LncRNA PVT1对EIF4A1的表达调控作用及机制研究.pdf

第 2 期农垦医学第 45 卷LncRNA PVT1 对 EIF4A1 的表达调控作用及机制研究金迅郭婷婷孙建伟卢雨林王丹君肖冰琪杜诗尧李冬妹（石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室医学院生化教研室，新疆石河子，832002）【摘要】目的：探讨长链非编码 RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）人浆细胞瘤转化迁移基因 1（PlasmacytomaVariant Translocation 1,PVT1)对真核翻译起始因子 4A1（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4A1,EIF4A1）可能的表达调控作用及机制。方法：通过对 MGC-803 细胞 PVT1 基因的表达进行干扰，对其干扰效果进行了鉴定，然后利用 realtime-PCR 和 Western Blot技术对 EIF4A1 基因 mRNA、蛋白水平进行了测定；利用 LncBase Predicted v.2 预测 PVT1 作为分子海绵在分子上吸附的 miRNA；然后用 TargetScan 和 miRTarBase对调控 EIF4A1 表达的 miRNA 进行预测，结合两者结果得出中介 miRNA；进一步通过 LncBase Predicted v.2 寻找 PVT1 与候选 miRNA 结合位点，并通过 GEO 数据库说明候选 miRNA在胃癌中的表达情况；最后从干扰 PVT1表达的细胞中通过 real time-PCR技术测定候选 miRNA的水平。结果：在胃癌细胞 MGC-803 中成功抑制了 PVT1 表达。在 PVT1 表达下调的胃癌细胞中 EIF4A1 的 mRNA和蛋白质的表达水平均下调（0.05）；通过 LncBase Predicted v.2 预测出 277 个 PVT1 可能结合吸附的 miRNA；TargetScan 和miRTarBase数据库预测出 12 个可能调控 EIF4A1 的 miRNA；两者结果取交集，发现 miR-493-3p可能为 PVT1 吸附降低的 miRNA，且 miR-493-3p 可能下调 EIF4A1 的水平；通过 LncBase Predicted v.2 预测出 PVT1 与 miR-493-3p 的结合位点位于染色体的 8:128048475-128048492；通过 GEO 数据库发现 miR-493-3p 在胃癌组织中处于表达下调状态。Real-time PCR结果显示 PVT1 水平降低后 miR-493-3p 水平有所增加（0.05）。结论：LncRNA PVT1 可通过吸附降低miR-493-3p 水平而正向调控 EIF4A1 的表达，miR-493-3p 是 PVT1 调节 EIF4A1表达的关键中间分子，为 PVT1 在胃癌中的作用机制提供线索。【关键词】胃癌；PVT1；EIF4A1；miR-493-3p中图分类号：R735.2文献标识码：ARegulation and Mechanism of LncRNA PVT1 on EIF4A1 ExpressionJIN Xun，GUO Ting-ting，SUN Jian-wei，LU Yu-lin，WANG Dan-jun，XIAO Bing-qi，DU Shi-yao，LI Dong-mei（Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi,832002）【Abstract】Objective:To explore the role and mechanism of Long non-coding RNA(LncRNA)plasmacytomavariant translocation 1(PVT1)to regulate the expression of eukaryotic translation initiation factor 4A1(EIF4A1).Methods:By interfering with the expression of PVT1 gene in MGC-803 cells,the interference effect was identified,and then the mRNA and protein levels of EIF4A1 gene were determined by realtime-PCR and Western Blottechniques.LncBase Predicted v.2 was used to predict miRNAs adsorbed with lncRNA PVT1 as molecular sponge.Subsequently,TargetScan and miRTarBase databases were used to predict the miRNAs that might regulate EIF4A1,and