LncRNA SNHG9在正常机采血小板储存中表达变化及意义.pdf

J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3310N-doped graphene quantum dot with high photothermal conversion efficiency for dual-mode imaging and therapy in vitroJ.Nanotechnology,2018,29(35):355101.19 CHONG Y,GE C C,FANG G,et al.Crossover between anti-and pro-oxidant activities of graphene quantum dots in the absence or presence of lightJ.ACS Nano,2016,10(9):8690-8699.20 WANG Y M,KONG W H,WANG L F,et al.Optimizing oxygen functional groups in graphene quantum dots for improved antioxidant mechanismJ.Phys Chem Chem Phys,2019,21(3):1336-1343.2 1 SCHIEBER M,CHANDEL N S.ROS function in redox signaling and oxidative stressJ.Curr Biol,2014,24(10):R453-R462.22 NIMMERJAHN F,MILOSEVIC S,BEHRENDS U,et al.Major histocompatibility complex class II-restricted presentation of a cytosolic antigen by autophagyJ.Eur J Immunol,2003,33(5):1250-1259.23 JACQUEL A,OBBA S,BOYER L,et al.Autophagy is required for CSF-1induced macrophagic differentiation and acquisition of phagocytic functionsJ.Blood,2012,119(19):4527-4531.2 4 L U N,W A N G L Q,L V M,e t a l.G r a p h e n e-based nanomaterials in biosystemsJ.Nano Res,2019,12(2):247-264.2 5 YANG K,WAN J M,ZHANG S,et al.In vivo pharmacokinetics,long-term biodistribution,and toxicology of PEGylated graphene in miceJ.ACS Nano,2011,5(1):516-522.26 MARTN C,JUN G,SCHURHAMMER R,et al.Enzymatic degradation of graphene quantum dots by human peroxidasesJ.Small,2019,15(52):1905405.27 DOBROVOLSKAIA M A,MCNEIL S E.Immunological properties of engineered nanomaterialsJ.Nat Nanotechnol,2007,2(8):469-478.（收稿日期：2023-05-09）（本文编辑：王慧茹）DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.004*本课题受陕西省重点研发计划项目（No.2021SF-151）（No.2022SF-548）、西安市科技计划项目（No.22YXYJ0050）（No.21YXYJ0028）资助作者单位：710061 西安，陕西省血液中心（张文娟，段勇，冯娜，兰静，景媛媛）；西安市第一医院中心实验室（纪玉强）作者简介：张文娟，主管技师，博士，主要从事长链非编码RNA与血小板储存损伤的相关性研究，（E-mail）。通信作者：景媛媛，副主任技师，博士，主要从事免疫血液学和经血传播疾病的发病机制方面的研究，（E-mail）。论著LncRNA SNHG9在正常机采血小板储存中表达变化及意义张文娟 段勇 纪玉强 冯娜 兰静 景媛媛 【摘要】目的 探讨正常机采血小板储存过程中伴随储存时间延长长链非编码RNA（lncRNA）小核仁RNA宿主基因9（SNHG9）的表达变化及意义。方法 收集符合临床血小板输注治疗标准的正常机采血小板32份，保存于专用（222）恒温振荡保存箱内，在不同储存时间（1、3、5、7、9 d）通过外观、血小板计数、红细胞残留量计数、白细胞残余量计数、pH值及细菌培养检测血小板质量；用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SNHG9在同一机采血小板样本不同储存时间的表达量，分析其对血小板储存损伤（PSL）的影响及意义。