萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响.pdf

Vol.41 No.2Jun.2023第 41 卷 第 2 期2023 年 6 月经 济 林 研 究 Non-wood Forest Research收稿日期：2022-09-20基金项目：河南省科技重大专项（201300110900）；国家自然科学基金项目（32071752）。第一作者：刘玉芳（），硕士研究生。通信作者：张党权（），教授，博士，博士研究生导师；何功秀（），副教授，博士，硕士研究生导师。引文格式：刘玉芳,刘芬,宋宇坤,等.萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响 J.经济林研究,2023,41(2):272-281.LIU Y F,LIU F,SONG Y K,et al.Effects of extraction methods on antibacterial and antioxidant activities of the extracts from Rosmarinus officinalis processing residuesJ.Non-wood Forest Research,2023,41(2):272-281.萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌 和抗氧化活性的影响刘玉芳1，刘 芬2，宋宇坤1，张春玲3，马菁华1，马冬丽1，张盼盼1，李明婉1，赖 勇1，丁 申1，何功秀4，张党权1（1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002；2.抚州市林业科学研究所，江西 抚州 344000；3.河南省新密市林业局，河南 郑州 452370；4.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004）摘 要：【目的】为实现迷迭香提取精油后残渣的高值化利用提供参考。【方法】以迷迭香提取精油后固体残渣为原料，分别采用溶剂提取（CSE）、超声波辅助提取（UAE）、超临界CO2萃取（SC-CO2）和亚临界萃取（SE）4 种方法对有效组分进行提取，采用液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪进行成分分析，通过分析对 DPPH、ABTS、羟基等 3 种自由基的清除能力综合评估所得提取物的抗氧化能力，采用抑菌圈、最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）3 个指标评价提取物的抑菌效果。【结果】4 种提取物中的主要活性物质为鼠尾草酚、齐墩果酸和熊果酸等萜类化合物，木樨草素、橙皮素、香叶木苷和橙皮苷等黄酮类化合物，以及鼠尾草酸和绿原酸等酚酸类化合物。采用 4 种方法所得提取物均具有显著的抗氧化效果，其抗氧化能力由强到弱依次为 SC-CO2、CSE、UAE、SE。采用 4 种方法所得提取物均对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果由强到弱依次为 SC-CO2、SE、CSE、UAE，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果由强到弱依次为 SC-CO2、SE、UAE、CSE，其中采用 SC-CO2所得提取物对蜡状芽孢杆菌有明显的抑制作用；综合分析对 5 种供试菌种的抑菌圈、MIC 和 MBC，抑菌能力由强到弱依次为 SC-CO2、UAE、SE、CSE。【结论】SC-CO2为回收迷迭香加工残渣抗氧化和抑菌成分的最优途径。关键词：迷迭香；加工残渣；萃取方法；抗氧化；抑菌中图分类号：S573+.9 文献标志码：A 文章编号：10038981(2023)02027210Effects of extraction methods on antibacterial and antioxidant activities of the extracts from Rosmarinus officinalis processing residuesLIU Yufang1,LIU Fen2,SONG Yukun1,ZHANG Chunling3,MA Jinghua1,MA Dongli1,ZHANG Panpan1,LI Mingwan1,LAI Yong1,DING Shen1,HE Gongxiu4,ZHANG Dangquan1(1.College of Forestry of Henan Agriculture University,Zhengzhou 450002,Henan,China;2.Research Institute of Forestry Science,Fuzhou 344000,Jiangxi,China;3.Xinmi Forestry Bureau,Zhengzhou 452370,Henan,China;4.Central South University of Forestry&Technology,Changsha 410004,Hunan,China)Abstract:【Objective】To provide the reference for the high value utilization of the rosemary solid waste.