DB21_T 3848—2023中华小长臂虾种质鉴定规范.docx

ICS 67.120.30DB21/T 38482023CCS B 50DB21辽宁省地方标准DB21/T 38482023中华小长臂虾种质鉴定规范Species identification of Palaemonetes sinensis2023 - 10 - 30 发布2023 - 11 - 30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 38482023前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：沈阳农业大学。本文件主要起草人：李应东、赵莹莹、李晓东、魏华、胡清彪、姜宏波、邢跃楠、包杰、丰程程、 于业辉。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太北原街2号），联系电话：[phone]。文件起草单位通讯地址：沈阳农业大学（沈阳市沈河区东陵路120号），联系电话：[phone]IDB21/T 38482023中华小长臂虾种质鉴定规范1 范围本文件规定了中华小长臂虾（Palaemonetessinensis）的学名与分类、生物学特征、生长与繁殖、 遗传学特性、检测方法与检验判定规则。本文件适用于中华小长臂虾的种质鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.1 养殖鱼类种质检验 第1部分： 检验规则GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分： 抽样方法GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第14部分 DNA含量的测定SC/T 1102-2008 虾类性状测定3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 学名与分类4.1 学名中华小长臂虾（Palaemonetes sinensis）4.2 分类地位属甲壳纲（Crustacea）十足目（Deoapoda）长臂虾科（Palaemonidae） 小长臂虾属（Palaemonetes）5 主要生物学性状5.1 外部形态体透明，呈青色略带微黄色。额剑短于头胸甲，平直前伸，上具 5 齿 6 齿。头胸甲具触角刺、鳃甲刺、无肝刺、鳃甲沟伸至头胸甲中部之前。尾节末端呈尖刺状，两侧各具 1 大 1 小两刺。大颚不具触须。体长 25 mm 50 mm。卵大，卵径为 1.18 mm 1.50 mm 1.00 mm 1.04 mm，卵呈棕绿色。自头胸甲两侧至第6腹节均有棕色或棕黑色的条纹，以第3腹节色最浓。雌雄异体，雌性生殖系统包括卵巢、输卵管；雄性生殖系统包括1对精囊、输精管和精荚囊。中华小长臂虾外形见图1。1GB/T 18654.4 养殖鱼类种质检验 第4部分： 年龄与生长的测定GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分： 繁殖性能的测定GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分 染色体组型分析图 1 中华小长臂虾外形5.2 可数性状额剑齿式：上额角齿数/下额角齿数为 5 6/ 1 2 。5.3 可量性状全长比体长的范围：1.759 2.538。腹部长比体长的范围：0.666 0.772。全额剑长比头胸甲长的范围：0.612 0.972。6 繁殖6.1 性成熟中华小长臂虾雌雄异体，可当年性成熟。6.2 怀卵量怀卵量与个体大小相关，一般怀卵量在 40 粒 230 粒不等，雌虾抱于腹肢上，体外授精。6.3 产卵类型产卵期为 4 月中旬至 7 月中旬，沉性兼粘性卵。7 遗传学特性7.1 细胞遗传学特性检测7.1.1 染色体数2（1.全形，侧面；2.尾节末端，背面；3.第一触角；4.第二触角鳞片；5.大颚）体细胞染色体二倍数，2 n = 88。7.1.2 核 型染色体核型公式为 2 n = 88 = 66 m + 10 sm + 4 st + 8 t。中部着丝粒染色体( m 组) 33 对；亚中部着丝粒染色体( sm 组) 5 对；亚端部着丝粒染色体( st 组) 2 对；端部着丝粒染色体（t 组） 4 对；染色体臂数( NF ) 164，见图 2。图 2 中华小长臂虾染色体分裂相及核型7.2 分子遗传学特性7.2.1 中华小长臂虾线粒体16s rRNA基因标记对线粒体16srRNA基因片段进行扩增和测序，PCR 引物序列为 L16S：CGCCTGTTTATCAAAAACAT，H16S： CCGGTCTGAACTCAGATCACGT，获得长度为 523bp，群体内个体间遗传距离小于 2%，序列如下：5-tatgagctattaatataaagtctagcctgcccactgagtaattaaagggctgcagtaatttgactgtgcaaaggtagca taatcagtagtcttttaattgaaggcttgaatgaatggctggatgagggagaaactgtctttttggtaaattaaaatttgacttttaa gtgaaaaggcttaaatttattaaggggacgataagaccctataaaacttaatatttatttatattttgtttttaaattttaaataaact ttacaaagtttagtatatattttgttggggagacattgacataattaataactgtctaatttaaatgtttatagctattgttattatatg atccttctttgaaggataaaaagagcaagttactttagggataacagcgtaattttttctgagagttcttatcgaagaaaatagttg cgacctcgatgttgaattaaaatttctgttaggtgtagccgtttaacaagtaggtctgttcgaccttttaaattttacatgatttgagt tcaaaccggt-37.2.2 中华小长臂虾线粒体COI基因标记对线粒体COI基因片段进行扩增和测序，PCR 引物序列为 LCO：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO： TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA，获得长度为 674bp，群体内个体间遗传距离小于 