结果 在第1、3、5、7、9天SNHG9表达量伴随储存时间延长逐渐增高，数据总体存在统计学差异（H=93.073，P0.001），差异有统计学意义（P0.05）。进一步对不同天数之间SNHG9表达量进行两两多重比较，第1天与第3天校正后的P值是0.144，差异无统计学意义（P0.05）；第1天和第5天，第1天和第7天，第1天和第9天校正后的P值均小于0.001，差异有统计学意义（P0.05）；第3天和第5天（P=0.031），第3天和第7天，第3天和第9天（P0.001）校正后差异有统计学意义。结论 用于临床治疗的正常机采血小板伴随储存时间延长，第5、7、9天样本中SNHG9表达量比第1天明显增高，SNHG9对血小板储存条件敏感，有可能成为PSL潜在的生物学标记物。【关键词】机采血小板 长链非编码RNA 小核仁RNA宿主基因9 血小板储存损伤 【中图分类号】R331.1+43 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0310-06临床输血与检验2023年6月第25卷第3期311输血医学已从过去单一的输全血发展到现阶段的成分输血，机采血小板是目前临床输血治疗中广泛使用的血液制品，该制剂浓度高、纯度大、不良反应少，受到临床医生的一致认可。目前捐献的血小板用专用保存袋保存于（222）恒温振荡保存箱内，在符合临床安全用血标准要求下，血小板可保存5 d1-2。临床治疗中机采血小板成分血供应极其紧张。血小板离开机体在体外储存过程中会发生一系列生理生化、形态结构和功能变化，被称之为血小板储存损伤（platelet storage lesion，PSL）2。PSL严重影响到血小板有效保质期以及临床输注效果，甚至会造成患者血小板无效输注2。越来越多的研究开始关注PSL和如何提高血小板在储存期间的质量等问题。细 胞 中 的 总R N A包 括 编 码 蛋 白 质 的 信 使RNA（messenger RNA，mRNA）和非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。血小板无细胞核，但是却含有大量的ncRNA，主要包括小分子RNA（microRNAs，miRNAs）、长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）和环形RNA(circular RNAs，circRNAs)，多项研究表明体外储存血小板中变化的miRNAs可通过调控相应的蛋白质表达来影响血小板的质量3-7。miRNAs的差异表达可作为评估血小板是否储存良好的指标8。但是，lncRNAs是否也可像miRNAs那样在血小板质量和PSL中占有举足轻重的地位还有待多方面考证。为了深入分析研究血小板储存过程中lncRNAs的表达与PSL之间的关系，通过前期预实验，设计合成了多个LncRNA SNHG9 in Apheresis Platelets Following Storage ZHANG Wenjuan,DUAN Yong,JI Yuqiang,et al.Shaanxi blood center,Xian 710061【Abstract】Objective To investigate the expression changes of long noncoding RNA(lncRNA)small nucleolar RNA host gene 9(SNHG9)with extended storage during apheresis platelet storage.Methods A total of 32 samples of apheresis platelets that met the indications for platelet transfusion were collected and stored at（222）with gentle agitation.Platelets were measured by appearance,platelet count,red blood cell residual count,white blood cell residual count,pH value and bacterial culture in different storage times(1,3,5,7,and 9 days).The expression levels of lncRNA SNHG9 in different storage times were detected by quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and the expressions of SNHG9 on platelet storage lesion(PSL)were analyzed.Results The expressions of SNHG9 with extended storage at the 1st,3rd,5th,7th and 9th days were gradually increased.There was a statistical