【Method】The effective components of the rosemary processing residue were extracted by solvent extract(CSE),ultrasonic-assisted extraction(UAE),supercritical CO2 extraction(SC-CO2)and subcritical extraction(SE),respectively,and three free radical scavenging capabilities of DPPH,ABTS and hydroxyl group were evaluated by the antibacterial sphere,minimum antibacterial concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC).【Result】The main active substances Doi:10.14067/ki.1003-8981.2023.02.028http:/273第 41 卷经 济 林 研 究迷迭香 Rosmarinus officinalis（异名 Salvia rosmarinus），是唇形科的多年生芳香常绿灌木，原产地为环地中海沿岸地区，已在我国成功引种并得到广泛推广。迷迭香富含各种天然生物活性物质，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌等作用，被广泛应用于化妆品、医药、食品添加剂和生物防治等方面。迷迭香的传统用途主要为食用和药用，其叶片被广泛用作香料和调味料1，叶片和枝条的煎剂被用来治疗低血压、腹痛、腹泻，叶片的浸液被用于滋补、镇咳、祛痰、抗哮喘、退热和抗麻痹2。迷迭香还具有良好的驱虫、抑制杂草、水土涵养等生态功效，已被用作油茶等经济林的套种经济作物3。迷迭香精油作为传统的多用途精油，具有高抗氧化和抑菌活性，有利于人体健康以及食品保存。随着对迷迭香精油活性成分研究的逐步深入，迷迭香精油在食品加工、芳香理疗、医学和其他领域的应用也逐步增多。然而，在植物精油制备过程中，通过水蒸气蒸馏将植物中的精油成分提取出后，剩余大量的固体残渣，目前精油残渣未得到高值化的开发利用。填埋或焚烧是精油残渣的常规处理方式，不仅成本高，还会引起环境问题4，可通过深加工实现高值化利用并减少产业污染5。近年来，国内外关于芳香植物固体残渣的开发利用研究主要集中在堆肥、动物饲料和生物吸附等方面6。研究结果表明，迷迭香叶片提取精油后的固体残渣中仍含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等具有抗氧化活性的物质，其中鼠尾草酸对油脂具有较好的抗氧化活性，迷迭香酸有明显的抗炎症、抗氧化、免疫抑制等药理作用，这些活性物质在化妆品、药品与食品等生产领域均存在巨大的应用潜力7-8，传统的利用方式并未充分发挥这些精油残渣的剩余价值。使用适宜的萃取方法将这些活性成分提取出来，了解提取物的抗氧化与抑菌等生物活性，可为其高值化利用提供科学依据9。萃取方法对残渣中活性物质的回收与利用具有重要影响，使用不同萃取方法所得提取物中活性成分的含量和种类存在差异。了解使用不同萃取方法所得提取物活性成分的共性和差异，有利于根据不同用途的要求，选择适宜的萃取方法，可为迷迭香加工残渣中活性成分的高效提取与利用提供理论依据。溶剂提取是最常用的迷迭香天然抗氧化成分提取方法，虽成本低且易于扩大规模，但存在选择性低和溶剂残留等缺点。毕良武等10采用极性溶剂和非极性溶剂的两步提取法从迷迭香中提取抗氧化剂成分，提取率为 16.08%，其中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等活性成分的含量分别为 17.78%、6.23%和 3.37%。超声波辅助提取是通过将发射超声波的探头直接插到混有原料的溶剂中，使原料直接受超声波的作用，促使原料中的有效成分快速溶于溶剂中，具有操作简便、工艺周期短、有效成分不被破坏等优点。罗小芳等11采用超声波辅助提取法从迷迭香叶中提取鼠尾草酸，提取率高达 93.6%，表明超声波辅助提取能显著提高鼠尾草酸的提取效率。超临界CO2萃取具有超低温、无毒、可回收等优势12，且不破坏有效成分的活性，常被用于提取迷迭香酚类化合物13。亚临界萃取也具有低温、无毒、可回收等优点，不易破坏有效成分，且提取溶剂用量少，适合用于工业化生产，目前已开始被用于迷迭香精油提取及抗氧化剂制备14。本试验中选取上述 4 种萃取方法，对迷迭香加工残渣进行提取对比研究，解析不同萃取方法of rosemary and essential oil residue extract was sage phenol,cidun acid and guago acid,melago,hesperidin,gerinin and hesperidin flavonoids,and sage acid and chlorogenic acid organic acids.All four extracts showed significant antioxidant effects.The comprehensive evaluation of its antioxidant capacity was successively decreased as:SC-CO2,CSE,UAE,SE.All four extracts significantly inhibited gram-positive bacteria(Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis).the antibacterial