the mediating miRNAs were obtained by combining the two prediction results.Furthermore,LncBase Predictedv.2 was used to find the specific binding sites of PVT1 and candidate miRNAs,and the expression of candidatemiRNAs in gastric cancer was explained through GEO database.Finally,the levels of candidate miRNAs were基金项目：国家自然科学基金项目(82160573)；新疆生产建设兵团指导性科技计划项目(2022ZD084)；国家级大学生创新创业训练计划项目(202210759023)。通讯作者：李冬妹，女，教授，硕士研究生导师，从事胃癌早诊标志物及治疗靶点研究。106 2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.2胃癌（Gastric Cancer，GC）是指原发于胃上皮源性恶性肿瘤，据统计分析，我国乃至全球胃癌的病死率均位于前五1，胃癌患者预后与肿瘤分期有显著相关性，尽早诊疗可极大改善患者预后2。多种恶性肿瘤如直肠癌3、乳腺癌4、宫颈癌5标志物已有较成熟的临床报道，而特征性胃癌标识却鲜有发现。因此，确定 GC 的诊断和预测标记物将有助于患者及时尽早治疗，以最大限度地提高生存率，对胃癌关键分子靶点的探索具有重大价值。长链非编码 RNA(LncRNA)在表观遗传和基因调控过程中发挥着复杂而精确的作用6。而在对癌症的相关研究中，lncRNA 则参与到了癌症细胞产生发展的全过程中7,8。LncRNA 因在组织中具有特异性表达易于检测的特点，因此多种长链非编码 RNA被作为生物靶分子的研究热点9。随着研究成果的出现，lncRNA 可以成为 miR-NA“分子海绵”，通过与 miRNA 互作，降低其对下游分子的抑制作用，从而实现控制作用。如 lncR-NA-m433s1 和 lncRNA-GAS5 可分别作为 miR-433和 miR-21 分子海绵而实现对下游分子的调控10,11。PVT1（Plasmacytoma Variant Translocation 1，PVT1)是长链非编码 RNA（Long non-coding RNA,LncRNA），位于染色体 8q24.21 位置，长度为 1716nt12，是与小鼠浆细胞瘤变异易位基因(Pvt1)同源的lncRNA13。课题组前期在胃癌细胞和组织的研究中发现 PVT1 的上调与胃癌细胞的迁移侵袭有密切关系14,15，进一步研究发现 PVT1 的作用机制可能涉及对真核翻译起始因子 4A1(Eukaryotic TranslationInitiation Factor 4A1,EIF4A1)的影响。肿瘤细胞内的分子调控网络复杂，探索其下游分子具有重大价值。真核翻译起始因子 EIF4A1 是翻译起始复合物的一员，相关研究发现其水平也与胃癌细胞的迁移和侵袭有关16。已有文献报道 EIF4A1 在结直肠癌等肿瘤中表达升高17，提示 EIF4A1 在肿瘤发生发展的机制中也可能发挥了重要作用。因此，本研究主要探讨 lncRNA PVT1 是否能调控 EIF4A1 的表达，并在分子海绵作用中分析可能的调控机制，以期为胃癌的靶向分子治疗提供理论依据。1资料与方法1.1 主要试剂DMEM 细胞培养基、10%胎牛血清、胰酶、青-链霉素均购自 Gibco 公司，SYBR Green real timePCR 试 剂 盒 购 自 Qiagen 公 司，EIF4A1、PVT1、miR-493-3p 引物和 PVT1 干扰质粒均购自上海生工生物公司，具体引物序列见表 1，Lip2000 脂质体购自 Invitrogen 公司。Trizol 购自 Ambion 生物公司，逆转录试剂盒购自 Takara 公司，EIF4A1 抗体购自Santa 公司，山羊抗（兔、鼠）IgG 购自北京中杉金桥公司。表 1EIF4A1、PVT1、miR-493-3p 引物序列1.2 培养细胞常规培养人 GC 细胞系 MGC803 于含 4.5g/L 葡萄糖的 DMEM 中，并添加 10%胎牛血清(FBS)。细胞保存在 37毅C 且 5%CO2的潮湿环境中。1.3 质粒转染与 RNA 干扰胃癌细胞 MGC803 密度均匀且达到 50%70%。