difference(H=93.073,P0.001),with a statistical significance(P0.05).SNHG9 expressions at different days were further compared by pairwise multiple comparisons.The corrected P value at the 1st and 3rd day was 0.144 with no statistical significance(P0.05).The corrected P values at the 1st and 5th,1st and 7th,1st and 9th day were less than 0.001 with statistical significance(P0.05).Statistically significant differences were corrected for on 3rd and 5th day(P=0.031),3rd and 7th day(P0.001),3rd and 9th day(P0.001).Conclusion With extended storage,SNHG9 expressions in apheresis platelets stored at the 5th,7th,and 9th day were significantly higher than that at the 1st day.SNHG9 is sensitive to platelet storage condition,and may be a potential biomarker for PSL.【Key words】Apheresis platelets LncRNA SNHG9 Platelet storage lesionlncRNAs（SENCR，LIPCAR，MALAT1，GAS5，MIAT，LincRNA-p21，MEG3，H19，UCA1及SNHG9）引物，采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）检测正常机采血小板中上述指标的表达水平，发现小核仁RNA宿主基因9（small nucleolar RNA host gene 9，SNHG9）的表达量对血小板储存时间延长比较敏感。目前，尚无SNHG9在血液系统方面甚至血小板领域的相关研究报道。本研究通过qRT-PCR检测正常机采血小板在（222）恒温振荡保存箱内伴随储存时间延长，SNHG9的表达水平变化，为lncRNA SNHG9将来在血小板领域的进一步研究奠定基础。材料与方法1 机采血小板的来源 收集2021年11月2022年7月健康献血者32名，要求其在捐献血小板成分前7 d内不能服用抗生素或改变血小板功能的药物。本研究所用机采血小板均由西安市中心血站采血科提供，科研用成分血均通过了本站伦理委员会批准，献血者符合献血者健康检查要求（GB18467-2011）标准，采集前通过血常规检测血小板计数符合机采血小板相关要求。2 机采血小板的制备 应用Trima accel血细胞分离机分离采集，全自动血球收集系统回路管组收集机采血小板，每单位血小板浓度标准为2.51011个，收集32人份健康机采血小板各100 mL，置（222）血小板恒温振荡保存箱内水平振荡保存。J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.33123 机采血小板的分组 将每份收集的机采血小板轻柔、充分混匀后通过无菌接管机平均分成5份，分别储存在机采血小板专用储存袋中，每份约20 mL，保存于（222）血小板恒温振荡箱内，在不同储存时间（1、3、5、7、9 d）检测血小板质量指标，采用qRT-PCR对血小板中SNHG9的表达水平进行检测。4 主要试剂与仪器 Trima accel全自动血液成分分离机及配套管路Trima Set（泰尔茂比司特有限公司）；血小板恒温震荡保存箱（XHZ-IB DL-P9 0，苏 州 医 用 仪 器 厂）；全 自 动 血 细 胞 计 数 仪（SYSMEXKX-21，日本希森美康公司）；残余白细胞计数仪（ADAM-rWBC，韩国纳诺恩泰）；血全自动细菌培养系统（BACTECFX 2000，美国BD公司）；荧光定量PCR仪（7500，美国ABI公司）；普通PCR仪（C1000，美国Bio-rad公司）；超微量核酸检测仪（美国赛默飞公司）。pH试纸测试条suplco（德国Merck公司）；引物序列：-actin上游引物TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC；SNHG9 上游引物CCATTGCGCTCTCCTCTTCACTTAG，下游引物AAAGACGTGGGACAGCCAAGTTC；PCR引物均由上海生工公司合成；逆转录试剂盒Evo M-MLV反转录试剂预混液（货号AG11706，中国艾科瑞生物公司）；荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green Pro Taq HS qPCR试剂盒）（货号AG11706，中国艾科瑞生物公司）。