effects on Staphylococcus aureus were observed successively decreased as:SC-CO2,SE,CSE,UAE.The antibacterial effect on Bacillus subtilis was observed successively decreased as:SC-CO2,SE,UAE,CSE,among which,SC-CO2 showed significant inhibition of Bacillus cereus.The bacteriosphere diameter was(10.710.78)mm.Considering the antibacterial coil diameter,MIC and MBC of the five tested species,the antibacterial ability was successively decreased as:SC-CO2,UAE,SE,CSE.【Conclusion】SC-CO2 can be regarded as a new way with better antioxidant and antibacterial effects from the rosemary processing residue.Keywords:Rosmarinus officinalis;processing residue;extraction methods;antioxidation;bacteriostasis274第 2 期刘玉芳，等：萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响下迷迭香加工残渣的活性成分及其抗氧化与抑菌活性，筛选具有前景的最优萃取方法，从而为迷迭香残渣的抗氧化剂和抑菌产品的高值化开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器样品：在河南省禹州市禾丰农业发展有限公司的迷迭香种植基地进行采样，采样部位为当年生成熟叶片。将迷迭香叶片采摘后，进行自然晾干。晾干后的迷迭香叶片通过水蒸气蒸馏法提取精油后的剩余物即迷迭香加工残渣。菌种：金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、沙门氏菌 Salmonella、蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 均由河南农业大学经济林实验室提供，各菌种已经过鉴定。仪器：XH-2008DE 智能温控双频超声波合 成/萃取仪购自北京祥鹄科技发展有限公司，亚临界双溶剂萃取仪购自河南省亚临界生物技术有限公司，SFE-2 超临界流体萃取仪购自美国 Applied Separations 公 司，Gen5 酶 标 检 测 仪 购 自 美 国Biotek 公司，Heraeus Megafuge 8R 高速冷冻离心机购自郑州金友宁仪器有限公司，Q-Exactive Plus System 液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪购自美国 Thermo Fisher 公司。1.2 试验方法1.2.1 成分提取样品前处理：将迷迭香加工残渣放入烘箱完全干燥后取出，用粉碎机粉碎、过筛（孔径 0.18 mm），得到迷迭香加工残渣粉末。1）溶剂提取（conventional solvent extraction，CSE）。称取 15.0 g 迷迭香加工残渣粉末，加入300 mL 无水乙醇，加热回流 2 h，抽滤提取液，将抽滤后的提取液进行旋转蒸发，浓缩至 20.0 mL 左右，放入烘箱烘干，收集备用15-16。2）超声辅助提取（ultrasoni-assisted extraction，UAE）。称取 1.5 g 迷迭香加工残渣粉末，加入37.5 mL 无水乙醇，提取 2 h，提取温度为 50，抽滤提取液，将抽滤后的提取液进行旋转蒸发，浓缩至20.0 mL左右，放入烘箱烘干，收集备用17。3）超临界CO2流体萃取（supercritical CO2 fluid extraction，SC-CO2）。称取 8.0 g 迷迭香加工残渣粉末，加入体积分数为 95%的乙醇作为夹带剂，夹带剂与迷迭香粉末的质量比为 25，萃取压力4104 kPa，萃取 3 h，收集萃取物烘干备用18。4）亚临界萃取（subcritical extraction，SE）。称取100 g迷迭香加工残渣，加入1.5 L的正丁烷，提取 0.5 h，得到膏状提取物，烘干备用。1.2.2 成分分析采用液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪对迷迭香加工残渣提取物进行成分分析。色谱条件：采用 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱（150 mm3 mm，1.8 m）；以 0.1%甲酸水溶液为流动相 A，以 0.1%甲酸乙腈为流动相 B，线性梯度类型为 ramp；柱温 30，进样盘温度4，自动进样 5 L。0 15 min，B 从 5%变为95%；15 18 min，B 保持 95%；18 20 min，B 从 95%变为 5%；20 23 min，B 保持 5%，流速 0.3 mL/min。质谱条件：可加热的电喷雾离子源（HESI），正离子扫描模式，喷雾电压 3.50 kV，毛细管温度350，辅助气加热温度 200，雾化氮气压强3.5104 Pa，辅助气压强 7.0104 Pa，离子扫尾气压强 3.5103 Pa，鞘气流速为 40 L/min，辅助气为 10 L/min。