lncRNA PVT1 shRNA 干扰质粒由 Sangon,detected by real time-PCR in cells that interfered with PVT1 expression.Results:The expression of PVT1 wassuccessfully interfered in gastric cancer cell MGC-803.The expression levels of EIF4A1 mRNA and protein ingastric cancer cells with PVT1 knockdown were decreased(0.05).A total of 277 miRNAs that might bind toPVT1 adsorption were predicted by LncBase Predicted v.2.TargetScan and miRTarBase database predicted 12miRNAs that might regulate EIF4A1.The intersection of these two results showed that miR-493-3p may be amiRNAwithreducedPVT1adsorption,andmiR-493-3pmaydown-regulatethelevel ofEIF4A1.LncBasePredicted v.2 predicted that the binding site of PVT1 and miR-493-3p was located at 8:128048475-128048492 onchromosome.The GEO database showed that miR-493-3p was down-regulated in gastric cancer tissues.The resultsof real-time PCR showed that the level of miR-493-3p was increased after the reduction of PVT1 level(0.05).Conclusions:LncRNAPVT1canpositivelyregulatetheexpressionofEIF4A1byreducingthelevelofmiR-493-3p.miR-493-3p is a key intermediate molecule of PVT1 in regulating EIF4A1 expression and may bean important target for the treatment of gastric cancer.【Key words】Gastric cancer;PVT1;EIF4A1;miR-493-3p名称序列EIF4A1F:5-ATCCCAGAGGCTCTCCTCAC-3R:5-CTACCATTTTCTCTCCCCTGCTT-3PVT1F:5-GGACTTGAGAACTGTCCTTAC-3miR-493-3pF:GCTGCGTGAAGGTCTACTGTG TR:AGTGCAGGGTCCGAGGTATT 107 第 2 期农垦医学第 45 卷Ltd(Shanghai,China)利用 pGPU6/GFP/Neo 质粒合成，空质粒命名为 sh-NC 作为对照，干扰序列为5-GGACTTGAGAACTGTCCTTAC-3。使 用 Lipo-fectamine 2000 转染试剂，按照制造商说明用 2gsh-PVT1 或 sh-NC 转染人 GC MGC823 细胞。48h后，裂解转染 shRNA 的细胞，提取 RNA 进行 re-al-time PCR 检测转染效率。1.4 RNA 提取和 cDNA 合成按照制造商说明使用 Trizol 试剂从 GC 细胞和血清中分离总 RNA，将 750滋LTrizol 试剂直接加入250L 的血清中，用 1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 是否完整，用分光光度计在 280nm 和 260nm处测定吸光度，测定 RNA 纯度和浓度。所有样本总RNA 均按照制造商的协议使用还原辅助第一链cDNA 合成试剂盒进行逆转录，每个样本 RNA 含量为 1.0g。1.5 实时荧光定量 PCR 反应（real-time PCR）PVT1 的表达水平使用 SYBR Green PCR 试剂盒按照制造商的协议进行定量，基因表达水平归一化到相应的-actin 表达水平。扩增方案包括 95毅C5 分钟的初始热激活步骤，随后 95毅C 变性 30 秒 40个循环，以及 55毅C 30 秒的联合退火/延伸步骤。用2(-CT)值计算该基因的表达量，并用熔融曲线分析确定各反应的特异性。1.6 Western blotting从胃癌细胞中收集总蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 5%脱脂奶粉在室温下封闭 2h，4与抗体孵育过夜。抗 EIF4A1 抗体(11000)和-actin抗体(11000)，后用 TBST 和二抗(山羊抗小鼠 IgG，15 000)加入室温孵育 2h 后，用 TBST 洗涤 3 次。1.7 LncRNA PVT1 作为分子海绵结合 miRNA 的预测利 用 Ensembl（https:/asia.ensembl.org/index.html）数据库对 lncRNA PVT1 进行 Ensembl GeneID 转换，通过 LncBase Predicted v.2（http:/microrna.gr/LncBasev2）预测 lncRNA PVT1 可能结合吸附的miRNA。