5 血小板质量参数检测 血小板形态学观察：于玻片上滴一滴机采血小板样本，显微镜观察血小板形态学变化；使用全自动血细胞计数仪检测血小板数量和红细胞残留量，用残余白细胞计数仪对白细胞残余量计数；细菌培养：在需氧微生物培养瓶和厌氧微生物培养瓶中分别接种第1、3、5、7、9天血小板样本8 mL，用BACTEC荧光系列仪器中孵育和检测5天（120 h），观察有无细菌生长。pH值检测：使用试纸suplco按比色板读取pH值。6 机采血小板中SHNG9表达量qRT-PCR检测 血小板分离：将不同储存时间的血小板样本10 mL倒入离心管中，8 000g离心2 min，弃上清；向每5106个细胞中加入1 mL RNAiso Plus，混匀，室温（1530）静置5 min，分离RNA。血小板RNA提取：加入氯仿混合，室温静置5 min，12 000g 4离心15 min，吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.51倍RNAiso Plus体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10 min；12 000g 4离心10 min；加入与RNAiso Plus等量的75乙醇，清洗RNA沉淀，7 500g 4离心5 min小心弃去上清；室温干燥沉淀，加入适量RNase-free水溶解沉淀RNA。逆转录反应：条件如37 15 min，85 5 s，4。Real Time PCR：按两步法PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性，Reps：1，95 30 s；Stage 2：PCR反应，Reps：40，95 5 s，60 3034 s。7 统计学分析 实验数据分析采用SPSS26.0统计软件，不同储存时间SNHG9表达差异分析采用Kruskal Wallis 秩和检验，不同天数之间数据比较均采用两两多重比较的Bonferroni矫正法计算矫正P值（Adj P），Adj P0.05表示差异具有统计学意义。结 果1 机采血小板捐献者基本信息及质量检测结果 32名机采血小板捐献者中男性22名，女性10名，均为汉族，血型分别为11名A型Rh+，2名B型Rh+，2名AB型Rh+，17名O型Rh+。所有样本经检验科乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病毒酶联免疫吸附试验和核酸检测结果均为阴性，生化指标检测结果正常，符合临床病人输血相关指标要求，见表1。第1天，保存袋内的机采血小板外观清亮，呈淡黄色，浓度均匀；随着储存时间延长至第9天，保存袋中血小板颜色仍呈淡黄色，但透过袋壁肉眼可见小颗粒凝集或者小范围云絮状物。显微镜下观察可见随着储存时间延长，血小板数量减少，形态逐渐不规则，出现伪足并呈增多趋势，有的聚集成片。机采血小板计数（2.750.32）1011个/袋，白细胞残余量计数（0.210.24）106个/袋，红细胞残留量计数合格。厌氧菌和需氧菌培养结果均为阴性，无细菌生长。2 qRT-PCR检测机采血小板内SNHG9表达量结果 第1、3、5、7、9天qRT-PCR检测血小板内SNHG9表达量伴随储存天数延长逐渐增高，实验结果总体存在统计学差异（H=93.073，P0.001），差异有统计学意义。进一步用Bonferroni矫正法对不同天数之间SNHG9表达量进行两两多重比较，第1天与第3天校正后的P=0.144，差异无统计学意义（P0.05）；第1天和第5天，第1天和第7天，第1天和第9天校正后的P0.001，差异有统计学意义（P0.05）；第3天和第5天（P=0.031），第3天和第7天（P0.001），第3天和第9天（P0.001）校正后差异有统计学意义（P0.05），见图1、表2。不同储存天数SNHG9临床输血与检验2023年6月第25卷第3期313表达量根据性别和血型分析数据，差异无统计学意义（P0.05）。表1 机采血小板捐献者基本信息和采集情况（s）性别例数年龄（岁）身高（cm）体重（kg）脉搏（次/min）脉压差（mmHg）血压（mmHg）血小板（109/L）血红蛋白（g/L）HCT（L/L）采集时长（min）pH血小板含量（1011个/袋）收缩压舒张压男223691726 7511836476125107872545215290.450.0274146.90.12.690.28女104011 165461885840411857862683913190.400.0279157.00.12.890.37合计323710 1707 7112847456123978725849146130.430.0376157.00.12.750.32注：32名献血者中20名为首次捐献机采血小板，7名累计捐献血小板超过10次，20名在捐献血小板间隙期有全血捐献史。表2 机采血小板不同储存时间（1、3、5、7、9 d）SNHG9表达量qRT-PCR检测数据分析天数（d）中位数（P25,P75）k-w秩和检验HP1 0.87（0.54,1.20）93.0730.0013 2.05（1.08,3.07）5 6.57（3.07,9.41）*716.10（6.44,22.01）*919.04（7.58,30.32）*注：*与1 d相比，P0.001；倍数变化被标准化为-actin，并使用2-CT方法进行计算。