采用 Full Ms/dd-MS2 扫描模式，一级全扫描分辨率为 70 000，自动增益控制目标离子数为 1106；扫描范围 80 1 000 m/s，二级扫描分辨率为 17 500，自动增益控制目标离子数为 2105；分离窗口 1.0 m/z，碰撞能为 20%、40%、60%。利用TraceFinder 3.3软件，结合谱库进行目标物的定性，建立目标物筛查方法 OTCML Screening，匹配度分值不小于 80。采用面积归一法进行定量分析，得出相对含量。1.2.3 抗氧化能力分析1）DPPH 自由基清除能力测定。将提取物用无水乙醇按二倍稀释法稀释成 2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 mg/L 质量浓度梯度的溶液，将维生素 C 用去离子水稀释成相同质量浓度梯度的溶液作为阳性对照，将 20 L 待测样品溶液和 180 L DPPH 工作液在 96 孔板中混合，室温下避光反应 30 min 后，用酶标仪在 517 nm 波长下测定吸光度，每个样品和对照均重复测定 3 次。R1=1-(A1-A2)/A0100%。式中：R1为 DPPH 清除率；A0为无水乙醇与 DPPH 工作液的混合溶液的吸光度；A1为 DPPH 工作液与不同浓度迷迭香提取物或维生素 C 混合溶液的吸光度；A2为不同浓度提取物与无水乙醇混合溶液的吸光度。2）ABTS 自由基清除能力测定。将浓度为 7 mmol/L 的 ABTS 溶液与 2.45 mmol/L 过硫酸钾275第 41 卷经 济 林 研 究溶液等体积混合，室温避光放置 16 24 h，即储存液，用无水乙醇稀释，制得在 734 nm 处吸光度为 0.700.02 的工作液，备用。将提取物用无水乙醇按二倍稀释法稀释成 2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 mg/L 质量浓度梯度的溶液，将维生素 C 用去离子水稀释成相同质量浓度梯度的溶液作为阳性对照，将 20 L 待测样品溶液和180 L ABTS 工作液在 96 孔板中混合，避光反应6 min，用酶标仪在 734 nm 波长下测定吸光度，每个样品和对照均重复测定 3 次19-20。R=1-(A1-A2)/A0100%。式中：R 为 ABTS 自由基清除率；A0 为无水乙醇与 ABTS 工作液的混合溶液的吸光度；A1 为ABTS 工作液与不同浓度迷迭香提取物或维生素 C混合溶液的吸光度；A2 为不同浓度提取物和无水乙醇混合溶液的吸光度。3）羟基自由基清除能力测定。采用水杨酸法测定羟基自由基清除能力，准备 96 孔板，分别加入 200 L 的 6 mol/L 硫酸亚铁溶液、200 L的 6 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液，将提取物用无水乙醇稀释成 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/L 质量浓度梯度的溶液，加入待测提取液100 L（空白对照是以去离子水代替提取液），最后加入 200 L 的 6 mmol/L 过氧化氢溶液，摇匀，35 水浴 30 min，用酶标仪于 510 nm 波长处测其吸光度，由于样液本身具有吸光度，测其本底值时用去离子水代替过氧化氢，根据公式计算其羟基自由基清除率（R）21-22。R=(A0-A1+A2)/A0100%。式中：A0 为空白对照吸光度；A1 为加入样品溶液后的吸光度；A2 为本底吸光度。1.2.4 抑菌效果分析菌悬液制备。配制 MHA 培养基，将各供试菌种接种于 MHA 培养基上，放入 37 恒温培养箱活化 24 h，各供试菌种连续活化 3 代。配制 MHB培养基，用接种环挑单菌落至 MHB 培养基上，放入摇床，37 条件下培养 8 10 h，培养结束后，取适量菌悬液，用无菌水稀释至指定浓度（使用紫外分光光度计在 625 nm 波长下测定吸光度为0.08 0.10，每毫升样品中含有的细菌群落总数为 1.5108），再将其稀释至每毫升样品中含有细菌群落总数为 1.0106的菌悬液。1）抑菌圈。用打孔器打制若干直径为 6 mm的圆形滤纸片，经高压灭菌后备用。吸取 100 L稀释好的菌液至 MHA 培养基中，均匀涂抹菌液，吹干，用无菌镊子夹取滤纸片，每个培养基贴 3 个点，每个点贴 2 层滤纸片，滴加 4 L 质量浓度为 20 g/L 的提取物，每个菌种做 3 个重复，37 条件下培养 24 h，使用游标卡尺分别测量每个抑菌圈 2 个垂直方向的直径，取平均值。2）最小抑菌浓度（MIC）。采用二倍肉汤稀释法，使用 96 孔板，对提取物进行 MIC 的测定。将提取物用液体培养基进行倍比稀释，得到质量浓度梯度为 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 g/L 的样品。分别加入 150 L致病菌悬液，不同浓度样品 50 L，37 条件下培养 24 h，观察菌液生长情况，菌液透明澄清时所对应的最小浓度即 MIC，重复测定 3 次。3）最小杀菌浓度（MBC）。根据 MIC 的测定结果，取不同浓度的菌液各 2 L，点植于培养基上，37 条件下培养 24 h，观察细菌生长状况，不生长菌落时对应的最低提取物浓度即 MBC23。1.3 数据分析使用 SPSS 23 和 Origin 2021 软件进行数据统计与分析。