1.8 调控 EIF4A1 表达的 miRNA 预测分 别 通 过 TargetScan（https:/www.targetscan.org/vert_72/）和 miRTarBase（https:/ EIFI4A1 的 miRNA，并对预测结果取交集。1.9 选取胃癌非编码 RNA 阵列样本芯片在 GEO（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中输入搜索词“gastric carcinoma”进行搜索，最终选取 GPL21263 平台 GSE124158 样本芯片并进行下载，GSE124158 样本芯片中共有 1 370 个样本，关于胃癌组织的样本为 30 个，正常对照样本为275个。1.10 筛选胃癌 GSE124158 数据集中差异表达 miR-NA将下载的数据进行分组命名，分别为胃癌细胞组和正常对照组。使用 GEO2R(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线分析对下载的数据进行标准化处理，将标准化处理后的数据进行下一步筛选差异表达 miRNA，设置条件：|log2 Fold Change|1，经过标准化之后的数据，设定条件0.05，进而作为筛选条件。2结果2.1 在胃癌细胞 MGC803 中成功干扰 PVT1 的表达将 si-NC 组和 si-PVT1 分别转染到 MGC803 细胞，经 48 小 时 后 获 得 总 RNA，并 通 过 realtime-PCR 测定细胞中 PVT1 水平，结果表明与si-NC 组比较 si-PVT1 组的 PVT1 表达水平降低，差异有统计学意义（0.05），见图 1。说明在胃癌细胞中成功干扰 PVT1 的表达。图 1胃癌细胞中干扰 PVT1 的效率鉴定2.2 干扰 PVT1 后 EIF4A1 的表达下调干扰 PVT1 48h 后，提取 RNA 的同时提取蛋白质，采用 real time-PCR 与 Western Blot 分别检测细胞中 EIF4A1 的 mRNA 和蛋白质表达水平，发现si-PVT1 组 EIF4A1 在 mRNA 和蛋白质表达水平均低于 si-NC 组，差异有统计学意义（0.05），见图 2。si-NCsi-PVT10.00.51.01.5MGC-803relative mRNA level of PVT1?*108 2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.22.3 可能与 lncRNA PVT1 结合吸附的 miRNA通过 LncBase Predicted v.2 在线预测网站预测可能与 lncRNA PVT1 相吸附的 miRNA，预测出 277个结果，见图 3。图 3lncRNA PVT1 可能结合吸附 miRNA 的部分结果2.4 调控 EIF4A1 表达的 miRNA通过 TargetScan 和 miRTarBase 数据库预测调控 EIF4A1 的 miRNA，取交集，发现 12 个 miRNA 可能通过 3-UTR 区调控 EIF4A1 的表达，见表 2。2.5 PVT1 吸附 miR-493-3p 的位点预测将 LncBase Predicted v.2 在线预测网站的预测结果与调控 EIF4A1 表达的 miRNA 结果取交集，得到hsa-miR-493-3p和hsa-miR-3674，由 于hsa-miR-3674 相关系数较低，给予排除。见图 4。通过 LncBase Predicted v.2 在线预测网站，预测 lncR-NA PVT1 与 miR-493-3p 的结合位点，结果示二者于染色体的 8:128048475-128048492 位点结合，见图 5。图 2干扰 PVT1 后 EIF4A1 的表达水平检测注：图 A 为 EIF4A1 的 mRNA real time-PCR 检测；图 B、C 为 EIF4A1 的 Western Blot 及蛋白量化结果。*：0.05，*：0.01，*：0.001，*：0.0001。si-NCsi-PVT10.00.51.01.5MGC-803relative mRNA level of EIF4A1?si-NCsi-PVT10.00.51.01.5MGC-803EIF4A1/-actin?-actinEIF4A143KD46KDsi-Nsi-PABC表 2调控 EIF4A1 表达的 miRNA 列表序号miRNATargetMirtarbase IDPosition in the UTRseed matchcontext+SCORE