讨 论LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达水平9-12。随着生物信息学和分子生物学技术（RNA-seq、芯片、RNAi、RIP等）不断应用于lncRNA的研究中，越来越多的研究证实lncRNA具有复杂的生物学功能，lncRNA的不当表达可能导致疾病的发生10-11，13。目前认为储存血小板中miRNAs的差异表达与不同储存时间、储存条件造成的血小板激活有密切关系。同属于血小板中大量存在的非编码RNA，lncRNA作为研究血小板的新兴关注点，与miRNA相比，其在PSL中作用的研究鲜少有报道，目前仅限于表达谱分析。有学者通过对血小板浓缩液RNA测序，共检测到2 923个lncRNAs，其中1 413个lncRNAs的表达水平变化是明显的，42种的水平上升，28种的水平下降14。国内学者通过芯片研究发现有大量的lncRNAs存在于血小板中，其表达量随着血小板储存时间的延长而呈现或增高或降低不同的变化趋势，进一步分析表明部分变化的lncRNAs与血小板聚集、激活、内吞等生理过程密切相关，随着血小板生理状态的变化而改变，并且在PSL中发挥作用15。LncRNA SNHG9被证实在人类多种器官肿瘤的发生发展、心脑血管疾病发生等方面具有举足轻重的作用。SNHG9通过调控多种信号通路轴促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞凋亡，是一种致癌基因，有望成为相关肿瘤的潜在的生物学标志物，来监测肿瘤患者的病情进展并评估预后16-18。有学者研究发现SNHG9是脂肪细胞分化过程中的一个重要元件，参与肥胖的发展，其对局部或/和全身炎症和应激反应有促发作用，可以通过抑制炎症和凋亡来预防肥胖患者的内皮功能障碍，从而影响心脑血管疾病的发生发展进程19。SNHG9可能通过调节信号传导通路促进正常甲状腺上皮细胞凋亡20。SNHG9通过调控miRNA抑制软骨细胞凋亡21。基于SHNG9已被证实对多种细胞凋亡有影响，注：*P0.05，内参基因为-actin，SNHG9相对表达量使用2-CT方法进行计算。图1 伴随机采血小板样本储存时间延长SNHG9表达量qRT-PCR检测结果 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3314因此血小板样本方面SNHG9表达量变化亦可能直接反映血小板储存期间凋亡的发生，有可能通过调控信号通路或者编码蛋白质的mRNA来作用于PSL。国内有学者发现，22振荡保存血小板伴随储存时间延长，pH值明显降低，乳酸和乳酸脱氢酶明显增高，血小板聚集率降低且均处于晚期高度活化状态22-23。本研究所选样本为32份正常机采血小板，通过检测样本在（222）保存过程中SHNG9表达量，SNHG9的表达水平变化随储存时间延长而增加，其变化趋势可能与血小板聚集、激活等生理过程相关，进而在PSL中发挥作用。SNHG9有可能作为潜在的生物标志物，直观反映PSL的发生发展趋势，为研究PSL开辟一条新的路径。综上所述，本实验首次发现正常机采血小板中lncRNA SHNG9表达量伴随储存时间延长的变化趋势，这为进一步研究SHNG9在PSL中的作用及意义奠定了基础。但是目前实验数据还过于单薄，后期还需要继续扩大样本量，完善更多实验项目来验证这一方向的可行性，如果有可能选取患者临床机采血小板治疗后检测指标做对照会更有说服力。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 RONDINA M T,WEYRICH A S.Regulation of the genetic code in megakaryocytes and plateletsJ.J Thromb Haemost,2015,13 Suppl 1(1):S26-S32.2 SHRIVASTAVA M.The platelet storage lesionJ.Transfus Apher Sci,2009,41(2):105-113.3 PONTES T B,MOREIRA-NUNES C D,MAUS J H,et al.The miRNA profile of platelets stored in a blood bank and its relation to cellular damage from storageJ.PLoS One,2015,10(6):e0129399.4 MAUS J H D S,MOREIRA-NUNES C F A,PONTES T B,et al.Differential expression profile of microRNAs during prolonged 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adipose-derived stem cells based on co-expression and ceRNA network analysesJ.Peer J,2019,7(9):7544-7562.20 WEN