2 结果与分析2.1 萃取方法对提取物成分的影响采用 4 种萃取方法，使用液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪测得的迷迭香加工残渣提取物的总离子流如图 1 所示。采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物活性成分的相对含量见表 1。根据表 1 中结果可知，采用 4 种萃取方法萃取的活性物质在成分和相对含量上均存在一定的差异，其中采用 CSE法萃取出 16 种化合物，采用 UAE 法萃取出 17 种化合物，采用 SC-CO2法萃取出 18 种化合物，采用 SE 法萃取出 8 种化合物。检测出的活性物质分别为鼠尾草酸、鼠尾草酚、齐墩果酸和熊果酸等萜类化合物，槲皮素、芹菜素、木樨草素、香叶木素、橙皮苷等黄酮类化合物，迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸等酚酸类化合物。采用 UAE和 SC-CO2法所得提取物中活性化合物的相对含量较高，分别为 10.04%和 10.03%，采用 CSE 和SE 法所得提取物中活性化合物的相对含量分别为7.67%和 5.01%。其中：采用 SC-CO2法提取到的萜类化合物相对含量最高，为 9.35%；采用 CSE、UAE 和 SE 法提取到的萜类化合物的相对含量依次为 6.76%、8.06%、4.38%。采用 UAE 法提取到的黄酮类化合物相对含量较高，为 1.70%；采用CSE、SC-CO2和 SE 法提取到的黄酮类化合物相对含量依次为 0.58%、0.62%、0.60%。此外，采276第 2 期刘玉芳，等：萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 这 4 种萃取方法均能从迷迭香加工残渣中提取出酚酸类化合物，相对含量依次为 0.34%、0.29%、0.06%和 0.02%。综合来看：相较于 CSE，采用 UAE 法能够更高效地从迷迭香加工残渣中回收萜类和黄酮类化合物，原因可能在于超声空化作用提高了植物细胞壁的破碎度，更有利于活性成分的溶出；SC-CO2的低温萃取优势在一定程度上避免了鼠尾草酸在高温下转化为鼠尾草酚，采用该方法能够高效地从迷迭香加工残渣中回收萜类化合物；在 SE法中使用正丁烷为溶剂，根据相似相溶原理，在低压和低温条件下萃取，增加了齐墩果酸和鼠尾草酸等活性物质的溶解性，相较于其他 3 种萃取方法能够更高效地从迷迭香加工残渣中回收萜类化合物。2.2 萃取方法对提取物抗氧化活性的影响2.2.1 DPPH 自由基清除能力采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 DPPH 自由基清除能力如图 2A 所示。由图2A 可知，采用 4 种方法所得提取物的 DPPH 自由图 1 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的总离子流Fig.1 Total ion flow of rosemary-processed residue extracts obtained by different extraction methods表 1 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物活性成分的相对含量 Table 1 Active ingredient and relative content of rosemary processing residue extract%编号No.成分名称Component name各方法条件下的相对含量 Relative conten under the condition of each method编号No.成分名称Component name各方法条件下的相对含量 Relative conten under the condition of each methodCSEUAESC-CO2 SECSEUAESC-CO2 SE1绿原酸0.010.050.0210芹菜素0.050.130.030.052咖啡酸0.030.080.020.0211山柰酚0.050.013香叶木苷0.100.690.0312橙皮素0.160.250.074橙皮苷0.190.230.110.1113白杨素0.260.305阿魏酸0.060.030.0214香叶木素0.020.040.020.446迷迭香酸0.240.130.0115鼠尾草酚6.066.666.211.227高车前苷0.020.020.0216齐墩果酸0.130.502.001.648木犀草素0.020.030.0317鼠尾草酸0.440.871.061.419槲皮素0.020.0118熊果酸0.120.030.070.12“”代表该物质未检出。“”represents that the substance was not detected.277第 41 卷经 济 林 研 究基清除率均随提取物浓度的增大而增大。当提取物质量浓度高于 1.28 g/L 时，采用 SC-CO2法所得提取物的 DPPH 自由基清除率升高速度减缓；当提取物质量浓度高于 2.56 g/L 时，采用 SE 法所得提取物的 DPPH 自由基清除率升高速度减缓，当样品质量浓度为 2.56 g/L 时，采用 4 种萃取方法所得提取物的 DPPH 自由基清除率的差异显著（P 0.05）；采用 4 种萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 DPPH 自由基清除效果显著，当提取物质量浓度为 10.24 g/L 时，采用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 法所得提取物的 DPPH 自由基清除率依次高达 95.73%、95.12%、95.26%和 94.88%。