DB22-T3455-2023分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光PCR法.docx

ICS 65.020CCS B 05DB22吉林省地方标准DB 22/T 34552023 分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光PCR 法Detection of onion yellow dwarf virus by real-time PCR on Shallot 2023 - 02 - 27 发布2023 - 03 - 27 实施吉林省市场监督管理厅发 布 DB22/T 34552023前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则和GB/T 20001.42015标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的规定起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：吉林省农业科学院。 本文件主要起草人：李小宇、张春雨、王海鹏、王永志、苏颖、李建平、张金花、杨阳、于红。I DBXX/ XXXXXXXXX分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测 实时荧光 PCR 法警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围本文件描述了分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒实时荧光 PCR 检测方法。本文件适用于分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒的检测。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过中文的规范性引用而构成本文件的必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 28067 甘蔗黄叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 3 术语和定义GB/T 28067 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原 理比对洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因，设计一对仅在洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物。提取分蘖洋葱总 RNA，在反转录酶作用下反转录成 cDNA，并以其为模板，利用 Taq 酶进行实时荧光 PCR 扩增反应（采用 SYBR Green 荧光染料方法）。SYBR Green 是一种具有绿色激发波长的染料，能够与双链 DNA 小沟区域结合。游离状态的 SYBR Green 只发出微弱的荧光，当与双链 DNA 结合后， 荧光强度会显著增加，而且荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 5 试剂或材料5.1 试剂5.1.1 水：符合 GB/T 6682-2008 中一级水的要求。 5.1.2 Trizol 核酸提取试剂盒。 5.1.3 反转录试剂盒。 5.1.4 实时荧光 PCR 试剂盒。 5.1.5 DEPC（焦炭酸二乙酯 Diethy Pyrocarbonate）。 5.1.6 三氯甲烷。 1 5.1.7 异丙醇。 5.1.8 无水乙醇。 5.1.9 DEPC 处理的水。 5.1.10 DEPC 处理的 75%乙醇：无水乙醇（含量99.8%）与 DEPC 处理的水按 31 的体积比配置。 5.2 引物5.2.1 引物序列上游引物：5-GCACGTTACGCATTCGACTT-3 下游引物：5-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3 5.2.2 引物配制引物用水稀释成 10 mol/L，-20 保存备用。 6 仪器设备6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 电子天平：感量 0.01 g。 6.4 高速冷冻离心机：离心力 12000 g 以上。 6.5 微量移液器：0.1 L2.5 L，2 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。 6.6 恒温水浴锅。 6.7 冰箱：4 ，-20 ，-80 。 6.8 离心管：DEPC 处理，1.5 mL。 6.9 实时荧光 PCR 反应管：DEPC 处理，200 L。 7 样品7.1 对照样品7.1.1 阳性样品用已知含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阳性样品。 7.1.2 阴性样品用已知不含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阴性样品。 7.2 试样采集新鲜管状叶为宜，也可采集地下鳞茎。装入密封袋，置于冰盒中，4 保存不超过12 h，也可-80 长期保存。 8 操作步骤8.1 RNA 提取2 表2 反应体系-28.2.2 反应程序8.2.2.1 反应体系-1，65 温浴 5 min，冰浴冷却备用。 8.2.2.2 反应体系-2，30 10 min 后 42 1 h。 8.3 实时荧光 PCR 反应8.3.1 实时荧光 PCR 反应体系见表3。 3 8.1.1 离心管、药匙等经液氮预冷。 8.1.2 称取 0.1 g 样品液氮充分研磨（检测鳞茎时，选择中部层取样。），转入 0.1% DEPC （焦碳酸二乙酯）处理的 1.5 mL 离心管中，立即加 1 mL Trizol 试剂，混匀，室温裂解 5 min。 8.1.3 加 200 L 氯仿，充分摇晃混匀 15 s，室温静置 2 min3 min，4 12000 r/min 离心 15 min， 取上层溶液转入新的 DEPC 处理的 1.5 mL 离心管中。 8.1.4 加 0.5 mL 异丙醇，混匀，室温静置 10 min，4 12000 r/min 离心 10 min，弃上清。 8.1.5 加 1 mL DEPC 处理的 75%乙醇，涡旋震荡 1 min，4 12000 r/min 离心 5 min，弃上清。 8.1.6 离心管开盖晾 5 min10 min 至管壁和管盖无液体，加入 40 L DEPC 水，混匀溶解，直接进行下步操作或-80 保存备用。 8.1.7 用核酸蛋白分析仪测定 RNA 浓度。 8.2 反转录8.2.1 利用反转录试剂盒合成 cDNA 第一链，反应体系见表 1、表 2。 表1 反应体系-1试剂体积L随机的 6 核苷酸引物1dNTP 混合溶液(10 mmol/L)1模板 RNA2.5rnase free ddH2O5.5试剂体积L上述变性后反应液105PrimeScript Buffer4rnase inhibitor(40 U/L)0.5primeScript RTase(200 U/L)1rnase free ddH2O4.5表3 反应体系试剂剂量L终浓度2Magic SYBR Mixtrue101上游引物（10 M）0.60.3 M下游引物（10 M）0.60.3 McDNA210 ng200 ngddH2O补齐至 208.3.2 反应程序预变性95 5 min，变性95 30 s，退火延伸60 15 s，40 个循环。 9 试数据处理9.1 结果分析条件设定读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果呈阴性为准。 9.2 检测结果的判定根据 Ct 值判定检测结果，在阳性对照、阴性对照和空白对照检测结果与预期一致的前提下： a) 检测样品的 Ct 值小于 35，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性。 b) 检测样品的 Ct 值介于 3540，且出现特定的扩增曲线，需重新进行实时荧光 PCR 检测。若重新检测的 Ct 值仍介于 3540，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性；否则判为阴性。 c) 检测样品的 Ct 值大于 40，或未出现特定的扩增曲线，判定结果为阴性。 10试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准； c) 所使用的方法； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 4