D,LIU W L,LU Z W,et al.SNHG9,a papillary thyroid cancer cell exosome-enriched lncRNA,inhibits cell autophagy and promotes cell apoptosis of normal thyroid epithelial cell nthy-ori-3 through YBOX3/P21 pathwayJ.Front Oncol,2021,11:647034.21 ZHANG H F,LI J L,SHAO W G,et al.LncRNA SNHG9 is downregulated in osteoarthritis and inhibits chondrocyte apoptosis by downregulating miR-34a through methylationJ.BMC Musculoskelet Disord,2020,21(1):511.临床输血与检验2023年6月第25卷第3期31522 杨江存,高英,孙杨,等.4冷藏保存血小板功能变化J.中国输血杂志,2017,30(6):553-557.23 杨江存,袁军,孙杨,等.4冷藏保存血小板的代谢变化J.中国输血杂志,2017,30(6):558-562.（收稿日期：2023-03-18）（本文编辑：王慧茹）论著改良法在制备冰冻红细胞技术上的应用研究刘慧 卓海龙 王道琳 陈婷婷 骆群 【摘要】目的 改良制备冰冻红细胞的甘油化过程，并对洗涤后的产品进行质量检测及分析评价。方法 随机抽取本站4保存7 d内红细胞悬液（1 U）标本20份，随机分为两组，实验组在甘油化过程中，用等渗于生理盐水的0.25 mol/L的甘氨酸溶液，将57%的复方甘油试剂稀释至40%的甘油溶液，将甘油浓度降低，其他过程不变，对照组在甘油化过程中加入57%复方甘油试剂，将两组制备成冰冻红细胞，置于80冰箱内保存，保存1个月后取出解冻去甘油化，比较两组冰冻解冻去甘油红细胞的质量指标，并进行分析评价。结果 两组的游离血红蛋白，甘油残余量等指标均符合全血及成分血质量要求（GB184692012），且实验组的游离血红蛋白（0.600.05）、甘油残余量（0.560.23）、红细胞内的甘油总量（0.820.05）、溶血率（0.330.10）与对照组相比显著下降，有统计学差异（P0.05），实验组的三磷酸腺苷ATP（5.340.35）、2,3-DPG（538.4059.96）与对照组相比显著升高，有统计学差异（P0.05），实验组的红细胞回收率（86.92.18）与对照组相比没有明显差异（P0.05），实验组的红细胞渗透脆性实验，开始溶血时的氯化钠浓度（4.280.33）与对照组相比有显著性差异（P0.05），完全溶血时的氯化钠浓度（3.080.27）与对照组相比没有明显差异（P0.05）。结论 在制备冰冻红细胞的甘油化过程中，用甘氨酸溶液稀释后的40%浓度的甘油作为冰冻保护剂制备的冰冻红细胞，保存1个月后解冻去甘油后的红细胞产品与对照组相比，甘油残余量、红细胞内甘油总量、上清游离血红蛋白含量与溶血率都显著降低，三磷酸腺苷ATP与2,3-DPG水平显著升高，提高了冰冻红细胞的产品质量。【关键词】甘氨酸 甘油化过程 冰冻红细胞 【中图分类号】R331.1+41 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0315-05An Improved Methods in the Preparation of Frozen Red Blood Cells LIU Hui,ZHUO Hailong,WANG Daolin,et al.The Fifth Medical Center of the General Hospital of the Peoples Liberation Army,Beijing 100071【Abstract】Objective The glycerolization process for preparing frozen red blood cells(RBCs)was improved,and washed RBCs were tested and analyzed.Methods Twenty samples of suspended red blood cells(SRBCs)(one unit)stored at 4 for 7 days were randomly divided into two groups.In the process of glycerolization,57%compound glycerol reagent was diluted to 40%glycerol solution with 0.25 mol/L glycine solution in isotonic saline,and the glycerol concentration was reduced,while other processes remained unchanged in the experimental group;57%compound glycerol reagent was adde