采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物清除DPPH自由基的IC50（半抑制浓度）如图3所示。由图 3 可知，提取物的 DPPH 自由基清除能力由强到弱依次为 SC-CO2、CSE、SE、UAE，其中：采用 SC-CO2法所得迷迭香加工残渣提取物的 DPPH自由基清除能力最强，IC50为(327.432.48)mg/L；采用 UAE 法所得提取物的 DPPH 自由基清除能力最弱，IC50为(1 353.67347.43)mg/L。综合表 1中检测结果，即采用 SC-CO2法所得迷迭香加工残渣提取物中鼠尾草酸和齐墩果酸的相对含量处于较高水平，可知鼠尾草酸和齐墩果酸清除 DPPH自由基能力较强。2.2.2 ABTS 自由基清除能力采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 ABTS 自由基清除能力如图 2B 所示。由 图 2B 可知，采用 4 种方法所得提取物的 ABTS自由基清除率均随提取物浓度的增大而增大，当样品质量浓度为 0.32 g/L 时，采用 4 种萃取方法所得提取物的 ABTS 自由基清除率的差异显著（P 0.05）。采用 4 种萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 ABTS 自由基清除效果显著，当提取物质量浓度为 10.24 g/L 时，采用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 法所得提取物的 ABTS 自由基清除率依次可达 98.18%、98.48%、99.34%和 99.99%。采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物清除 ABTS 自由基的 IC50如图 3 所示。由图 3 可知，提取物的 ABTS 自由基清除能力由强到弱依次为 UAE、SC-CO2、CSE、SE，其中：采用 UAE 法所得迷迭香加工残渣提取物的 ABTS 自由基清除能力最强，IC50为(152.136.82)mg/L；采用SE 法所得提取物的 ABTS 自由基清除能力最弱，IC50为(367.306.92)mg/L。综合表 1 中检测结果，即采用 UAE 法所得迷迭香加工残渣提取物中鼠尾草酚的相对含量最高，香叶木苷和橙皮苷等黄酮类物质的相对含量也处于较高水平，可知鼠尾草酚和黄酮类物质具有较强清除 ABTS 自由基的 能力。图 2 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 抗氧化效果Fig.2 Antioxidant effect of rosemary processing residue extract using different extraction methods2.2.3 羟基自由基清除能力采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取278第 2 期刘玉芳，等：萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响物的羟基自由基清除能力如图 2C 所示。由图 2C可知，采用 4 种方法所得提取物的羟基自由基清除率均随提取物浓度的增大而增大，当样品质量浓度为 6 g/L 时，采用 4 种萃取方法所得提取物的羟基自由基清除率的差异显著（P 0.05）。采用4 种萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的羟基自由基清除效果显著，当提取物质量浓度为20 g/L时，采用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 法所得提取物的羟基自由基清除率依次可达 93.38%、94.68%、99.14%和 82.71%。采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物清除羟基自由基的 IC50如图 3 所示。由图 3 可知，提取物的羟基自由基清除能力由强到弱依次为 SC-CO2、CSE、UAE、SE，其 中：采 用 SC-CO2法所得迷迭香加工残渣提取物的羟基自由基清除能力最强，IC50为(3.590.09)g/L；采用 SE法所得提取物的羟基自由基清除能力最弱，IC50为(10.280.55)g/L。综合表 1 中检测结果，即相较于 SE 来说，采用 SC-CO2、CSE 和 UAE 这 3 种萃取方法所得提取物的种类和相对含量均具有显著优势，可知采用这 3 种萃取方法所得提取物均具有显著的羟基自由基清除能力。图 3 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物的 抗氧化 IC50Fig.3 Antioxidant IC50 of rosemary processing residue extracts obtained by different extraction methods研究结果表明，迷迭香中主要的抗氧化成分为二萜酚类、黄酮类，还有少量的三萜类化合物。根据表 1 可知，在迷迭香加工残渣提取物中检测到的抗氧化活性较强的化合物为迷迭香酸、咖啡酸、鼠尾草酚和鼠尾草酸。