percentile1hsa-miR-493-3pEIF4A1MIRT34592758-647mer-m8982hsa-miR-3154EIF4A1MIRT34592960-667mer-1A893hsa-miR-3674EIF4A1MIRT34593163-697mer-m8774hsa-miR-3613-5pEIF4A1MIRT57480765-717mer-1A715hsa-miR-6851-5pEIF4A1MIRT34593870-778mer99372-3787mer-1A956hsa-miR-3689dEIF4A1MIRT345933372-3787mer-1A8970-778mer997hsa-miR-4802-5PEIF4A1MIRT34593572-787mer-m898372-3787mer-1A958hsa-miR-670-3pEIF4A1MIRT57480679-868mer979hsa-miR-1238-3PEIF4A1MIRT57480579-868mer9710hsa-miR-769-3pEIF4A1MIRT039072379-3857mer-m89711hsa-miR-1284EIF4A1MIRT198187571-5777mer-m89612hsa-miR-378a-5pEIF4A1MIRT044001589-5957mer-1A93*109 第 2 期农垦医学第 45 卷图 4LncBase Predicted v.2 预测结果与调控 EIF4A1 的12 个 miRNA 取交集的 VENN 图注：A 为 LncBase Predicted v.2 预测可能与 lncRNA PVT1 相吸附的 miRNA 的 结 果；B 为 lncRNA PVT1 吸 附 的 miRNA 和 调 控EIF4A1 的 miRNA 的数量统计。图 5miR-493-3p 与 PVTI 结合位点2.6 差异表达 miRNA 筛选结果生物信息学分析显示：从 GSE124158 数据集中，得到 359 个差异表达 miRNA,其中 121 个在胃癌组织中上调，238 个在胃癌组织中下调，其中miR-493-3p 处于下调状态。见图 6，图 7。AB图 6GSE124158 数据标准化结果的前后对比注：图 A 为 GSE124158 数据未标准化结果图；图 B 为 GSE124158数据标准化结果图。图 7火山图标注差异表达 miRNA注：Padj1,基因将展示为红色圆点，即 up;Padj0.05,logFC0.05 基因将展示为黑色圆点,即 not。2.7 干扰 PVT1 后 miR-493-3p 的表达检测采 用 realtime-PCR，检 测 干 扰 PVT1 后MGC803 细胞中 miR-493-3p 的表达水平，发现PVT1 水平降低后 miR-493-3p 水平有所增加（0.001），见图 8。图 8干扰 PVT1 后胃癌细胞中 miR-493-3p 的水平检测3讨论胃癌是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤，是由多种因子在复杂环境下经过多重效应后所导致。多项研究发现，lncRNA 的异常表达与肿瘤不良预后有关。课题组前期关于胃癌细胞和组织的研究结果均提示 lncRNA PVT1 上调与胃癌细胞迁移侵袭有密切关系，其机制涉及 EIF4A1。EIF4A1 表达也与胃癌的发生密切相关，且EIF4A1 沉默对胃癌细胞的增殖迁移产生了抑制作用，可抑制癌细胞的扩散。因此寻找调控 EIF4A1 表达的方法对胃癌治疗至关重要。miRNA 能够通过使mRNA 失活来关闭基因，细胞可通过 miRNA 关闭基因，称为“基因沉默”。更多实验结果表明，lncRNA 可与 miRNA 结合，具有分子海绵的效果，可控制 miR-275210 110 2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.2NA 与目标基因的结合，从而实现调控目的7。因此，若能通过对 PVT1 的分子海绵效应竞争性控制相应miRNA 与 EIF4A1 结 合，即 可 控 制 miRNA 对EIF4A1 的“沉默效应”，从而达到调控 EIF4A1 水平的目的。本研究通过 LncBase Predicted v.2 预测出 277个可能与 PVT1 结合吸附的 miRNA，在 TargetScan和 miRTarBase 数 据 库 预 测 出 12 个 可 能 调 控EIF4A1 的 miRNA，两 者 结 果 取 交 集，发 现miR-493-3p 可能为 PVT1 吸附降低的 miRNA，且miR-493-3p 可能下调 EIF4A1 的水平，因此猜想PVT1 可 通 过 竞 争 性 吸 附 miR-493-3p 抑 制miR-493-3p 对 EIF4A1 的 沉 默 效 应，从 而 使EIF4A1 的表达升高。并通过 LncBase Predicted v.2成功预测 PVT1 与 miR-493-3p 的结合位点。证实PVT1 通 过 吸 附 降 低 miR-493-3p 水 平 可 抑 制EIF4A1 的沉默，此可能为调控 EIF4A1 表达的重要机制。综上所述，LncRNA PVT1 可通过吸附降低miR-493-3p 水平来正向调控 EIF4A1 的表达，而miR-493-3p 是 PVT1 调节 EIF4A1 表达的关键中间分子，为 PVT1 在胃癌中的作用机制提供了线索。