉴定 对5株阳性参考品开展了菌落形态1 4、革兰染色、生理生化特性、MO L D I-TO F M S 1 5鉴定、1 6 S r R NA基因及ML S T分子分型1 6-1 9等鉴定。1.4 菌悬液的制备 参考品菌株分别接种于适宜生长的特定培养基,于合适温度下培养,按照文献2 0-2 3中方法制备菌悬液。1.5 参考品的制备 除单增李斯特菌菌悬液稀释至1.01 06个/毫升外,其余5株阳性参考品菌株和6株阴性参考品菌株菌悬液稀释至1.01 07 个/毫升,按0.5 m L/支分装,制备阳性参考品(P)和阴性参考品(N)。分别制备1 5 0支。重复性参考品(R)和最低检出限参考品(S)为稀释至1.01 07个/毫升的产气荚膜梭菌6 4 7 2 3菌悬液,按0.8 m L/支分装,分别制备4 5 0支和1 5 0支。1 套产气荚膜梭菌国家参考品由P 1P 5、N 1N 7、R(3支)和S构成,需保存于-2 0 及以下环境中。1.6 参考品的分装均匀性评估 阳性参考品和最低检出限参考品分别随机取样1 0支,重复性参考品取样1 5支,用试剂盒A进行检测,用循环阈值C t值的C V值评估样本的均匀性。1.7 参考品的稳定性评估 设置三个温度(28、2 5 和3 7)和三个时间点(3、7、1 4 d),以-2 0 为对照,用核酸检测试剂盒B进行检测,考察阳性参考品、最低检出限参考品的稳定性。将阳性参考品、最低检出限参考品反复冻融3次和5次考察反复冻融稳定性。1.8 参考品的验证 分别用2种试剂盒对参考品的准确性、特异性、重复性和最低检出限进行验证。阳性参考品应全部为产气荚膜梭菌阳性。阴性参考品应全部为产气荚膜梭菌阴性。重复性参考品重复检测1 0次应全部为气荚膜梭菌阳性,且C t值的C V应5.0 0%。最低检出限参考品验证1.01 05、1.01 04、1.01 03、1.01 02个/毫升4个稀释度。1.9 参考品的协作标定 将整套参考品分发给2家协作标定实验室,并按照协作标定作业指导书中的实验方法,用各企业生产的试剂盒进行检测,将结果汇总后在规定时间内返回,统计分析原始数据,以确定参考品的特性量值。2 结 果2.1 菌种鉴定 1 2株参考品制备使用菌株的菌落形11国际检验医学杂志2 0 2 3年第4 4卷Z态、革兰氏染色、生化鉴定结果、MO L D I-TO F M S鉴定、1 6 S r R NA基因及ML S T分子分型分析结果均符合各菌的菌种特征。2.2 参考品的分装均匀性评估 本研究显示,阳性参考品(P 1P 5)和最低检出限参考品及重复性参考品C t值的C V均在5.0 0%以内,说明参考品的分装均匀度良好。见表1。表1 参考品的分装均匀度编号C t值均值S DC V(%)P 12 6.30.3 51.3 4P 22 5.2 60.2 20.8 7P 32 5.1 80.1 70.6 6P 42 3.80.2 41.0 2P 52 4.3 50.20.8 1S-1 062 3.6 50.2 30.9 6R2 4.0 50.2 81.1 52.3 参考品的稳定性评估2.3.1 冻融稳定性评估 参考品反复冻融3、5次处理后,冻融3、5 次P=0.6 9 2,P0.0 5,表明C t值差异无统计学意义,本参考品具有很好的冻融稳定性。2.3.2 加速稳定性评估 参考品28 放置后P=0.9 9 1,P0.0 5,表明C t值差异无统计学意义;2 5 放置后P=0.9 4 7,P0.0 5,表明C t值差异无统计学意义;3 7 放置后P=0.8 2 8,P0.0 5,表明C t值差异无统计学意义。本参考品在加速破坏条件下,具有较好的稳定性,可以满足运输、使用等的稳定性要求。2.4 参考品的验证 用试剂盒A 和B对参考品验证,结果显示准确性、特异性、重复性均符合要求;最低检出限均能达到11 03个/毫升。2.5 参考品的协作标定 3家协作标定实验室分析结果见表2,其中阳性参考品均检测为气荚膜梭菌阳性;阴性参考品均检测为气荚膜梭菌阴性;重复性参考品的检测结果C t值的变异系数均在5.0 0%以内;最低检出限参考品在11 03个/毫升均能检出,11 02个/毫升均不能检出。表2 协作标定结果编号P 1P 5N 1N 7(R)C t 值的C V(%)1.01 05个/毫升1.01 04 个/毫升1.01 03 个/毫升1.01 02 个/毫升A+/+(5/5)-/-(7/7)0.4 5/0.4 3+-A中+/+(5/5)-/-(7/7)0.8 9/1.2 4+-B+/+(5/5)-/-(7/7)0.8 9/0.9 0+-B中+/+(5/5)-/-(7/7)1.2 8/1.2 8+-注:“+”表示检出,“-”表示未检出;A中、B中为中国食品药品检定研究院的检测结果。3 讨 论关于产气荚膜梭菌核酸检测试剂用国家参考品,国外情况是选用模式菌株AT C C 1 3 1 2 4,没有成套的多种毒素分型的参考品。国内尚无相关产品,本研究成功构建了产气荚膜梭菌核酸检测试剂用国家参考品,填补该菌株在核酸检测试剂参考品需求的空白,促进快速准确诊断该菌株的试剂质量水平的提高。