采用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 法所得提取物中抗氧化活性物质的相对含量依次为 6.77%、7.74%、7.30%和 2.65%，与测定的抗氧化结果相吻合。2.3 萃取方法对提取物抑菌活性的影响2.3.1 抑菌圈采用 4 种方法提取的迷迭香加工残渣提取物的抑菌圈如图 4 所示，其具体直径见表 2。综合来看，采用 4 种萃取方法所得提取物主要对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌）有明显抑制效果，对革兰氏阴性菌（沙门氏菌和大肠杆菌）无明显抑制效果，这一结果与 Weerakkody 等24和 Tornuk 等25的研究结果相符合，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更敏感。当迷迭香加工残渣提取物质量浓度为 20 g/L 时，采用 4 种萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物均对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的抑制效果，其中采用 SC-CO2法所得提取物对蜡状芽孢杆菌有明显的抑制效果，且在该质量浓度下采用 4 种萃取方法所得提取物对沙门氏菌和大肠杆菌均无明显抑制效果。综上所述，采用 SC-CO2法所得迷迭香加工残渣提取物的抑菌效果最强，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为(13.880.44)、(11.580.60)、(10.710.78)mm。2.3.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度表 3 中所示为采用 4 种萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物对 5 种供试菌种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。结果表明：采用 4 种萃取方法所得提取物对这 5 种菌均有明显的抑制作用，其中采用 SC-CO2法所得提取物的抑制效果最佳，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为 0.63 g/L，对枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度为 0.16 g/L，对沙门氏菌的最小抑菌质量浓度为 2.50 g/L，对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为 5.00 g/L；采用 4 种萃取方法所得提取物对这 5 种菌均有明显的杀菌作用，其中采用 SC-CO2法所得提取物的杀菌效果最佳，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌质量浓度为 1.25 g/L，对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的最小杀菌质量浓度为 0.31 g/L，对沙门氏菌的最小杀菌质量浓度为 5.00 g/L，对大肠杆菌的最小杀菌质量浓度为 10.00 g/L。综合可知：采用 SC-CO2法所得提取物对革兰氏阳性菌具有最佳的抑制效果，原因可能在于其中抗氧化活性物质鼠尾草酸的相对含量较高，达 1.06%，此外，齐墩果酸和熊果酸也具有一定的抑菌效果，这可能是采用 SE 法所得提取物的抑菌效果较显著的原因；采用 UAE 法和 CSE 法所得提取物对革兰氏阳性菌也具有一定的抑制效果，提取物成分种类丰富，含量也相对较高。279第 41 卷经 济 林 研 究3 结论与讨论以迷迭香加工残渣为原料，采用 CSE、UAE、SC-CO2和 SE 这 4 种萃取方法，对液相色谱-质谱联用检测结果进行了对比分析。结果表明，采用 4 种萃取方法均能有效提取出多种活性成分，活性成分主要为萜类、酚酸类和黄酮类化合物。通过抗氧化和抑菌活性综合分析得出，采用 SC-CO2法所得提取物的抗氧化和抑菌效果均为最佳，该方法为高效提取与回收利用迷迭香残渣中成分的最佳途径。通过比较采用 UAE 和 CSE 法所得提取物，可以发现超声辅助提取能够较好地提高活性物质的萃取效率。另外，虽然采用 SE 法所得提取物的活性成分相对含量及抗氧化效果不是最佳的，但是该方法对齐墩果酸和熊果酸这些三萜类第 1 5 列依次为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌。Columns 1 to 5 are Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Bacillus cereus,Salmonella,Escherichia coli,respectively.图 4 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物对致病菌的抑菌圈Fig.4 The inhibition zones of rosemary extracts obtained by using different extraction methods to pathogenic bacteria表 2 采用不同萃取方法所得迷迭香加工残渣提取物对致病菌的抑菌圈直径Table 2 The diameters of inhibition zones of rosemary extracts by using different extraction