参考文献：1Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for36 cancers in 185 countriesJ.Ca:A Cancer Journal for Clinic-ians,2021,71(3):209-2492Ma S,Kong S,Gu X,et al.As a biomarker for gastric cancer,circPTPN22 regulates the progression of gastric cancer throughthe EMT pathwayJ.Cancer Cell International,2021,21(1):1-143张伟,赵磊.直肠癌血清肿瘤标志物联合检测的诊断价值J.农垦医学,2017,03:248-2494张伟,张蕾,李志刚.4 种血清肿瘤标志物联合检测乳腺癌的临床意义J.农垦医学,2015,04:336-3375文乙竹.三种肿瘤标志物联合检测对卵巢癌的临床诊断价值J.农垦医学,2013,04:315-3166Bartonicek N,Maag JLV,Dinger ME.Long noncoding RNAs incancer:mechanisms of action and technological advancementsJ.Molecular Cancer,2016,15(1):1-107Liu HT,Fang L,Cheng YX,et al.LncRNA PVT1 regulates prost-atecancercellgrowthbyinducingthemethylationofmiR-146aJ.Cancer Medicine,2016,5(12):3512-35198Tian Z,Cao S,Li C,et al.LncRNA PVT1 regulates growth,migra-tion,and invasion of bladder cancer by miR-31/CDK1J.Journalof Cellular Physiology,2019,234(4):4799-48119Qi P,Zhou XY,Du X.Circulating long non-coding RNAs incancer:Current status and future perspectivesJ.Molecular Canc-er,2016,15(1):1-1110郑伟.LncRNA-miRNA-mRNA 相互作用初步研究D.北京:中国人民解放军军事医学科学院,201711张卫迪.LncRNA-m18as1/miR-18a-5p 通过 Smad 通路调控大鼠腺垂体 FSH 合成与分泌机制的研究D.长春:吉林大学,202212Wang C,Zhu X,Pu C,et al.Upregulated plasmacytoma variant t-ranslocation 1 promotes cell proliferation,invasion and metasta-sis in colorectal cancerJ.Molecular Medicine Reports,2018,17(5):6598-660413Huang C,Liu S,Wang H,et al.LncRNA PVT1 overexpression isa poor prognostic biomarker and regulates migration and invas-ion in small cell lung cancerJ.American Journal of Translatio-nal Research,2016,8(11):5025-503414Ren X,Li Y,Yang L,et al.Expression levels and the prognosticvalue of long non-coding RNA PVT1 in serum of Han andUygur gastric cancer patients in Xinjiang,ChinaJ.TranslationalCancer Research,2019,8(1):51-5815Ren X,Cao D,Yang L,et al.High Expression of long non-codingRNA PVT1 predicts metastasis in Han and Uygur Patientswith Gastric Cancer in Xinjiang,ChinaJ.Scientific Reports,2019,9(1):1-1116王晓露,张伟,张蕾,等.EIF4A1 在胃癌组织中的表达及其沉默对胃癌细胞的增殖迁移的影响研究J.石河子大学学报(自然科学版),2022,40(03):370-37517Ogunwobi OO,Mahmood F,Akingboye A.Biomarkers in colorectalcancer:Current research and future prospectsJ.International Jo-urnal of Molecular Sciences,2020,21(15):1-20收稿日期：2023-02-10 111