产气荚膜梭菌在污水、土壤、垃圾、人和动物的粪便以及食品中均可检出,土壤中检出率高达1 0 0%。被污染的食物主要是肉类和鱼贝等蛋白值性食物,存放时间太久和加热不足使细菌大量繁殖,形成芽孢时产生大量的肠毒素,引起食源性疾病2 4。所以产气荚膜梭菌核酸检测试剂用国家参考品的研发与应用是时代的需要。本研究对产气荚膜梭菌候选菌株进行了筛选鉴定,并完成了参考品原料的制备,建立了产气荚膜梭菌核酸检测用国家参考品。菌株全部来自中国医学细菌保藏管理中心,共1 2株,其中气荚膜梭菌菌株5株,选取同属不同种的生孢梭菌和溶组织梭菌伯菌以及其他常见的病原体如单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、福氏志贺菌、大肠埃希菌等作为阴性参考品制备菌株。所选制备参考品用标准菌种鉴定准确,均具有典型的遗传特征以及良好的多样性,包括A型B型C型3个毒性强人类主要感染类型,具有代表性。标准物质均匀性和稳定性是评价参考品质量的关键参数2 5,通过系统验证本研究完成了参考品原菌液的制备、参考品的制备、参考品的分装均匀性和稳定性评估、参考品的验证2 6-3 0(包括准确度、特异度、重复性和最低检出限),并开展了有其他2家不同实验室参加的协作标定。验证结果表明,本参考品可用于不同企业生产的产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒的准确性、特异性、重复性和最低检出限等指标的评价。产气荚膜梭菌核酸检测试剂国家参考品长期保存于-2 0 及以下环境中,需要定期进行稳定性监测,评价参考品的稳定程度2 8-3 0。21国际检验医学杂志2 0 2 3年第4 4卷Z本参考品的各项检定均符合规定,具有良好的均匀性、稳定性和最低检出限,可以满足产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒的性能评价各项的要求。参考文献1E VY G,S T E F AN I E V,VA L GA E R E N B R,e t a l.T o x i n-n e u t r a l i-z i n g a n t i b o d i e s p r o t e c t a g a i n s t C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s-i n d u c e d n e c r o s i s i n a n i n t e s t i n a l l o o p m o d e l f o r b o v i n e n e c r o h e m o r r h a g i c e n t e r i t i sJ.BMC V e t R e s,2 0 1 6,1 2(1):1 0 1.2 孙雨,王晓英,董浩,等.产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展J.中国草食动物科学,2 0 1 6,3 6(2):5 8-6 2.3 韦良孟,李昌明,翁鸿宇,等.C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌二价二联类 毒素疫苗的 创 制 及 其 效 果 评 价 J.山 东 畜 牧 兽 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著多发性骨髓瘤患者外周血m i R-1 5 5、I L-1 0/I L-1 7 A变化及对化疗反应性的预测价值分析*杨琪玫1,陈乐川2,赵 妍3,蔡宋浩1,陈素珊1,叶俊彬1,林树洪1,于瑞芳1,洪少杰1汕头市中心医院:1.血液科;2.检验科;3.中心实验室,广东汕头 5 1 5 0 3 1 摘 要:目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)患者外周血微小核糖核酸-1 5 5(m i R-1 5)、白细胞介素(I L)-1 0/I L-1 7 A变化及对化疗反应性的预测价值。方法 选取2 0 1 9年1月至2 0 2 1年3月在该院确诊的MM患者6 0例为观察组,另选取同期体检健康者6 0例为对照组。观察组化疗前后、对照组体检时均检测外周血m i R-1 5 5、I L-1 0、I L-1 7 A,并计算I L-1 0/I L-1 7 A。对比观察组不同患者化疗后缓解情况,L o g i s t i c回归方程分析MM患者化疗反应性的影响因素,经相对超危险度比(R E R I)、归因比(A P)、交互作用指数(S I)分析m i R-1 5 5、I L-1 0/I L-1 7 A在MM患者化疗反应性中的交互作用,受试者工作特征(R O C)曲线分析外周血m i R-1 5 5、I L-1 0/I L-1 7 A31国际检验医学杂志2 0 2 3年第4 4卷Z*基金项目:广东省医学科学技术研究基金项目 粤卫函(2 0 1 9)6 3 4号。