2%，序列如下：5-atattggcccactatactttgtatttggagcttgagcaggaatagtaggaacttctttaagactactaattcgagctgaac ttggacaaccaggcaccttaatcggaaatgatcaaatttacaatgtggttgtaacggcacacgctttcgttataatcttctttgtag taataccaattataattggtggatttggaaattgacttgtacccctaatgctaggagctcctgatatagcattcccacgtataaata acataagattttgactcctccccccttctttaacactcattctttctagaggtatagtagaaagaggagtcggaactggttgaacg gtttaccctcccctagcgagagggttaggccacgctggagcttcggtagacctgggtattttctctttacatttagcaggagtgtct tctattttgggtgctgtaaatttcattacaactgtaattaatatacgagctccgggaataactatggaccgaactccactttttgtat gagcagtttttttaactgctattttattactactttctctacctattttagcaggggctattactatgcttttaacagaccgaaatctaa atacttctttctttgaccctgctggagggggggatcctattctttatcaacatttattttgatttttt-38 检测方法38.1 抽样方法按 GB/T 18654.2 执行。8.2 性状检测按 SC/T 1102-2008 执行。8.3 年龄与生长测定按 GB/T 18654.4 执行。8.4 繁殖性能测定按 GB/T 18654.6 执行。8.5 染色体检测按 GB/T 18654.12 的规定执行。8.6 DNA 含量测定按 GB/T 18654.14 执行。8.7 分子遗传学标记方法8.7.1 DNA 的提取取尾部肌肉，剪碎组织，加 200 L裂解液（EDTA(pH 8.0)：200 mmol/L；SDS：1 ；Proteinase K： 200 g/mL）50 温育 3 h 4 h；加入等体积饱和苯酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25 ：24 ：1）400 L抽提， 8000 r/min，离心 20 min后，取上清液，再重复抽提 2 次；在上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇沉淀，20 静置； 12500 r/min，离心 20 min，用 70 乙醇洗沉淀 2 次，晾干，加入 50 L的1 TE （pH 8.0）溶解。使用 DNA 定量仪测定样品 DNA 的纯度和浓度。-20 保存备用。8.7.2 PCR 扩增反应8.7.2.1 扩增反应总体积为 15 L，其中包括摸板 DNA 50 ng、10buffer 1.5 L，Mg2+ (25mmolL-1) 1.5L、dNTPS（10mmolL-1) 各 0.25L、Taq 酶 1U、上下游引物(10molL-1) 各 0.15L（16SrRNA， COI和微卫星 DNA 法分别使用各自的引物）。8.7.2.2 线粒体 16S rRNA基因法反应程序为 95预变性 5 min；94变性 30 s、52退火 30 s、72 延伸 30 s，35 个循环，72延伸 10 min。8.7.2.3 线粒体COI基因法反应程序为 95预变性 5 min；94变性 30s、55退火 30 s、72延伸30s，35 个循环；72延伸 5 min。8.7.2.4 扩增反应结束后，取 5 L 产物与 1 L 上样缓冲液混合点样， 1%琼脂糖凝胶中电泳 20 min， 电压 120 v，紫外灯下观察结果并拍照记录。PCR 产物纯化后双向测序。8.7.3 结果分析8.7.3.1 线粒体 16SrRNA基因法：测序后进行序列比对，群体内个体间遗传距离小于 2 %。8.7.3.2 线粒体 COI基因法：测序后进行序列比对，群体内个体间遗传距离小于 2 %。9 检验与判定规则4检验规则按 GB/T 18654.1 执行， 检测结果符合本文件 4、5、6、7及8.7.3条规定，判定为中华小长臂虾。5附 录 A（资料性）中华小长臂虾可量性状比例表A.1所示了不同组别中华小长臂虾可量性状比例。表A.1 不同组别中华小长臂虾可量性状比例项目I 组II 组III 组IV 组全长体长2.0310.2722.1430.1822.3660.1722.1090.200头胸甲长体长0.2790.0170.2780.0160.2830.0170.2910.033头胸甲宽体长0.1720.0150.1650.0110.1510.0130.1660.015头胸甲高体长0.1990.0150.1940.0120.1790.0140.2020.017腹部长体长0.7150.0490.7080.0280.7160.0560.6920.037腹部宽体长0.1460.0110.1400.0180.1340.0110.1410.015腹部高体长0.1670.0170.1610.0130.1640.0140.1620.017尾扇长体长0.2040.0160.2050.0150.2030.0220.1890.021尾节高体长0.0740.0070.0750.0070.0710.0070.0770.011额剑长头胸甲长0.7530.0720.7280.0740.8960.0760.7080.096头胸甲宽头胸甲长0.6180.0500.5940.0440.5330.0450.5750.069头胸甲高头胸甲长0.7140.0500.7010.0440.6340.0520.6980.073腹节宽头胸甲宽0.8550.0790.8550.1120.8940.0900.8560.105眼窝距头胸甲宽0.3270.0620.3450.0370.0320.0040.0540.012腹节高头胸甲高0.8440.0820.8310.0720.9180.0950.8100.099尾节高头胸甲高0.3750.0390.3880.0390.3990.0500.3850.057腹部宽腹部长0.2050.0130.1990.0250.1880.0190.2040.022腹部高腹部长0.2340.0200.2280.0170.2300.0250.2350.0246